含分离自白花蛇舌草的活性级分的组合物及使用方法

专利名称：含分离自白花蛇舌草的活性级分的组合物及使用方法
技术领域：
本发明属药物范畴，明确而言，其涉及用于预防及疾病治疗的抗-血管生成药物领域。
背景技术：
血管生成作用是自既存的血管往外生长生成新的血管结构的过程，在此过程中，因为支撑内皮细胞的基膜被蛋白水解酶分解，因而内皮细胞会脱离基膜，而后这些细胞会迁移出原来的血管、进行分裂，并形成新分化的血管结构(Risau，(1997)Nature386671-674；Wilting等人.，(1995)Cell.Mol.Biol.Res.41(4)219-232)。已发现数种不同生物因子具有控制血管生成的功能(Bussolino等人.，(1997)Trends in Biochem Sci22(7)251-256；Folkman及D’Amore，(1996)Cell 871153-1155)，其包括具有各种功能的蛋白质，诸如生长因子、细胞表面受体、蛋白酶、蛋白酶抑制剂，及胞外基质蛋白质(Achen及Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79255-265；Devalaraja及Richmond，(1999)Trends in Pharmacol.Sci.20(4)151-156；Hanahan，(1997)Science27748-50；Maisonpierre等人，(1997)Science27755-60；Suri等人，(1996)Cell 871171-1180；Sato等人，(1995)Nature37670-74；Mignatti及Rifkin，(1996)Enzyme Protein49117-137；Pintucci等人.，(1996)Semin Thromb Hemost22(6)517-524；Vernon及Sage，(1995)Am.J.Pathol.147(4)873-883；Brooks等人.，(1994)Science 264569-571；Koch等人.，(1995)Nature 376517-519)。血管生成作用的复杂性及控制其进展的因子的多样性提供控制体内血管生成作用以为治疗方法的可用思维。
正常情况下，血管生成作用以周密控制的方式发生于胚胎发育、生长，及特别情况下(例如伤口愈合及女性生殖循环)(Wilting及Christ，(1996)Naturwissenschaften 83153-164；Goodger及Rogers，(1995)Microcirculation 2329-343；Augustin等人.，(1995)Am.J.Pathol.147(2)339-351)。血管生成作用过程中某些重要的步骤有1)生长因子(例如血管内皮生长因子，VEGF)信号作用；2)基质金属蛋白酶(MMP)同VEGF受体相互作用；3)内皮细胞迁移至生长因子信号作用位置；及4)内皮细胞管状物的生成。病理性血管生成作用在一些人类疾病中扮演重要角色，包括肿瘤生长及移转性癌症、糖尿病性视网膜病、类风湿性关节炎，及其他发炎性疾病，诸如牛皮癣(Folkman，(1995)Nature Med.1(1)27-31；Polverini，(1995)Rheumatology 38(2)103-112；Healy等人.，(1998)Hum.Reprod.Update 4(5)736-396)。在这些例子中，疾病的恶化由血管生成作用的持续失控所导致，例如，在类风湿性关节炎中，新毛细血管会侵入关节，并破坏软骨，在糖尿病性视网膜病中，视网膜中的毛细血管会侵入玻璃体，出血并导致失明，重要的是，肿瘤生长及移转作用与血管生成作用有关，大部分原发性固体肿瘤会经历一段长时间的无血管期，期间的生长局限于直径约为1-2毫米范围，在此大小的内，肿瘤细胞可经由被动扩散作用获取所需的氧及营养，而这些微观肿瘤质体最终会启动血管生成作用，并募集周边血管，开始长出毛细血管在肿瘤质体内形成血管，提供肿瘤持续扩展并移转恶性肿瘤到远端位置。虽然在探索病理性血管生成作用的生物过程方面已有明显的进展，然而目前并无有效的药用化合物可以控制体内的血管生成作用，因此，有效控制血管生成作用的治疗法有可能减缓大量人类疾病。
