专利名称：：一种葛根芩连药物的有效成分的检测方法
技术领域：
：本发明涉及中药的质量控制方法，具体涉及葛根芩连药物的质量控制方法。技术背景葛根芩连汤原载于东汉张仲景《伤寒论》中，由葛根、黄芩、黄连、甘草4味药用水煎煮制成，为"解表清里之剂"，具有解表清里之功，主治身热下利，胸脘烦热口中作渴，喘而汗出的病证。近年来国内外医学家通过实验研究证明葛根芩连汤具有解热、抗菌、抗病毒、解痉、抑制胃肠运动、抗缺氧、抗心律失常、增强机体免疫功能等药理作用，是临床上用于治疗菌痢、肠伤寒、急慢性胃肠炎、婴幼儿腹泻等疾病的常用方剂。近年来国内已开发出了葛根芩连片、葛根芩连微丸、颗粒剂、散剂、微粉、葛根芩连胶囊以及葛根吝连合剂、口服液等剂型。葛根、黄芩、黄连、甘草品种较多、产地、采收季节等均会影响中药材的质量，制备的工艺种类较多，制成的制剂难于确保其疗效的一致性。因此，有必要对葛根芩连制剂有效成分的组成和含量进行严格的质量控制。在现阶段已知葛根芩连相关药味含有葛根素、大豆苷、大豆苷元、芒柄花苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、药根碱、甘草苷、甘草酸、甘草次酸等多种成分，但是目前常用的葛根芩连药物的质量控制方法大多数是分别检测药物中的各种成分，如《中国药典》记载的葛根芩连片、葛根芩连微丸的质量控制方法是采用高效液相方法(HPLC)以葛根素和黄芩苷为指标分别进行含量测定，对其质量进行控制。采用高效液相色谱分别检测葛根芩连药物中的有效成分的组成和含量，可以准确地检测出葛根苳连药物中单成分的含量，但是如果每个有效成分都分别用高效液相色谱来检测，工作量将十分大。因此，已有不少学者开始研究葛根芩连药物多成分同时测定的方法，陈丽红等人采用反相高效液相色谱法-二极管阵列检测器，以甲醇-水(内含1%三乙胺、1%乙酸，用磷酸调pH至3)为流动相，对中药复方制剂葛根芩连配方颗粒中3种主要标志性成分的含量同时分析测定，并采用相同的流动相对其指纹图谱进行研究。实验结果显示，3种主要标志性成分葛根素、黄芩苷和小檗碱在含量分析测定条件下，各成分分离良好，相关系数均为0.9999，线性范围分别为0.0421.05吗、0.133.25吗和0.0601.50吗，加样回收率在95%106%之间；在指纹图谱研究中，以黄芩苷为参照物峰，标定了32个共有峰，分析的ll批葛根苳连配方颗粒与共有模式之间具有良好的相似性，相似度均在0.9以上(陈丽红等.葛根芩连配方颗粒标志性成分含量分析及指纹图谱研究。分析化学2006年第8期1109-1112)。龚湛文等人采用HPLC以乙腈一水(含0.5。/。KH2PO4)作为流动相系统可同时鉴别14种成分，并测定其中黄芩苷、葛根素2个成分的含量(龚湛文，葛根吝连抗病毒有效物质基础研究，北京中医药大学硕士学位论文，2003年5月)。目前尚未有能同时检测葛根吝连药物中6种成分含量的检测方法。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种能同时对葛根芩制剂6种成分定量检测的高效液相色谱方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是一种葛根芩连药物的有效成分的检测方法，该方法是利用多波长高效液相色谱法检测葛根芩连中的各种有效成分，具体的步骤是(1)配制待检进样液取葛根芩连药物用溶剂配制成含药物0.2mg2mg/ml的待检进样液；配制混合对照品溶液取葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀和小檗碱混合后用溶剂配制成各成分浓度均为1200jxg/ml的对照品溶液；然后将待检进样液和混合对照品溶液分别按以下方法进行高效液相色谱检测按进样量为120^1对以十八烷基硅垸键合硅胶为填料的色谱柱进样，控制柱温1040°C,接着用由A相和B相组成的流动相以0.31.5ml/ii]in的流速并按表1的程序进行梯度洗脱，同时采用检测波长为248256nm、274285nm和344350nm的紫外光检测洗脱液，获得被检药物以及对照品的高效液相色谱图谱；表1<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(2)所得混合对照品溶液的高效液相图谱中左起第2锋至第7峰依次为葛根素、大豆苷、黄苳苷、汉黄荟苷、巴马汀和小檗碱；将被检药物的高效液相图谱与对照品溶液所得的图谱比较，与混合对照品溶液图谱中相应成分的保留时间相同的峰即是与该成分相同物质的特征峰，并根据峰面积按外标法计算含量；上述步骤中，配制待检进样液和混合对照品溶液所用的溶剂是1095%乙醇或10100%甲醇，或者是与流动相相同的溶剂；溶解方式为超声、回流提取等中药常用提取、纯化方式。