专利名称：一种葛根有效组分的制备方法
技术领域：
本发明涉及天然药物的分离，具体的说是葛根有效组分提取制备方法，该组分的主要的活性成分是葛根素，3’-甲氧基葛根素和葛根素芹菜糖苷三个化合物。
背景技术：
冠心病和心绞痛一直是困扰全世界人们的一大顽疾，已成为人类生命的“第一大杀手”。就全世界而言，半个世界以来，冠心病已成为威胁人类健康最严重的疾病之一，是美国和某些工业化国家的主要死因。据世界卫生组织(WTO)1990年公布的资料，美国总死亡人数中，有24.7％死于冠心病，北爱尔兰冠心病病死率居世界首位，为536/10万；日本最低，为41/10万。我国根据1993年结束的16省市500万人口的统计资料，冠心病发病率和病死率低于国际水平。但发病率和死亡率呈上升趋势。可见冠心病已成为全世界的公害，美国人称冠心病为“时代的瘟疫”。冠心病在国内平均患病率为6.49％，并随年龄增长而增高，因而，冠心病是中老年人最常见的一种心血管病。
中药葛根为豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi或甘葛藤(pueraria thomsonii Benth)的干燥根。习称野葛。始载于《神农本草经》，具有发表解肌、开阳透疹、解热生津、升阳止泻等作用，中医主要用于外感发热头痛、颈背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢、泄泻及高血压颈项强痛[中华人民共和国药典，2005年版一部]，主产于湖南、河南、广东、浙江、四川等地。葛根的主要成分是异黄酮类化合物，其次还有皂甙，芳香甙类化合物等等。目前，葛根中常见的黄酮类化合物主要有葛根素，大豆苷，大豆苷元，芒柄花素和大豆苷元双糖苷。药理研究表明，葛根具有抗氧化，调节心脑血管循环，解痉、降血压等多种药理活性(赖祥林，唐冰，中国中药杂志，2002，28(3)105-107；刘玉兰等沈阳药学院学报，1991，8(2)105-108；Xu X etc.，Planta Med.2004，70627-631)同时葛根素还具有抗心肌缺血、促进冠状脉侧枝循环的开放和形成，保护缺血心肌，并能对急性心肌梗塞患者异常反应的内分泌系统紊乱、血浆ET及肾素血管紧张等有重要调节作用(宋蓓等，中国现代临床医学，2006，5(1)46-47)。
葛根素葡萄糖注射液是一种已经商品化并用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、视网膜动、静脉阻塞、突发性耳聋及缺血性脑血管病、小儿病毒性心肌炎、糖尿病等相关疾病中药制剂，其主要成分是从葛根中提取分离得到葛根素。然而由于葛根素弱的水溶性的特点，极大的限制了葛根素活性作用的发挥，因此通常加入3’-甲氧基葛根素来增加葛根素的溶解性度(赵晓莉等，中国中药杂志，2000，25(7)，413-415)，这样，使样品的处理复杂化。
发明内容
本发明的目的是提供一种重现性好，可以大规模生产的葛根有效组分的制备工艺，其中主要的活性成分为葛根素，3’-甲氧基葛根素和葛根素芹菜糖苷三个主要的化合物(图1)。以满足大规模工业生产的需要。本发明提供的方法获得葛根有效组分，通过高效液相色谱分析，主要成分得含量达到93.8％葛根素的含量为56.43％，3’-甲氧基葛根素的含量为20.26％和葛根素芹菜糖苷的含量为17.10％. 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为1)提取称取葛根原药材，加入其重量2-6倍的水煎煮提取，重复上述煎煮提取过程2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10的浸膏，得葛根水提组分； 2)醇沉于浸膏中加入乙醇，使乙醇的体积浓度达到50-70％，室温静置12-24小时，过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩，滤液浓缩至原体积的1/4-1/7；再加入乙醇，使乙醇体积浓度达到75-80％，室温静置12-24小时，过滤，滤渣弃去，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，得醇沉组分； 3)非极性大孔树脂分离将醇沉组分上样于非极性大孔树脂柱，醇沉组分的上样量与分离材料非极性大孔树脂柱的体积比为1∶100-500，依次采用流动相体积浓度0-20％的乙醇和40-70％乙醇循环洗脱二次，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；洗脱液浓缩，浓缩至固含量为0.6-0.8克/毫升，过0.2-0.4微米滤膜，得葛根大孔树脂分离组分； 4)工业色谱柱分离以粒径5-20微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，将葛根大孔树脂分离组分进行梯度洗脱，甲醇的体积浓度从0-100％变化，收集目标组分，干燥处理即为葛根有效组分；将样品进行高效液相分析确定主要成分的含量，其主要成分为葛根素，3’-甲氧基葛根素和葛根素芹菜糖苷。
葛根素的结构式
3’-甲氧基-葛根素的结构式
葛根素芹菜糖苷的结构式
所述色谱柱效为5000-20000塔板/米，色谱柱长为200毫米-600毫米，色谱柱内径为20毫米-300毫米。所述收集目标组分是指收集甲醇的体积浓度从28.0-31.0％变化的目标组分。
本发明的优点 1.主要成分的含量高。由于本发明采用了最先进的工业色谱分离制备技术，色谱填料为高分离能力的ODS(C18健合固定相)分离材料，利用工业色谱的高分离能力，可以保证主要成分的纯度达到90％以上。
2.重现性好。本发明利用工业色谱系统和ODS稳定的性能，可以保证分离制备的重现性和稳定性。
3.周期短。本发明从原药材的粉碎提取到制备得到葛根有效组分的产品，只需要10天的时间。
4.有机残留低。由于本发明摒弃了传统工艺中溶剂萃取、硅胶柱层析等工艺，采用了有机溶剂使用量较少的工业色谱方法，而且最终产品采用干燥处理，所以最终产品的有机溶剂残留特别小。
5.能够实现大规模工业生产。本发明所采用工艺非常容易实现标准化，自动化，适于进行产业化大规模生产。
总之，本发明制备的葛根有效组分中葛根素的含量＞50％，有效的去除糖蛋白、多糖、氨基酸等杂质，提高了主要活性成分的含量。制备过程重复性高和可操作性好，易于实现标准化和产业化，同时对于葛根药材的质量控制也有一定的指导意义。