传统上，通过筛选具有所需药物特性的合成化学化合物，而后在体内试验其毒性及有效性，以开发出药用化合物。利用此法所筛选的化合物常于体内具有毒性副作用，且此方法尚未成功发展出可作为疾病疗法的有效的血管生成抑制剂。近来，已应用分子生物技术发展血管生成作用抑制剂，已发现，在实验模型中可控制血管生成的血管生成的蛋白抑制剂，诸如血管抑制蛋白(angiostatin)(O’Reilly等人.，(1994)Cell79(2)315-328)及内皮抑制蛋白(endostatin)(O’Reilly等人.，(1997)Cell 88(2)277-285)。但是，生产此种蛋白质相当昂贵，难以制剂，且不易传送至受体中。目前，蛋白质血管生成抑制剂尚未开发为疾患者者的医疗药物，因此，需要能安全施用于患者，且有效抑制血管内皮细胞的病理性生长的治疗性化合物。本发明提供的组合物及方法即是用于此目的，并可提供相关的优势。
发明公开本发明提供自白花蛇舌草(Hedyotis Diffusae)提取药学活性级分(又称“提取物”，“化合物”或“药物”)的方法。在一方面，该方法自白花蛇舌草热(约80-90℃，约30分钟)茶中提取出名为AHD04级分，以柱层析分离，其具有光学吸收值介于约210nm至约250nm。获得此级分的一个方法是将有效量的白花蛇舌草泡在有效量的热水中，制成液态提取物，后过滤该提取物后获得澄清的液体提取物。此命名为EHDa的粗提取物可加工成食品或健康补品。EHDa经冷冻干燥，重悬浮，利用层析分离出药物活性级分ADH04。
本发明提供通过传送生长抑制含量的本发明级分至细胞中，以抑制内皮细胞生长的方法，通过传送抗血管生成作用含量的级分至组织中，可以抑制组织中血管生成作用。本发明亦提供治疗各种疾病，包括癌症的方法。
附图简述

图1描述本发明的例示过程。然而需知，虽未总是申明在此所述药剂仅为例示，其等同物为本领域所熟知。以下为实例，而其等同物属于本发明范。
图1描述分离可作食品及健康补品，名为EHDa活性级分的步骤及分离AHD04活性级分的方法。简略而言，自白花蛇舌草提取粗提取物开始于将干燥植物浸泡于温度范围约60℃至约100℃的热水中，时间约10分钟至60分钟。利用cheesecloth或Miracloth过滤液体提取物，去除液体提取物中的物理性物质及大分子，而后以1000rpm的速度离心提取液约10分钟，保留澄清的液态上清液，并冷冻干燥浓缩分离自白花蛇舌草的活性级分。进行CPAE分析来决定该新的粗提取物EHDa抑制血管生成作用的有效浓度。利用CPAE分析法分析所有的级分、沉淀物、及上清液、确保每一纯化步骤中抗-血管生成活性并未消失，或遗漏。经由层析法进一步分离产生基本纯化的活性级分AHD04。
图2所示为自G-25凝胶过滤层析分离的级分的活性[柱＝体积20公分×80公分；在4℃进行实验，流速为3.0毫升/毫升水]。
图3所示为自C-18层析柱所分离的级分的活性。
图4所示为经第二次C-18柱层析后所得的抑制作用(％)(Y轴)与浓度(X轴)关系图形。
实施本发明的方式在此整篇公开内容中各种发表文献、专利及发表的专利说明书系以明确引用作为参考。这些发表文献、专利及发表的专利说明书并入本专利说明书作为参考，以便更完全详述本发明的技术状态。
除非特别说明，本发明所采用操作为本领域内分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、有机学、生物化学及免疫学常规技术，有文献详细说明此类技术。
