专利名称：：一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法
技术领域：
：本发明涉及天然药物的分离，具体的说是白花蛇舌草提取物分离制备方法，该组分主要成分是鸡矢藤苷甲酯，去乙酰基车叶草苷酸甲酯，车叶草苷酸和车叶草苷四个化合物。
背景技术：
：中药白花蛇舌草为茜草科耳草属植物白花蛇舌草i/e办o他又名OWew/a"^34^"^及ojc6.的全草。始载于《广西中药志》，具有清热解毒、活血化瘀、利水渗湿、消肿止痛、抗肿瘤等作用，广泛用于肿瘤、黄疸性肝炎、肠炎和肺炎等的治疗。主产于广东、广西、福建等地。白花蛇舌草的主要成分是环烯醚萜类、黄酮类和蒽醌类化合物，其次为有机酸类、甾醇类化合物等。白花蛇舌草中常见的环烯醚蔽类化合物主要有鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸、车叶草苷和鸡矢藤苷等。药理研究表明，白花蛇舌草具有抗氧化，消炎抗菌、抗肿瘤、免疫调节等多种药理活性(LinC.C.，NgL.T.andYangJ.J.，Am.J.Chin.Med.，2004，32:339-349;LinC.C.,NgL.T"YangJ.J.andHsuY.F,Am.J.Chin.Med.，2002,30:225-234;赵浩如等，中国药科大学学报，2002，33(6):510-513;YoshidaY"WangM.Q.etal"Int.J.Immunopharmaclo.1997，19:359-370)。同时白花蛇舌草中环烯醚萜类化合物还具有神经保护作用(KimY.，ParkE.J.，etal.,J.Nat.Prod.,2001,64:75-78)。由于白花蛇舌草在抗肿瘤方面的功效，越来越引起人们的关注。白花蛇舌草及其制剂主要用于呼吸系统感染、肝炎、肺炎、肿瘤等的治疗。环烯醚萜类化合物是白花蛇舌草中主要活性成分之一，而目前报道的分离制备烯醚萜类化合物的方法，基本上都是采取传统的溶剂萃取、硅胶柱层析等方法，这些方法存在重现性差、耗时长、有机残留严重、检测手段落后、自动化程度低、无法大规模生产等缺点。
发明内容本发明的目的是提供一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷四个主要的化合物。本发明提供一种白花蛇舌草提取物，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷，所述的四种主要成分总含量在60%~75%。本发明提供的白花蛇舌草提取物，其中鸡矢藤苷甲酯的含量在10°/&—15%，去乙酰基车叶草苷酸甲酯含量在10°/^~20%，车叶草苷酸含量在20%~25%，车叶草苷含量在20%~25%。本发明提供了一种白花蛇舌草提取物的分离制备方法，分为提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤，具体为1)提取称取白花蛇舌草原药材，加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓縮至相对密度为0.9-1.10得浸膏；2)醇沉将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70%，室温静置12-24小时，过滤，取滤液浓縮至相对密度1.05-1.10;再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-80%，室温静置12-24小时过滤，取滤液浓缩挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心；3)膜分离此醇沉组分再通过3000-6000Da的膜分离，得到膜分离组分；4)非极性大孔树脂分离将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1:100~500，分别采用流动相体积浓度10-30%的乙醇和70-95%乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-5个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；循环洗脱，洗脱液浓縮，即为白花蛇舌草大孔树脂分离组分；5)工业色谱分离以粒径5-20微米的OEG系列硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，甲醇的体积浓度从2-100%变化，收集目标组分，干燥处理即为白花蛇舌草提取物。本发明提供的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。本发明提供的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，所述色谱柱长为200毫米_600毫米，色谱柱内径为20毫米一300毫米。本发明的优点1.主要成分的含量高。本发明采用了最先进的工业色谱填料和分离制备技术。利用工业色谱的高分离能力，可以保证主要成分的纯度达到70%以上。2.重现性好。本发明利用工业色谱系统和OEG系列硅胶键合固定相分离材料稳定的性能，可以保证分离制备的重现性和稳定性。