图1本发明实施例1工业色谱制备葛根有效组分的制备色谱图；其中a、b、c、d为实例1条件下连续4次进样的制备色谱图。
图2为本发明中葛根有效组分的HPLC色谱图(λ＝254nm)。
具体实施例方式 实施例1葛根有效组分的制备方法 将葛根原药材粉碎，定量称取20千克，置于200升提取罐中，加入120升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入60升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至4000毫升，得到葛根水提取组分。在浸膏中加入4340毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至1000毫升，在浓缩液中加入5400毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到葛根醇沉组分4000毫升。
在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂60L，将葛根醇沉组分进样大孔树脂层析柱。首先用4倍柱体积240L 10％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用4倍柱体积70％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.75克/毫升，过0.22微米滤膜，得到葛根大孔树脂组分600毫升。
工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为310nm(可为230-280nm)，流速200毫升/分钟，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(20％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取葛根大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集25分钟至30分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分(见图1)。将收集得到的切割组分，合并，旋转蒸发浓缩至20毫升，再通过室温旋转干燥得到葛根有效组分产品4.4克，经高效液相色谱分析(见图2)，其有效组分的总含量＞93％。
表1实施例1葛根有效组分的工业色谱制备梯度设置表 实施例2 将葛根原药材粉碎，定量称取10千克，置于100升提取罐中，加入60升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入60升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至2000毫升，得到葛根水提取组分。在浸膏中加入2170毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至500毫升，在浓缩液中加入2700毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到葛根醇沉组分2000毫升。
在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂30L，将葛根醇沉组分进样至大孔树脂层析柱。首先用4倍柱体积120L10％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用4倍柱体积120L 70％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.76克/毫升，过0.22微米滤膜，得到葛根大孔树脂组分250毫升。
工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为310nm(可为250-310nm)，流速200毫升/分钟，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(20％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取葛根大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集25分钟至30分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分(其谱图与图1相同)。将收集得到的切割组分，合并，旋转蒸发浓缩至20毫升，再通过室温旋转干燥得到葛根有效组分产品2.2克，经高效液相色谱分析，其有效组分的总含量＞90％。
实施例3 将葛根原药材粉碎，定量称取4千克，置于50升提取罐中，加入24升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入24升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至800毫升，得到葛根水提取组分。在浸膏中加入868毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至200毫升，在浓缩液中加入1080毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到葛根醇沉组分800毫升。
在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂3L，将葛根醇沉组分进样至大孔树脂层析柱。首先用4倍柱体积12 L10％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用4倍柱体积70％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.76克/毫升，过0.22微米滤膜，得到葛根大孔树脂组分100毫升。