定义本专利说明书中所用的某些名词具有下列的定义。
除非在上下文中有明确指出，否则本专利说明书及权利要求中所指单数“一种”包括其复数，例如，“一种细胞”包括细胞的复数，包括其混合物。
本专利说明书中所用“包括”意指该组合物及方法中包含所列举的元素，但不排除包含其他元素。当以“基本由…组成”定义组合物及方法时，不包括其他任何对组合有基本重要性的元素。因此，基本由本专利说明书所定义的元素组成的组合物不排除有在分离及纯化时带入的少量污染物，及药学上可接受的载体，诸如磷酸缓冲盐溶液、防腐剂及类似物。“由…组成”指排除对于施用本发明组合物的其他超过微量成分的元素，及实质性的方法步骤。由这些变化的术语定义的实施方案属本发明范围内。
所有的数值名称，例如pH、温度、时间、浓度及分子量，包括范围，以0.1数值增(+)或减(-)的变化近似。需知，虽然无法总是精确列举，所有数值前有“约”字。亦需知，虽然无法总是明确申请，但本专利说明书所述试剂只是实例，而其等同物为本领域技术所熟知。
“分离”指将化合物从正常情况下与其有关的组成物、细胞及其他成分分开。
“受体”或“宿主”指脊椎动物，优选动物或哺乳动物，更优选为人类患者，哺乳动物包括，但不局限于，鼠科、猿类、人类患者、农场动物、比赛动物、及宠物。
相互变化用词，且不论单数或复数的“癌症”、“恶性肿瘤”及“肿瘤”指已进行恶性转化的细胞，其对宿主机体造成病理性伤害。利用良好建立的技术，特别是组织学检查，可轻易区分原发性癌症细胞(即，获自靠近恶性转换位点的细胞)与非-癌症细胞。本专利说明书所用“癌症”定义不仅包括原发性癌症细胞，亦包括衍生自癌症细胞祖先的任何细胞，包括移转的癌症细胞，及体外培养细胞，及衍生自癌症细胞的细胞系。当称某类癌症正常为固体肿瘤时，“临床可检测的”肿瘤是种根据肿瘤质量可检测到的肿瘤；例如，利用诸如CAT扫描步骤、核磁共振影像(MRI)、X-光、超声波或触诊检测。只以生化或免疫学所发现的不足以符合此定义。
本专利说明书所指“抑制”为终止、延滞或减缓内皮细胞的生长、增殖或细胞分裂，或血管在组织中的生成。监控抑制作用的方法包括，但不局限于内皮细胞增殖分析、利用测定血液成分及定量测定血管结构密度以测定血管床的体积。当培养细胞为细胞混合物时，利用定量测定表达内皮细胞特异性的标记，诸如血管生成因子、蛋白水解酶及内皮细胞特异性的细胞吸附分子的细胞，以监控新血管生成。
“组合物”指活性剂及其他惰性或活性化合物或组合物，如佐剂的组合。“药物组合物”指包括活性剂和惰性或活性载体的组合物，其载体使该组合物适于体内或体外或离体的诊断或治疗用途。
本专利说明书中所用“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，诸如磷酸缓冲盐溶液、水及浮化液，诸如油/水或水/油浮化液，及各种类型的润湿剂。组合物亦可包括稳定剂及防腐剂。载体、稳定剂及佐剂的实例，可参考Martin，REMINGTON’S PHARM.SCI.，15版(Mack出版公司.，Easton(1975))。
“有效量”指足以产生有益或所需结果的量，此量与预防有效量可相同或不相同，所谓预防有效量指预防疾病或疾病症状发生的必须量。可以在一或多次施用、应用或剂量中施用该有效量。
申请者已经确定自白花蛇舌草提取药学活性级分的步骤。一方面，该步骤要求自白花蛇舌草热茶(约80-90℃，约30分钟)提取出级分，其中该级分具有光学吸收值介于约210nm至250nm，进一步，该活性级分具有光学吸收值约220nm至约240nm。另一方面，层析法纯化后的药物活性级分具有光学吸收值约230nm。将有效量的白花蛇舌草浸泡于有效量的热水中，制备液态提取物，后过滤该提取物得澄清液体提取物，该提取物质经冷冻干燥，而后重悬于适当载体中，并以层析法分离出药物活性级分。