所述流动相的A相是由三乙胺和0.01mol/L0.lmol/L醋酸胺溶液按以下方法制成在0.01mol/L0.lmol/L醋酸胺溶液加入溶液体积0.1%1%的三乙胺，用冰醋酸调pH2.56。所述流动相的B相是乙腈。本发明所述的葛根芩连药物可以是葛根芩连提取物或者各种复方制剂，其原料药为传统葛根芩连汤的药方葛根1524重量份、黄芩9重量份、黄连9重量份、甘草6重量份，其中所述的提取物可以是各种方法制备获得的葛根芩连提取物。本发明所述的待检进样液的可以采用下述方法配制当葛根芩连药物为固态时，精密称取适量固体药物，研细，然后用溶剂溶解并采用常用的中药提取纯化方法与处理，最后用溶剂定容至浓度为含固体药物0.2mg/ml5mg/ml，过滤，即可；当葛根芩连药物为液态时，精密量取适量液体药物，然后用溶剂溶解并采用常用的中药提取纯化方法处理，最后用溶剂定容至浓度为含蒸干药物0.2mg/ml5mg/ml，过滤，即可。本发明方法中，所述流动相的A相的组成最好是由0.4%的三乙胺和99.6%的0.02mol/L醋酸胺组成，其制备方法是在0.02mol/L醋酸胺溶液中加入溶液体积0.4M的三乙胺，用冰醋酸调pH44.8。本发明方法中，所述的流速最好是0.7mlTnirT'。本发明方法中，梯度洗脱时的较佳程序如表2所示。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明方法中，梯度洗脱时最佳程序如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>本发明方法中，紫外检测波长最好是250nm、280nm和346nm。本发明所述的对照品图谱中的各峰的归属是通过以下方法确定的分别配制葛根素、大豆苷、黄苳苷、汉黄苳苷、巴马汀和小檗碱的标准品溶液，然后在同一色谱条件下分别制备各单独标准品和所述混合对照品的高效液相图谱，根据各单独标准品图谱中相应成分的峰的保留时间确定混合对照品图谱中各峰的归属。本发明人经过多次重复试验，发现在本发明所述流动相中混合对照品中各成分有固定的出峰顺序，即左起第2峰至第7峰依次为葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀和小檗碱，因此在使用本发明方法时，可根据此规律确定混合对照品图谱中各峰的归属，不需要再制备各标准品的图谱，有利于节省时间和试剂。本发明方法采用高效液相图谱方法对葛根芩连复方药物进行定性定量检测，根据葛根芩连药物的有效成分的特性，流动相选择醋酸胺溶液、三乙胺、冰醋酸和乙腈，并按一定程序连续改变它们之间的比例进行梯度洗脱，达到精确分离复方药物中多成分的目的，同时对洗脱成分选择检测波长，可进一步提高检测的精确度。采用本发明方法，可以同时对葛根芩连方的有效成分中的葛根素、大豆苷、黄芩苷、巴马汀、小檗碱、汉黄芩苷6种成分进行定量检测，较全面考察葛根芩连药物中物质群的主要有效成分组成和比例变化情况，同时还减少了分析步骤以及样品前处理环节可能引起的成分变化和测定误差，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的优点。图1是实施例1所述的检测方法中混合对照品的高效液相图谱。图2是实施例1所述的检测方法检测葛根芩连提取物的高效液相图谱。具体实施方式例ll.仪器与试药仪器:AgilentllOO高效液相色谱仪(在线脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；AgilentChemStation色谱数据工作站；AB250D十万分之一天平(美国DENVER公司)、Milli-pore-Q超纯水制备仪。