专利名称：半枝莲总黄酮注射液及其制备方法
技术领域：
本发明涉及临床以抑制血管再生为作用靶点的抗肿瘤药物及其制备 方法，属于医药技术领域。
技术背景在研究和开发新的抗肿瘤药物中，抗肿瘤血管再生药物的开发愈来愈 受到重视，肿瘤细胞具有很高的突变率，存在耐药性基因，而血管内皮细 胞的基因则比较稳定，突变率小，对药物产生耐药性小。另外，在成年人 体内， 一般不再有血管再生现象，用抗血管再生药物来治疗肿瘤一般不会 对人体产生很强烈的负面影响。因此，抗肿瘤血管再生药物成为最具潜力 的抗肿瘤药物。近几年来，国内外以抑制血管再生作抑制癌转移靶点的中医药研究近几年才刚刚起步，就研究药物而言，日本从1996年开始了部分实验， 见诸报道的有雷公藤、辛荑及四物汤。国内见诸报道的有人参皂甙Rg3、 槲皮素、大豆异黄酮、乌索酸、昆布多糖硫酸酯、姜黄素、白芨提取物、 灯盏细辛、云芝多糖[3]、去甲斑蟊素、丹参、榄香烯、莪术、郁金、、中药 苦豆子中提取的氧化苦参碱、白藜芦醇、槲皮素、蒲葵种子的水样提取液、 姬松茸、绿茶、朝鲜白头翁提取的去氧鬼臼脂素、熊果酸等，此外有消痔 灵、国产碘油为主制成乳剂药物，局部注射给药，破坏肿瘤血管，对鸡胚 尿嘉囊膜血管生长有抑制效应报道等。半枝莲别名并头草、狭叶寒信草，为唇形科黄芩属植物半枝莲 (Scutellaria barbate D.Don)的干燥全草，主要产于江苏、浙江、福建 等地。药性辛、苦、寒，归肺、肝、肾三经。具有清热解毒、散瘀活血之功效。有文献报道，半枝莲提取物对多种肿瘤细胞如S180、 W256、艾氏 腹水瘤等具有生长抑制作用。在临床上，半枝莲可治疗肝癌、肺癌、乳腺 癌、绒毛膜癌等。目前己经从半枝莲中分离出了一些化合物，主要是生物 碱和黄酮类，这些化合物表现出促进细胞免疫、抗病毒、解热、保肝、抗 肿瘤等作用。但是对于半枝莲抗肿瘤的药理作用的作用机理、作用方式、 有效部位和活性成分等方面未见报道。 发明内容本发明的目的就是要利用半枝莲提取物对多种肿瘤细胞具有生长抑 制作用，提供一种以抑制肿瘤血管再生为作用靶点的半枝莲总黄酮注射液 以及半枝莲总黄酮注射液的制备方法。本发明的第一个目的是这样实现的，半枝莲总黄酮注射液，其特征是 以半枝莲总黄酮为主要成份。本发明第二个目的技术方案是，制备半枝莲总黄酮注射液的方法，包括以下步骤2. 2. 1半枝莲总黄酮液的制备取半枝莲药材，用20。/() 5(m乙醇3(rC 5CrC浸透，以药材5 10倍 重量20% 50%乙醇50"回流提取1 2小时，提取液与与药渣压榨液合并， 过滤，滤液减压浓縮至含水量30% 50%，得湿浸膏。每克湿浸膏相当于 原药材l 2g，总黄酮含量为15% 20% (W/W);每克干浸膏相当于原药 材2 5g，干浸膏总黄酮含量为25% 35% (W/W);指标成分野黄芩苷含量 占总黄酮量的7% 12%。药渣用5 15倍重量0. 5%NaHC03 (pH8. 5)溶液提取1 2小时，提 取液与药渣压榨液合并，过滤，得滤液(滤液中总黄酮含量为0. 2% 1%，W/V)。湿浸膏滤液=1 : 5 3 : 5混合，得半枝莲总黄酮液(总黄酮含量为 2% 100/0， W/W)。 2. 2. 