本发明者亦发现该级分可抑制内皮细胞生长，且具有抗-血管生成特性。根据这些发现，本发明提供通过传送生长抑制含量的级分至细胞中，以抑制内皮细胞生长的方法。本发明亦提供通过传送抗-血管生成含量的本发明级分至组织中，以抑制组织中血管生成的方法。
本发明可应用于体外或体内。当应用于体外操作时，将内皮细胞或血管化组织培养于本领域所熟知的条件下，如以下所例示。细胞和/或组织可源自已建立的细胞株或培养自患者切片样品。而后将该级分直接加入培养基中，或以药物组合物中的成分传送该级分。
不是每一种治疗对每个个体均有效，因此，利用体外分析调节对各患者的有效性是有利的。本方法提供这些方式，以确定是否组合物或治疗法可治疗与病理性内皮细胞增长或血管生成作用有关的特异性疾病。例如，自患者分离出组织切片，并处以本专利说明书定义的有效量的药物组合物或治疗法，并置于细胞增殖及生长的有效条件下。利用常规步骤，例如本专利说明书中所述的CPAE分析法，测定病理细胞生长的抑制，其显示发明的组合物和/或治疗法可有效治疗患者。
血管生成作用或新血管的形成是新血管生成的基本步骤，其参与重要的生理事件，诸如生殖发育及伤口愈合。正常情况下，血管生成作用受到高度调控，而持续的血管生成作用的失控会造成疾病。在类风湿性关节炎中，新毛细血管会侵入关节，并破坏软骨。在糖尿病性视网膜病中，视网膜中的毛细血管会侵入玻璃体，出血并导致失明。而肿瘤生长及移转作用依赖血管生成。大部分原发性固体肿瘤会经历一段长时间的无血管期，并明显静止，期间的生长局限于直径约为1-2毫米范围，在此大小的内，肿瘤细胞可经由被动扩散作用获取所需的氧及营养。通过募集周边成熟宿主血管细胞开始长出新的毛细血管，开启这些微观肿瘤质体的血管生成作用，最终为渗透肿瘤质体，因此启动无限扩展肿瘤质体，及血移转作用。血管生成启动作用开始假设是通过肿瘤细胞异位生产并制造名为“肿瘤血管生成因子(TAF)”的生长因子而启动。
本发明亦提供通过对患者施用本发明治疗有效含量的提取物或含该提取物的药物组合物，以治疗患者中与病理性新血管生成有关疾病的方法。本文所用“治疗”一词指减缓病理新血管生成相关症状，及减少新血管生成作用。此种疾病包括，但不局限于关节炎疾病、基于新血管的皮肤疾病、糖尿病性视网膜病、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相关的斑退化症、再狭窄症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤，角膜移值排斥、伤口肉芽作用、血管纤维瘤、欧斯勒-伟柏综合症、心肌血管生成作用、及硬皮症。关节炎疾病实例选自牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎及骨关节炎。对于治疗癌症及固体肿瘤而言，“治疗”包括抑制血管的生长，使得肿瘤和/或癌细胞生长时所需的营养物质缺乏。肿瘤及生成物减少，及可能消失不见。治疗关节炎疾病时，会减少软骨，特别是关节中血管的形成，使得这些区域移动性及灵活性增加。对于治疗牛皮癣，用药可减少皮肤性症状，诸如疙瘩、鳞片化及皮肤表面以下的可见血管。对于糖尿病性视网病而言，施用本发明活性级分可减少视网膜内多余血管的形成，产生非障碍性视觉。治疗卡波西氏肉瘤时，施用本发明级分可抑制血管的生长和/或血管的进一步形成，因此可抑制所产生的损伤和/或肿瘤。
当将该活性级分施予受体时，诸如小鼠、大鼠或人类患者，该级分可加至药学可接受的载体中，并以全身性、经口、经皮或局部投药方式施用于受体。治疗含量可根据经验确定，并可根据欲治疗的疾病、欲治疗的患者，及治疗方法所用活性级分的形式的毒性而调整。该活性级分可以经口、静脉内、经腹膜内或经皮方式传送。当投与动物时，该方法可进一步确认活性级分的有效性。