3.周期短。本发明从原药材的粉碎提取到制备得到白花蛇舌草提取物的产品，只需要10天的时间。4.有机残留低。由于本发明摒弃了传统工艺中溶剂萃取、硅胶柱层析等工艺，采用了有机溶剂使用量较少的工业色谱方法，而且最终产品采用真空离心干燥处理，所以最终产品的有机溶剂残留特别小。5.能够实现大规模工业生产。本发明所采用工艺非常容易实现标准化，自动化，适于进行产业化大规模生产。图1本发明实施例1工业色谱制备白花蛇舌草提取物的制备色谱图。图2本发明中白花蛇舌草提取物的HPLC色谱图a=254nm)具体实施方式白花蛇舌草提取物的制备方法实施例1:将白花蛇舌草原药材粉碎，定量称取2千克，置于20升提取罐中，加入20升水煎煮1小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入20升水煎煮1小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓縮至500毫升，得到白花蛇舌草水提取组分。在浓縮液中加入710毫升95%乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓縮至300毫升，在浓縮液中加入1600毫升95%乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓縮至无醇味，浓縮液经过高速离心机(20000转/分钟)离心，得到白花蛇舌草醇沉组分300毫升。此醇沉组分再过6000Da膜，得到膜分离组分。取白花蛇舌草膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统(20L)中，。首先用5倍柱体积100L3(^乙醇洗脱柱体，洗脱液浓縮备其它用，再用5倍柱体积100L95。/。乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓縮，得到白花蛇舌草大孔树脂组分。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm(可为230-260nm)，流速200分钟/毫升，设定洗脱梯度(见表l)，初始流动相(5%甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取白花蛇舌草大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分(见图1)。将收集得到的切割组分，合并，浓縮，再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品2.3克，经高效液相色谱分析(图2)，其提取物的总含量>71%。表1实施例1白花蛇舌草提取物的工业色谱制备梯度设置表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例2将白花蛇舌草原药材粉碎，定量称取5千克，置于100升提取罐中，加入40升水煎煮2小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入40升水煎煮2小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓縮至1000毫升，得到白花蛇舌草水提取组分。在浓縮液中加入1710毫升95%乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓縮至500毫升，在浓縮液中加入2670毫升95%乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓縮至无醇味，浓縮液经过高速离心机(10000转/分钟)离心，得到白花蛇舌草醇沉组分500毫升。此醇沉组分再过6000Da膜，得到膜分离组分。取白花蛇舌草膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统(60L)中，。首先用3倍柱体积30%乙醇洗脱柱体，洗脱液浓縮备其它用，再用3柱体积的95%乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓縮，得到白花蛇舌草大孔树脂组分。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm，流速200分钟/毫升，设定洗脱梯度(见表l)，初始流动相(5%甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取白花蛇舌草大孔树脂组分样品5ml，进样，按设定梯度洗脱，收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。将收集得到的切割组分，合并，浓縮，再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品5.8克，经高效液相色谱分析，其提取物的总含量>71%。实施例3将白花蛇舌草原药材粉碎，定量称取10千克，置于100升提取罐中，加入60升水煎煮3小时，过滤，滤液保存备用，滤渣中再加入60升水煎煮3小时，过滤，滤液与第一次合并，滤渣弃去。将提取液旋转蒸发浓縮至2000毫升，得到白花蛇舌草水提取组分。