2半枝莲注射液的制备取半枝莲总黄酮液，用注射用水稀释至pH7，静置3 5h，过滤；滤液 IOO'C夹层锅水浴加热30min， 4°C，放置24h 48h，滤过，滤液用注射 用水调含量至每毫升含半枝莲总黄酮20mg 30 mg (野黄芩苷的含量5% 8%);再经澄明度、色泽、pH值、蛋白质、鞣质、重金属、砷盐、草酸盐、 钾离子等检查合格后，调等渗等张，灌装在2ml安瓿中；115°C， 20 30miri 热压灭菌，制得半枝莲总黄酮注射液。取流浸膏上大孔树脂柱的浸膏和树脂的重量比为1: 5 10。明胶溶 液的浓度为2% 5%。流通蒸汽灭菌是在110 115'C热压灭菌20 30min。本发明选用材料科学，工艺简单先进。由于半枝莲总黄酮中大部分是 黄酮苷类，少量或不含黄酮苷元类，极易溶于NaHC03、 NaOH等稀碱性溶 液。故本发明考虑其结构特征和溶解特性，将半枝莲总黄酮提取物先加入 NaHC03生成可溶性钠盐，从而增加主药溶解度。所用大孔树脂型号为D101 型树脂，按流浸膏计算树脂重量，浸膏和树脂的重量比为1: 5 10，上 样量如果超载，分离效果不好。大孔树脂先用水洗脱的目的是除去水溶性 杂质，如蛋白质、氨基酸、无机盐、鞣质、多糖等；20 30%乙醇洗脱是 除去极性较大的杂质，而极性适中的黄酮类化合物主要在70%乙醇洗脱部 位。用20% 50%乙醇的提取率高，并且可防止黄酮苷的酶解；乙醇的用 量根据药材性状决定，切制后的药材提取两次，每次2小时，总黄酮已经 提取完全。半枝莲总黄酮注射液是一种以抑制血管再生为作用靶点的抗肿 瘤药物，经动物实验观察表明，产品吸收利用度好，是治疗胃癌、肝癌、 肺癌、宫颈癌、乳腺癌、绒毛膜癌等恶性肿瘤的理想用药，不良反应小， 疗效好，经济安全。本发明在制备的每一工艺步骤严格把关，对制备的注射用半枝莲总黄 酮进行评价-2. 3注射用半枝莲总黄酮的质量评价 2. 3. 1杂质检査按照《中药注射剂研究的技术要求》对砷盐、炽灼残渣、重金属、蛋 白质、树脂、鞣质、草酸盐、钾离子等进行检査，结果均符合规定。 2. 3. 2有效成分定量分析UV测得半枝莲总黄酮苷类含量为85. 10% ， HPLC测得有效单体野黄芩 苷含量为10%。2.3.3有机溶剂残留量检査国家新药报批资料《中药注射剂研究的技术要求》规定"供配制注射 液用的原料或半成品，在提取、纯化过程中可能引入有害有机溶剂者，应 作有害有机溶剂残留量检査"。因此，为了避免引入有害有机溶剂，降低 提取和纯化成本，本发明只使用了乙醇这种无害的有机溶剂，不需要作有 害有机溶剂残留量检查，非常适合工业化生产。只使用乙醇，而使制成注 射液原料在纯度、性状和疗效方面符合，符合药典标准。2.3.4安全性的特殊评价项目异常毒性检査结果表明，半枝莲总黄酮溶液对小鼠异常毒性试验合 格；溶血试验结果表明，半枝莲总黄酮溶液无溶血作用，对红细胞无凝聚 作用;全身过敏试验结果表明，半枝莲总黄酮溶液对豚鼠无全身过敏反应; 刺激性试验结果表明，局部刺激性试验符合规定，而且对家兔血管也无刺 激作用。
2. 3. 5按注射剂制剂通则检査按《中国药典》2005年版规定注射剂的检査项目(澄明度、pH、无菌 检査等)，对半枝莲总黄酮溶液进行澄明度检查，符合要求；将半枝莲总 黄酮溶液灌封煮沸后检査，无菌检查和PH值均符合规定。2. 3.6稳定性影响因素试验按《中国药典》2005年版二部附录"药物稳定性试验指导原则"对 半枝莲总黄酮进行影响因素试验。在高温(6(TC)和强光照射试验中，半枝 莲总黄酮性状均无明显变化，并分别于5d和10d采用HPLC测定野黄芩苷 含量。高温试验5(1测得野黄芩苷残留量为99.8%， 10d为99. 