当以动物模式为实例时，裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各组皮下植入约105至约109本专利说明书所定义的病理细胞，当移植物建立后，在移植物周边以皮下注射施用该级分，提取物或化合物。利用游标测径器测定其移植物在二个维度上大小的减少，每周测定两次。
得自Jackson Labs(Maine)的MRL/Ipr小鼠(MRL/MpJ-Fas1pr)可用以测定或监控对关节炎疾病的效果。有效治疗效果包括减少动物关节处及后腿处的肿胀程度，及减少软骨退化程度，其可利用X-光监控。
在疗程中可以单一剂量、复剂量、持续或间断投药实现体内投药。决定最有效方式及投药剂量的方法为本领域所熟知，且可根据治疗所用的组合物、治疗目的、欲治疗的靶细胞及欲治疗的受体而调整。根据治疗医师所选定的剂量水平及形式进行单一剂量或复剂量投药。本专利说明书公开施用该活性级分的适当剂量的剂型及投药方法。
本发明组合物及药物组合物可用以制备药物和根据常规步骤施用诸如药物组合物中的活性成分治疗人类及其他动物。
该药物组合物可以经口、经鼻、经肠胃外或吸入疗法投药，且可为片剂、锭剂、颗粒、胶囊、药丸、安瓶、栓剂或气溶胶形式投药，其投药形式亦可为活性成分于水或非水稀释液的悬浮液、溶液及乳化液、糖浆、颗粒或粉末。除了本发明化合物以外，该药物组合物亦可含有其他药物活性成分。
更具体的是，通过适当的途径，包括经口、直肠、鼻腔、局部(包括经皮、气溶胶、口腔及舌下)、阴道、经肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内及皮内)及肺部，可施用该活性级分(也称活性成分)，以达治疗目的。需知优选途径根据疾病状况及患者年纪，及欲治疗的疾病而有所不同。
需知本发明活性级分的适当剂量视疾病的类型及严重性及时期而定，且患者与患者之间有所不同。最佳剂量根据治疗效益水平相对任何本发明疗法的风险及负面效果的平衡而确定。
理想的是，施用提取物(“药物”)或含它的组合物时，该活性化合物在疾病位点可达到最高浓度。例如，可通过静脉注射药物，可选盐水中，或以口服投药，例如以片剂、胶囊或含有活性成分的糖浆，而达到此目的。利用持续性输注，可维持所需血该药浓度，以便提供疾病组织中活性成分的治疗有效量。本发明亦包括操作性组合物的用途，治疗组合物中所需的每个成分药剂的总剂量低于当每种单个治疗化合物或药物单独使用时的所需剂量，因此，可以降低副作用。
虽然该药物成份可以单独施用，但优选施用至少含有一种上述定义的活性成分与一种或多种药学上可接受的载体及可选其他治疗药剂的药物制剂。所谓每种载体必须“可接受”指其须与剂型中其他成分相容，且不会对患者有害。
剂型包括适合以经口、直肠、鼻腔、局部(包括经皮、口腔及舌下)、阴道、经肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内及皮内)及肺部施用的剂型。剂型可以方便地以单位剂量形式存在，且可以药学领域中所熟知的方法制备。这些方法包括将活性成分与构成一种或多种附属成分的载体结合。一般而言，剂型以将活性成分与液态载体或微细固态载体或两者均质紧密结合而制备，而后若有需要可定型产品。
适合经口投药的本发明剂型可为单个单位形式，诸如胶囊、药丸或片剂，各含有事先确定含量的活性成分；可为粉末或颗粒；可为水或非水液体的溶液或悬浮液；或为水包油液态乳化液或油包水液态乳化液。活性成分亦可为大药丸、糖膏剂或糊剂形式。