对照品葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀和小檗碱。待检样品待检样品为葛根芩连片剂，按《中国药典》一部2005年版葛根吝连片剂项下自制。其他试剂乙腈(色谱纯)，醋酸胺、冰乙酸(分析纯)。2、方法(1)混合对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀、小檗碱对照品适量，以甲醇溶解，定容，摇匀，滤膜过滤，制得含量为20(^g/ml对照品溶液。(2)制备样品溶液精密称取葛根芩连片剂适量，以10%乙醇5(TC加热超声使其完全溶解，制得浓度为5mg/ml的样品溶液，摇匀，微孔滤膜过滤。(3)色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，取对照样品溶液20^1进样，流速1.5ml/min,按表4的程序进行梯度洗脱，并采用检测波长为248nm、274服和344nm紫外光多波长检测，得对照品的高效液相图谱；流动相A的制备方法是在0.04mol/L醋酸胺溶液中加入体积百分比为0.W的三乙胺，用冰醋酸调pH2.5;流动相B是乙腈。按同上方法制备待检样品的高效液相图谱。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、结果(1)对照品的HPLC图谱如图l所示，其中l号峰为葛根素，2号峰为大豆苷，3号峰为黄零苷，4号峰为汉黄芩苷，5号峰为巴马汀，6号峰为小檗碱。(2)待测样品的HPLC图谱如图2所示，与对照品图谱比较的保留时间和峰面积可知1号峰为葛根素的特征峰，2号峰为大豆苷的特征峰，3号峰为黄芩苷的特征峰，4号峰为汉黄吝苷的特征峰，5号峰为巴马汀的特征峰，6号峰为小檗碱的特征峰；该药物中葛根素的含量为2,lmg/g，大豆苷的含量为0.2mg/g，黄芩苷的含量为2.4mg/g，汉黄芩苷的含量为0.1mg/g,巴马汀的含量为1.7mg/g，盐酸小檗碱的含量为1.9mg/g。例21、检测用仪器、试剂与实施例l相同；待检样品为葛根芩连微丸，按《中国药典》一部2005年版葛根芩连微丸项下自制。2、方法(1)对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄零苷、巴马汀、小檗碱对照品适量，以甲醇溶解，定容，摇匀，滤膜过滤，制得含量为lng/ml对照品溶液。(2)制备样品溶液精密称取葛根芩连微丸适量，以100%甲醇IO(TC加热超声使其完全溶解，制得浓度为0.2mg/ml的样品溶液，摇匀，微孔滤膜过滤。(3)色谱柱以十八垸基硅垸键合硅胶为填料，进样量为1^1，流速0.3ml/min，按表6的程序进行梯度洗脱，并采用检测波长为256nm、285nm和350nm紫外光多波长检测，得对照品的高效液相图谱；流动相A的制备方法是在0.01mol/L醋酸胺溶液中加入体积百分比为1%的三乙胺，用冰醋酸调pH6;流动相B是乙腈；按同上方法制备待检样品的高效液相图谱。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>3、结果将待测样品的HPLC图谱与对照品图谱比较，测得葛根素含量为2.3mg/g;大豆苷含量为0.3mg/g;黄吝苷含量为2.4mg/g;汉黄芩苷含量为(Umg/g;巴马汀含量为1.5mg/g;盐酸小檗碱含量为2.Omg/g。例31、检测用仪器、试剂与实施例1相同；待检样品葛根芩连提取物按《中国药典》一部2005年版葛根苳连微丸项下制备取葛根芩连处方中黄芩、黄连用流浸膏与浸膏剂项下的渗漉法(附录IO)，分别用50%乙醇作溶剂，浸渍24小时后进行渗漉，收集漉液，回收乙醇，适当浓縮；葛根先煎30分钟，再加入黄芩、黄连药渣及炙甘草，继续煎煮两次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至适量，加入上述浓缩液，继续浓缩至稠膏，低温减压干燥，粉碎成最细粉。