1%;强光照 射试验测定结果见下表_表1半枝莲总黄酮提取物强光照射试验结果__^_5d残留量％_10d残留量％紫外灯下 91.4 86.4 荧光灯下 97. 1 86.7 _白炽灯下_^_^_在高湿试验(朋75%)中，半枝莲总黄酮逐渐聚集，最后呈半固体糊状， 并分别于5d和10d测定吸湿量，5d测得吸湿量为11. 49%， 10d为12. 42%。影响因素试验结果表明，提取物在白炽灯照射下较紫外灯和荧光灯稳 定；在高温试验条件下比较稳定；受湿度影响较大。上述结果提示制备的 注射用半枝莲总黄酮固体物最好在干燥条件下避光贮存。2. 3. 7初步稳定性考察取半枝莲总黄酮适量，于室温放置在干燥器中，分别放置O、 1、 2、 3月，发现其外观性状均无明显变化。并将其配成溶液进行澄明度检查， 均澄清透明。放置l、 2、 3月，HPLC测得野黄芩苷残留量分别为99.8呢， 99.4%， 99.4%〃。
初步稳定性考察结果表明，室温放置3个月后，提取物的有效成分含 量、性状和澄明度皆无明显变化，说明其在室温条件下稳定性较好。 对制备的半枝莲总黄酮注射液进行评价-2-3半枝莲总黄酮提取物注射液质量标准 2-3. 1性状本品为棕黄色澄明液体 2-3. 2鉴别2-3.2. l取本品，加甲醇稀释制成每lml中约含150ug的溶液，照 分光光度法(中国药典2005年版二部附录IV A)测定，在285ran及335nm 的波长处各有一最大吸收。2-3. 2. 2指纹图谱供试品峰的保留时间应与对照品峰的保留时间一致。2-3. 3检査按《中国药典》2005年版一部附录注射剂项下进行检查，并参考《中药新药研究的技术要求》中对中药注射剂的有关规定，检查的项目有色泽、pH值、蛋白质、鞣质、重金属、砷盐、草酸盐、钾离子、树脂、炽灼残渣、热原、无菌、异常毒性(溶血试验、刺激性试验、过敏试验)、总固体量测定、装量差异。2-3.3.1 pH值取本品，依法测定(附录VE G)，应为6. 5 8.0。 2-3.3.2色泽取本品0.5ml稀释至10ml，相当于林色林号液。 2-3.3.3澄明度按《中国药典》2005年版规定注射剂的检查项目，对提取物溶液进行澄明度检查，符合要求。 2-3. 3. 4杂质检查按照《中药注射剂研究的技术要求》对砷盐、炽灼残渣、重金属、蛋 白质、树脂、鞣质、草酸盐、钾离子等进行检査，结果均符合规定。2-3.3.5无菌检査按《中国药典》2005年版规定注射剂的检査项 目，对提取物溶液进行无菌检查，符合规定。2-3. 3. 6热原按《中国药典》2005版一部方法(家兔试验法)检查， 符合规定。2-3.4照高效液相色谱法(中国药典2005版附录VI D.)测定。 2-3. 4. 1色谱条件色谱柱ZORBAXSB-C18(150mmX4. 6腿，5 u m);柱温40。C;流动相 甲醇-水溶液(55: 45);检测波长335nm。 2-3. 4.2标准曲线的制备精密称取野黄芩苷对照品15mg，置100ml容量瓶中，加甲醇适量振 摇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得野黄芩苷对照品贮备液。精密量取野黄芩苷对照品贮备液2， 4， 6， 10， 14， 18ml，分别置50ml 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下，分别精密吸取 20ul，注入色谱仪。