可利用压缩作用或定模作用，可选与一或多种附属成分制成片剂。在适当的压缩机器中，压缩自由流动形式的活性成分，诸如粉末或颗粒，可选混有粘合剂(例如聚烯吡酮、明胶、羟基丙基甲基纤维素)、润仅剂、惰性稀释剂、防腐剂、分解剂(例如淀粉乙醇酸钠、交联聚烯吡酮、交联羧基甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂，制成压缩片剂。在适当的定模机器中，定模混有惰性液态稀释剂的粉末化合物后，可制成定模片剂，片剂可视情况包衣或蚀刻并配制成能提供使用时缓慢释放或控制释放活性成分的形式，例如，以各种比例的羟基丙基甲基纤维素提供所需的释放速度，片剂可视情况涂覆肠衣，以便在胃部以外的消化道释放。
适合口腔局部投药的剂型包括含有经调味基材，通常为蔗糖及阿拉伯胶或黄蓍胶调味的活性成分的糖锭；包含在惰性基材，诸如动物胶及甘油，或蔗糖及阿拉伯胶中含活性成分的软锭片；及在适当液态载体中含有活性成分的漱口水。
根据本发明适合局部投药的药物组合物可制成软膏、乳膏、悬浮液、乳液、粉末、溶液、贴片、凝胶、喷剂、气溶胶或油状物。或者，剂型可包括布条或崩带类药品，诸如浸渍活性成分及可选一或多种赋型剂或稀释剂的崩带或吸附性贴片。
对眼睛或其他外部组织，例如口腔及皮肤的疾病而言，剂型优选以含有活性成分的局部软膏或乳膏施用。当调配成软膏时，药物可与石蜡物质或与水易混合的软膏基材使用。或者，药物成分可以水包油乳膏基材调配成乳膏。
假若有需要，乳膏基材的水相可包括，例如，至少约30％重量/重量的多羟基醇，即，具有两个或多个羟基的醇类、诸如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油及聚乙二醇及其混合物。局部剂型可包括能增进活性级分吸收或经由皮肤或其他感染部件穿透的化合物，此种透皮促进剂的实例包括二甲基亚砜及相关的类似物。
本发明乳化液的油相包括任何已知方式的已知成分。虽然此相只包括乳化剂(或称为乳化药剂)，其可包括至少一种具有脂肪或油脂或两者的乳化剂。优选，亲水乳化剂与作为稳定剂的亲脂性乳化剂一起。优选包括油脂及脂肪。同时，含/不含稳定剂的乳化剂组成所谓的乳化蜡，而蜡与油脂和/或脂肪组成所谓的乳化软膏基材，其形成乳膏剂型的油状分散相。
适合用于本发明剂型的乳化剂及乳化稳定剂包括Tween 60、Span8、十六醇十八醇混合物、十四醇、单硬脂酸甘油酯及月桂硫酸钠。
选择适合于剂型的油脂或脂肪根据能够达成的所需化妆品特性而定，因为活性化合物在大级分可能用于药物乳化剂型的油脂中的溶解度相当低，因此，乳液优选为非-油腻性、非-染剂且可清洗掉的有适当稠度的产物，以避免自管状容器或其他容器中渗漏出来。可使用直键或支链，单元或双元烷基酯，诸如二-异已二酸酯，硬脂酸异十六酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，十四酸异丙酯，油酸癸酯，棕榈酸异丙酯，硬脂酸丁酯，棕榈酸2-乙基己酯，或已知为Crodamol CAP的支链酯的混合物。这些可根据所需要的特性单独使用或组合使用。或者，可以使用高熔点脂肪，诸如白软蜡和/或液态蜡或其他矿物油。
适合眼睛局部用药的剂型包括眼药水，其中活性成分溶解或悬浮于适当的载体中，特别是活性成分的水性溶剂。用于直肠用药的剂型可为含有适当基质的栓剂，例如包含可可油或水杨酸。
适合阴道用药的剂型可为子宫套、棉塞、乳液、凝胶、贴片、泡沫或喷雾剂型，除活性成分，尚可包括本领域中所熟知的适当载体。
载体为固体的适合鼻腔用药的剂型，包括具有颗粒大小，例如范围约20至约500微米的粗颗粒，其系以鼻吸入的方式投药，即将含有粉末的容器靠近鼻子后，快速的吸入而进入鼻腔通道。载体为液态的适合鼻腔用药的剂型，例如，鼻腔喷雾，鼻腔药水，或以喷鼻器施用的气溶胶，包括含有活性成分的水溶液或油脂溶液。