工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为310nm(可为250-310nm)，流速200毫升/分钟，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(20％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取葛根大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集25分钟至30分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分(其谱图与图1相同)。将收集得到的切割组分，合并，旋转蒸发浓缩至20毫升，再通过室温旋转干燥得到葛根有效组分产品0.88克，经高效液相色谱分析，其有效组分的总含量＞92％。
实施例4 将葛根原药材粉碎，定量称取2千克，置于20升烧瓶中，加入12升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入12升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓缩至400毫升，得到葛根水提取组分。在浸膏中加入434毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至100毫升，在浓缩液中加入540毫升95％乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓缩至无醇味，浓缩液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到葛根醇沉组分400毫升。
在大孔树脂层析系统中装入处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂2L，将葛根醇沉组分进样至大孔树脂层析柱。首先用4倍柱体积8L 10％乙醇洗脱柱体，洗脱液弃去，再用4倍柱体积70％乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓缩至浓度为0.75克/毫升，过0.22微米滤膜，得到葛根大孔树脂组分50毫升。
工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的C18键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为310nm(可为250-310nm)，流速200毫升/分钟，设定洗脱梯度(见表1)，初始流动相(20％甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取葛根大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集25分钟至30分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分(其谱图与图1相同)。将收集得到的切割组分，合并，旋转蒸发浓缩至20毫升，再通过室温旋转干燥得到葛根有效组分产品0.44克，经高效液相色谱分析，其有效组分的总含量＞91％。
权利要求
1.一种葛根有效组分的制备方法，特征在于
1)提取称取葛根原药材，加入其重量2-6倍的水煎煮提取，重复上述煎煮提取过程2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓缩至相对密度为0.9-1.10的浸膏，得葛根水提组分；
2)醇沉于浸膏中加入乙醇，使乙醇的体积浓度达到50-70％，室温静置12-24小时，过滤，取滤液浓缩，滤液浓缩至原体积的1/4-1/7；再加入乙醇，使乙醇体积浓度达到75-80％，室温静置12-24小时，过滤，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，得醇沉组分；
3)非极性大孔树脂分离将醇沉组分上样于非极性大孔树脂柱，醇沉组分的上样量与分离材料非极性大孔树脂柱的体积比为1∶100-500，依次采用流动相体积浓度0-20％的乙醇和40-70％乙醇循环洗脱二次，每次洗脱的体积为3-6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；洗脱液浓缩，浓缩至固含量为0.6-0.8克/毫升，过0.2-0.4微米滤膜，得葛根大孔树脂分离组分；
4)工业色谱柱分离以粒径5-20微米的C18硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，将葛根大孔树脂分离组分进行梯度洗脱，甲醇的体积浓度从0-100％变化，收集目标组分，干燥处理即为葛根有效组分，其主要成分为葛根素，3’-甲氧基葛根素和葛根素芹菜糖苷。
2.根据权利要求1所述葛根有效组分的分离制备方法，其特征在于所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。
3.根据权利要求1所述葛根有效组分的分离制备方法，其特征在于所述色谱柱长为200毫米-600毫米，色谱柱内径为20毫米-300毫米。
4.根据权利要求1所述葛根有效组分的分离制备方法，其特征在于所述收集目标组分是指收集甲醇的体积浓度从28.0-31.0％变化的目标组分。
全文摘要
本发明提供了一种葛根有效组分的制备方法，将葛根药材粉碎后加水提取，先后经50％～80％乙醇醇沉，10000～25000Ram/min高速离心后，非极性大孔吸附树脂上样，乙醇/水洗脱，收集洗脱液并浓缩干燥后得葛根大孔树脂组分，再经工业制备色谱柱分离，甲醇水作流动相，即得葛根有效组分。其主要的活性成分是葛根素，3′-甲氧基葛根素和葛根素芹菜糖苷，其总含量达到93.8％。本发明制备的葛根有效组分中葛根素的含量＞50％，有效的去除糖蛋白、多糖、氨基酸等杂质，提高了主要活性成分的含量。制备过程重复性高和可操作性好，易于实现标准化和产业化，同时对于葛根药材的质量控制也有一定的指导意义。
文档编号A61K36/48GK101318955SQ200710011630
公开日2008年12月10日 申请日期2007年6月8日 优先权日2007年6月8日
发明者梁鑫淼, 孙衍国, 丰加涛, 薛兴亚, 青 徐 申请人:中国科学院大连化学物理研究所