以峰面积为纵坐标，浓度(mg.L—》为横坐标，进行线 性回归，得回归方程A二1134.9C-100769.9， r=0. 9998 (n=6)。2-3.4.3回收率试验采用加样回收实验。分别取不同量的野黄芩苷对照品贮备液加入已测 知含量的半枝莲总黄酮注射液中，依法测定，按外标法计算。结果平均回 收率为101.52%， RSD为1. 1%。2-3. 4. 4精密度试验选择高中低三个浓度，重复进样5次测得峰面积，计算相对标准偏差 (RSD%)，结果相对标准偏差均小于1%，该测定方法精密度良好。 2-3.4.5重现性试验精密量取半枝莲总黄酮注射液250u 1，用甲醇溶解定容于50ml容量
瓶中，平行操作制备5份样品，测定含量及相对标准偏差(RSD%)，结果 相对标准偏差小于1%，表明该测定方法重复性良好。 2-3. 4. 6稳定性试验精密量取半枝莲总黄酮注射液250u 1，用甲醇溶解定容于50ml容量 瓶中，与25'C避光保存，分别于O、 2、 4、 6、 8、 12小时，测定含量及 相对标准偏差(RSDQ/。小于1%)，供试品溶液在10小时内无显著变化，样 品稳定，样品溶液应于IO小时内完成测定。2.4作用与用途主要用于治疗胃癌、肝癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌、 绒毛膜癌等恶性肿瘤。2.5剂量每次注射1 2支。2.6规格每支安瓿2ml，内含半枝莲提取物20mg。2.7贮藏遮光，密闭，在阴凉处保存。
图1为HUVEC原代培养细胞未加药组(10*10)光镜图；图2为HUVEC原代培养细胞加半枝莲总黄酮注射液组(10*10)光镜图，可见其对小管形成有明显影响，不仅小管数目减少，而且管腔不完整; 图3为小鼠腹腔种植Matrigel栓，HE染色光镜观察微血管生成未加药组(10*20)光镜图；图4为小鼠腹腔种植Matrigel栓，HE染色光镜观察半枝莲总黄酮注射液对Matrigel栓的微血管生成影响图(10*20)光镜图，可见Matrigel种植体内的微血管闭锁，内皮细胞脱落，红细胞数目减少； 图5为HUVEC迁移模型未加药组(10*10)光镜图； 图6为HUVEC迁移模型加半枝莲总黄酮注射液组(10*10)光镜图，可见能明显抑制内皮细胞的迁移。
具体实施方式
1、 半枝莲总黄酮液的制备取半枝莲药材lkg，用50%乙醇5(TC浸透，以药材10倍重量50%乙醇 5(TC回流提取2小时，提取液与药渣压搾液合并，过滤，滤液减压浓縮至 含水量40%，得湿浸膏0.5208kg (干浸膏0.3173kg)。每克湿浸膏相当 于原药材1.94g，总黄酮含量为16.99% (W/W);每克干浸膏相当于原药 材3. 15g，干浸膏总黄酮含量为29.05% (W/W)。指标成分野黄芩苷含量 占总黄酮量的8. 5%。药渣用5倍重量0.5柳aHC(X (pH 8.5)溶液提取2小时，提取液与 药渣压榨液合并，过滤，得滤液(滤液中总黄酮含量为0.6%， W/V)。湿浸膏滤液=1. 94 : 5混合，得半枝莲总黄酮液1. 8631kg (总黄酮 含量为5. 1816%， W/W)。2、 半枝莲注射液的制备取半枝莲总黄酮液lkg，用注射用水稀释至pH 7，静置5h，过滤； 滤液10(TC夹层锅水浴加热30min， 4"C放置48h，滤过，滤液用注射用水 调含量至每毫升含半枝莲总黄酮20mg (野黄芩苷的含量不低于5%);再 经澄明度、色泽、pH值、蛋白质、鞣质、重金属、砷盐、草酸盐、钾离 子等检査合格后，调等渗等张，灌装在2ml安瓿中；115'C30min热压灭 菌，制得半枝莲总黄酮注射液2590ml，共装1295个安瓿。