适合经肠胃外投药的剂型包括等张无菌注射用的水溶液或非水溶液，其可包含有抗-氧化剂，缓冲液，抑菌剂及使剂型与欲治疗受体血液等张的溶质；并且包括悬浮剂及粘稠剂，与设计为将化合物靶向血液成分或一或多种器官的脂质体或其他微颗粒系统的水性或非水性无菌悬浮液。剂型可置于单位剂量或多剂量密封容器，例如，安瓶及小瓶，可以冷冻干燥(冻干的)方式保存，在使用的前，只需加入无菌液态载体，例如注射用水即可。即时注射用溶液及悬浮液可从前述无菌粉末，颗粒及片剂种类制得。
优选的单位剂量剂型包括药剂成分的每日剂量或单位，每日次剂量(subdose)如本专利说明书前述，或其适当级分。其亦可包括额外的活性药剂，例如，抗-肿瘤，抗-癌，抗-血管生成药剂或免疫促进剂。
需知，除了前述所特别说明的成分外，本发明的剂型可包括有关剂型类型的本领域其他常规药剂，例如，适合口服者包括甜味剂，增稠剂及调味剂。
相同的提取物(“药剂”)或组合物亦可用为兽用型剂型，其可例如以本领域中常规的方法制备。
本发明进一步提供筛选用以抑制新血管生成或内皮细胞生长的治疗药剂的方法，筛选方法包括(a)将药剂与适当的细胞或组织样品接触；(b)将另一份适当的细胞或组织与治疗有效量的本发明提取物或含有该提取物的药学可接受组合物接触；及(c)比较步骤(a)样品的生长与步骤(b)样品的生长，其中生长抑制情况与步骤(b)样品相同或相似程度的任何步骤(a)的试剂为抑制新血管生成或内皮细胞生长的治疗药剂。
如本专利说明书所使用，适当的样品意指任何含有内皮细胞的样品。该方法可如本专利说明书所述在体外或体内实施。
本发明亦提供治疗受体病理性新血管生成相关疾病的试剂盒，该试剂盒包括治疗含量的提取物及使用说明书，该试剂盒可用以治疗关节炎疾病、基于新血管的皮肤病、糖尿病性视网膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相关的斑退化症、再狭窄症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移值排斥、伤口肉芽作用、血管纤维瘤、欧期勒-伟柏综合症、心肌血管生成作用、硬皮症、牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎及骨关节炎。
下列的实施例用以说明本发明，非限制本发明。
实施例材料下述方法采用下列材料。
将白花蛇舌草干燥植物均质化，并以热(80℃-90℃(Sigma)提取；醋酸钠(Sigma)；硫酸铵(Sigma)；盐酸(VWR科技公司)；磷酸酶底物(Sigma)；Sephadex G-25(Sigma)；及Triton X-100(Sigma)。
实施例1分离及纯化本发明提供数个从白花蛇舌草制备生物活性级分的方法的具体实施例。一方面(如图1所示)，该方法包括提取具有光学吸收值介于约210nm至约250nm的可溶级分AHD04。进一方面，该级分具有吸收值介于约220nm至240nm。进一方面，该活性级分的吸收值为约230nm。在进一方面，将植物的叶子和/或茎浸泡在热水(60℃及60℃以上任何温度，优选为90℃以上)，提取茶液并浓缩，获得EHDa。
实施例2以内皮细胞培养物(EGG)分析法测定对血管生成的抑制作用用以测定血管生成抑制作用的百分比的分析法是D.T.Connally，等人，(1986)Anal.Biochem.152136-4经(Liang及Wong(1999)ANGIOGENESISFROM THE MOLECULAR TO INTEGRATIVEPHARMACOLOGY，Maradoudakis编辑，Kluwer Academic/Plenum出版社，纽约)修饰过的变化方法，通过磷酸酶活性水平来测定细胞数目。将源自美国类型组织培养(ATTC)的CPAE(心肺动脉内皮细胞，牛)在培养基MEM-10E中生长至近95％汇合度。以0.25％胰蛋白酶将细胞从组织培养瓶上释放，将其接种在24-孔的组织培养盘中，密度为10000细胞/孔，细胞在37℃5.0％CO2培养箱中培养8小时，加入分析样品及对照，每个样品加至两个不同的孔中(100微升/孔)，以确保试验重复性。样品培养60小时后，吸出培养液，根据细胞酸性磷酸酶的呈色测定来测定细胞的数目。