在浓縮液中加入3420毫升95%乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓縮至1500毫升，在浓縮液中加入8000毫升95%乙醇，充分搅拌，室温静置24小时，过滤，滤渣弃去，滤液浓縮至无醇味，浓縮液经过高速离心机(25000转/分钟)离心，得到白花蛇舌草醇沉组分1800毫升。此醇沉组分再过3000Da膜，得到膜分离组分。取白花蛇舌草膜分离组分，进样到已处理好的罗门哈斯XAD-4型大孔树脂层析系统中，。首先用3倍柱体积30%乙醇洗脱柱体，洗脱液浓縮备其它用，再用3倍柱体积95%乙醇洗脱，洗脱液保存，并浓縮，得到白花蛇舌草大孔树脂组分。工业色谱柱柱长400毫米，内径80毫米，色谱填料为10-20微米的OEG-4键合固定相，柱效为15000塔板/米，设定紫外检测波长为254nm(可为230-260nm)，流速200分钟/毫升，设定洗脱梯度(见表l),初始流动相(5%甲醇水)平衡色谱柱20分钟，取白花蛇舌草大孔树脂组分样品3ml，进样，按设定梯度洗脱，收集2分钟至8分钟组分。洗脱结束，再次平衡柱子，进样，收集洗脱组分。将收集得到的切割组分，合并，浓縮，再通过真空离心干燥得到白花蛇舌草提取物产品10.8克，经高效液相色谱分析，其提取物的总含量>70%。权利要求1、一种白花蛇舌草提取物，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷，其特征在于所述的四种主要成分总含量在60％—75％。2、按照权利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于鸡矢藤苷甲酯的含量在10°/tl5%。3、按照权利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于去乙酰基车叶草苷酸甲酯含量在10%—20%。4、按照权利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于车叶草苷酸含量在20%~25%。5、按照权利要求l所述的白花蛇舌草提取物，其特征在于车叶草苷含量在15°A~~25°/o。6、一种如权利要求l所述的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，其特征在于分为提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤，具体为1)提取称取白花蛇舌草原药材，加入其重量6-10倍的水煎煮提取2-3次，每次1-3小时，得到提取液，将提取液浓縮至相对密度为0.9-1.10浸膏；2)醇沉将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70%,室温静置12-24小时，过滤，取滤液浓縮至相对密度1.05-1.10;再加入乙醇使乙醇体积浓度达到75-80%，室温静置12-24小时过滤，取滤液浓縮挥发除去乙醇，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心；3)膜分离此醇沉组分再通过3000-6000Da的膜分离，得到膜分离组分；4)非极性大孔树脂分离将膜分离组分上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1:100~500，分别采用流动相体积浓度10-30%的乙醇和70-95%乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3-5个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；循环洗脱，洗脱液浓縮，即为白花蛇舌草大孔树脂分离组分；5)工业色谱分离以粒径5-20微米的OEG系列硅胶键合固定相为色谱填料，以甲醇和水为流动相，梯度洗脱，甲醇的体积浓度从2-100%变化，收集目标组分，干燥处理即为白花蛇舌草提取物。7、一种如权利要求6所述的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，其特征在于所述色谱柱效为5000-20000塔板/米。8、一种如权利要求6所述的白花蛇舌草提取物的分离制备方法，其特征在于所述色谱柱长为200毫米~600毫米，色谱柱内径为20毫米一300全文摘要一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法，其中主要成分为鸡矢藤苷甲酯、去乙酰基车叶草苷酸甲酯、车叶草苷酸和车叶草苷，所述的四种主要成分总含量在60％-75％。白花蛇舌草药材经提取、醇沉、膜分离、非极性大孔树脂分离和工业色谱分离等步骤，获得提取物。本制备方法可有效的去除糖蛋白、多糖、氨基酸等杂质，提高了主要活性成分的含量。制备过程重复性高和可操作性好，易于实现标准化和产业化，同时对于白花蛇舌草药材的质量控制也有一定的指导意义。文档编号A61P1/16GK101496845SQ200810010309公开日2009年8月5日申请日期2008年2月1日优先权日2008年2月1日发明者丰加涛,青徐,李存满,梁鑫淼,章飞芳,薛兴亚申请人:中国科学院大连化学物理研究所