2、方法(1)对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀、小檗碱对照品适量，以甲醇溶解，定容，摇匀，滤膜过滤，制得葛根素8(^g/ml、大豆苷30ng/ml、黄芩苷60ng/ml、汉黄芩苷20pg/ml、小檗碱60吗/ml、巴马汀30吗/ml的对照品溶液。(2)制备样品溶液精密称取葛根芩连提取物适量，以30%乙醇5(TC加热超声使其完全溶解，定容，制得浓度为lmg/ml的样品溶液，摇匀，微孔滤膜过滤。(3)色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，进样量为10W，流速0.7ml/min，按表6的程序进行梯度洗脱，同时用250nm、280nm和346nm的紫外多波长检测，得对照品的高效液相图谱；流动相A的制备方法是在0.02mol/L醋酸胺溶液中加入体积百分比为0.4%的三乙胺，用冰醋酸调pH4;流动相B是乙腈；按同上方法制备待检样品的高效液相图谱。表6时间(min)流动相中A相与B相的配比A(%)Ba)080201080202070303560404555455545556035653、结果将待测样品的HPLC图与对照品图谱比较，测得待测样品中葛根素含量为2.5mg/g;大豆苷含量为0.2mg/g;黄芩苷含量为2.7mg/g;汉黄芩苷含量为0.2mg/g;巴马汀含量为1.7mg/g;盐酸小檗碱含量为2.3mg/g。例4(1)对照品溶液的制备精密称取葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀、小檗碱对照品适量，以流动相溶液(其中流动相A的含量为80呢，流动相B的含量为2(^，流动相A和B的组成制备参见步骤3)溶解，定容，摇匀，滤膜过滤，制得葛根素8(^g/ml、大豆苷30吗/ml、黄芩苷60昭/ml、汉黄芩苷20吗/ml、小檗碱60ng/ml、巴马汀30ng/ml的对照品溶液。(2)制备待检样品的进样液精密称取葛根芩连微丸适量，溶于流动相溶液(其中流动相A的含量为80%，流动相B的含量为20%，流动相A和B的组成和制备参见步骤3)，在80°C加热超声使其完全溶解，制得浓度为0.2mg/ml的样品溶液，摇匀，微孔滤膜过滤。(3)色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，进样量为5^1，流速0.7ml/min，按表7的程序进行梯度洗脱，并采用检测波长为250nm、280nm和346nm紫外光多波长检测，得对照品的高效液相图谱；流动相A的制备方法是在0.02mol/L醋酸胺溶液中加入体积百分比为0.4%的三乙胺，用冰醋酸调pH4;流动相B是乙腈；按同上方法制备待检样品的高效液相图谱。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>3、结果将待测样品的HPLC图谱与对照品图谱比较，测得葛根素含量为2.2mg/g;大豆苷含量为0.4mg/g;黄芩苷含量为2.6rag/g;汉黄芩苷含量为0.2mg/g;巴马汀含量为1.7mg/g;盐酸小檗碱含量为2.2mg/g。权利要求1.一种葛根芩连药物的有效成分的检测方法，该方法由以下步骤组成(1)配制待检进样液取葛根芩连药物用溶剂配制成含药物0.2mg～2mg/ml的待检进样液；配制混合对照品溶液取葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀和小檗碱混合后用溶剂配制成各成分浓度为1～200μg/ml的对照品溶液；然后将待检进样液和混合对照品溶液分别按以下方法进行高效液相色谱检测按进样量为1～20μl对以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱进样，控制柱温10～40℃，接着用由A相和B相组成的流动相以0.3～1.5ml/min的流速并按表1的程序进行梯度洗脱，同时采用检测波长为248～256nm、274～285nm和344～350nm的紫外光检测洗脱液，获得被检药物以及对照品的高效液相色谱图谱；表1<