产品按《中国 药典》2005版注射剂项下规定进行热原等项检査。3、 疗效观察采用流式细胞术、Transwell共培养小室、ELISA等方法，进一步研 究半枝莲黄酮注射液抑制肿瘤血管生成的作用及其机理。结果如下半枝莲黄酮注射液能有效抑制HUVEC的增殖，能诱导内皮细胞凋亡，
能抑制体外血管生成和内皮细胞迁移当浓度达到50ii g/ml时对小管形成即有明显影响，不仅小管数目减少，而且管腔不完整，HUVEC经50ug /ml药物作用后，与对照组相比内皮细胞迁移数明显减少(P〈0.01)。半 枝莲黄酮注射液还能抑制Hela细胞VEGF、 NO的表达各浓度作用细胞 24、 48小时后均能明显抑制肿瘤细胞的VEGF表达，具有显著差异 (p<0. 01 )。但24小时各浓度之间作用比较没有差异。本产品经动物实验、药效学研究及急慢性毒性学试验，结果表明具有 明显的抑制血管再生抗肿瘤作用，局部无过敏反应，全身未见明显毒副作 用。本项目开发的产品属深加工产品，科技含量高，开发层次高，对资源 的有效利用程度好。经动物实验和一期临床初步观察，产品吸收利用度好， 无不良反应，疗效可达85%以上。产品为临床所急需，具有巨大的需求市 场，在成果转化中能产生巨大的经济效益。
权利要求
1.一种半枝莲总黄酮注射液，其特征是以半枝莲总黄酮为主要成分。
2. —种半枝莲总黄酮注射液的制备方法，其特征是包括以下步骤-2. 2. 1半枝莲总黄酮液的制备取半枝莲药材，用20。/。 50。/。乙醇3(TC 5(rC浸透，以药材5 10 倍重量20% 50%乙醇50。C回流提取1 2小时，提取液与药渣压榨液合 并，过滤，滤液减压浓縮至含水量30% 50%，得含重量为15% 20%总 黄酮的湿浸膏；药渣用5 15倍重量0. 5 %NaHC03， pH 8. 5溶液提取1 2小时， 提取液与药渣压榨液合并，过滤，得含重量为0. 2% 1%总黄酮的滤液； 将湿浸膏滤液=1 : 5 3 : 5混合，得半枝莲总黄酮液； 2. 2. 2半枝莲注射液的制备取半枝莲总黄酮液，用注射用水稀释至pH 7，静置3 5h，过滤； 滤液10(TC夹层锅水浴加热30min， 4"C放置24 h 48h，滤过，滤液用 注射用水调含量至每毫升含半枝莲总黄酮20mg 30 mg;再经澄明度、 色泽、PH值、蛋白质、鞣质、重金属、砷盐、草酸盐、钾离子等检查 合格后，调等渗等张，灌装在2ml安瓿中；115°C， 20 30min热压灭 菌，制得半枝莲总黄酮注射液。
全文摘要
本发明公开了一种半枝莲总黄酮注射液及其制备方法，半枝莲总黄酮注射液以半枝莲总黄酮为主要成分，是抑制血管再生为作用靶点的抗肿瘤药物。半枝莲总黄酮注射液，是将半枝莲药材，采用乙醇回流提取等工艺步骤制得，工艺先进简单。半枝莲总黄酮注射液是治疗胃癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、绒毛膜癌等恶性肿瘤的理想用药，适应症广、疗效明显、经济安全。
文档编号A61K31/539GK101156858SQ20071002376
公开日2008年4月9日 申请日期2007年7月9日 优先权日2007年7月9日
发明者平 卜, 孔桂美, 荣 胡 申请人:扬州大学