tablesid="tabl0001"num="0001">id="icf0001"file="S2008100282182C00011.gif"wi="102"he="52"top="114"left="54"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/></tables>(2)所得混合对照品溶液的高效液相图谱中左起第2锋至第7峰依次为葛根素、大豆苷、黄芩苷、汉黄芩苷、巴马汀和小檗碱；将被检药物的高效液相图谱与对照品溶液所得的图谱比较，与混合对照品溶液图谱中相应成分的保留时间相同的峰即是与该成分相同物质的特征峰，并根据峰面积按外标法计算含量；上述步骤中，配制待检进样液或对照品溶液所用的溶剂是10～95％乙醇或10～100％甲醇，或者是与流动相相同的溶剂；所述流动相的A相是由三乙胺和0.01mol/L～0.1mol/L醋酸胺溶液按以下方法制成在0.01mol/L～0.1mol/L醋酸胺溶液加入溶液体积0.1％～1％的三乙胺，用冰醋酸调酸度至pH2.5～6；所述流动相的B相是乙腈。2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于用如表2所示程序进行梯度洗脱。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于用如表3所示的程序梯度洗脱。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>4、如权利要求13所述的检测方法，其特征在于所述的紫外光多波长检测的检测波长为250nm、280nm和346nm。5、根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于当葛根芩连药物为固态时，所述的待检进样液的采用下述方法配制精密称取适量固体药物，研细，然后用溶剂溶解并采用常用的中药提取纯化方法与处理，最后用溶剂定容至浓度为含固体药物0.2mg/ml5mgAi1，过滤，即可。6、根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于当葛根芩连药物为液态时，所述的待检进样液的采用下述方法配制精密量取适量液体制剂，然后用溶剂溶解并采用常用的中药提取纯化方法处理，最后用溶剂定容至浓度为含蒸干药物0.2mg/ml5mg/ml，过滤，即可。7、根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于所述的A相的制备方法是在0.02raol/L醋酸胺溶液中加入溶液体积0.4%的三乙胺，用冰醋酸调pH44.8。8、根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于所述的流速是0.7ml/min。9、根据权利要求13所述的检测方法，其特征在于所述的葛根芩连药物是由以下重量配比的原料药制备得到的提取物或成品制剂葛根1524份、甘草6份、黄芩9份、黄连9份。全文摘要本发明提供了一种利用高效液相色谱检测葛根芩连药物有效成份的方法，该方法由以下步骤组成首先配制待检进样液和混合对照品溶液，再分别按下述方法进行检测按进样量为1～20μl对以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱进样，控制柱温10～40℃，接着用由A相和B相组成的流动相以0.3～1.5ml/min的流速并按规定的程序进行梯度洗脱，同时采用多波长紫外光检测洗脱液，获得被检药物以及对照品的高效液相色谱图谱；最后将被检药物的高效液相图谱与对照品溶液所得的图谱比较，确定葛根芩连药物中的葛根素、大豆苷、汉黄芩苷、黄芩苷、巴马汀和小檗碱等6种有效成份及其含量。本发明方法，其中所述的A相为0.01～0.1mol/L的醋酸胺溶液，B相为乙腈。文档编号A61K36/718GK101278991SQ200810028218公开日2008年10月8日申请日期2008年5月22日优先权日2008年5月22日发明者宋丽军,罗佳波,谭晓梅申请人:南方医科大学