实施例3细胞溶解/细胞毒性分析牛肺动脉内皮(CPAE)细胞接种在24孔的培养盘中，每个孔10000细胞。在37℃，5％CO2下生长培养约60小时，每个孔中加入样品一个剂量(约50微升至约100微升)，再培养30分钟。培养的后，以倒置显微镜并通过使用ECC分析法视检细胞的存在。这两种方法用以检测每个孔中是/否存在有内皮细胞，使用不含样品的对照细胞，其生长正常。
实施例4样品滴定分析为确定级分中是否有抗-血管生成活性，例如ADH04为剂量相关性，对内皮细胞进行滴定分析。制备浓度滴定自1.0毫克/毫升至0.00625毫克/毫升的样品，不同样品加至细胞中，空为对照组。结果示于表1(如下)。
表1不同浓度AHD04的血管生成抑制作用分析
实施例5抑制作用特异性为测定此抑制活性对内皮细胞是否具有特异性，用HEP-2细胞(分离自人类喉组织)作对照组的FCC分析法，结果显示HEP-2细胞对活性级分不敏感。
结果示于表2中。
表2
实施例6MMP分析P.C.Brooks，等人(1996)在“基质金属蛋白酶MMP-2通过与整合素ανβ3相互作用定位于侵害细胞表面”Cell85683-93中描述基质金属蛋白酶及αν/β3整合素相互作用的体外分析法。实验样品对MMP-2/ανβ3整合素复合物的效果确定该样品作用机制与是否血管生成途径这部分的任何破坏有关。这涉及测该实验样品是否可抑制MMP-2与ανβ3整合素的相互作用。开始时，以抗MMP-2抗体的ELISA进行，并测定这些抗体对样品的结合。另外研究是否会有阳性结果产生。已知为MMP-2天然抑制剂的TIMP-2(基质金属蛋白酶-2的组织抑制剂)为对照组。
实施例7内皮细胞管状物/中心管形成分析在冰冷的96-孔微量盘的每个孔中置入马萃胶(Matrigel)(10毫克/毫升浓度，60微升；Collaborative Lab#35423)，将微量盘置于室温下15分钟，而后在37℃培养30分钟，让马萃胶进行聚合化，同时，在EGM-2(Clonetic#CC3162)中制备HUVEC，浓度为2×105细胞/毫升，以相同的培养基制备2X所要浓度的测试化合物(5个浓度水平)。细胞(500微升)与2X级分或化合物(500微升)混合，将双份此200微升悬浮液置于聚合化的马萃胶上，培养24小时后，以Bioquant Image Analysis系统拍下每个浓度样品的情况，每个浓度拍三张。测定所形成小管/管状物长度及交接点数目，与未处理对照组比较而评估药效(IC50)。以TNP-470(NSC 642492)及紫杉醇(paclitaxel)(NSC125973)为参考化合物。
实施例8内皮细胞迁移分析利用48-孔Boyden盒子及8微米孔径大小胶原涂覆的(10微克/毫升老鼠尾部胶原；Collaborative Laboratories)聚碳酸滤膜(Osmonice公司)评估迁移。盒子底层孔只注入27-29微升DMEM培养基(基线)，或含有化学吸引物(bFGF，VEGF或Swiss3T3细胞条件化的培养基)的培养基。盒子上层加入在DMEM+1％BSA中制备的含/不含该级分或化合物的45微升HUVEC细胞悬浮液(1×106细胞/毫升)，在37℃下培养5小时后，滤膜以PBS润湿，固定，并在Diff-Quick溶液中染色。将迁移细胞朝下方式将滤膜置于玻璃片上，且以Kimwipe除去上面的细胞，该试验进行4-6个重复，每个孔计算五个视野。刺激对照组及以该级分或化合物处理的数值减去阴性未刺对照组数值，所得数据以平均迁移细胞±S.D作图，从所得图形数据计算出IC50。TNP-470(NSC642492)及紫杉醇(NSC125973)用为参考化合物。
为使本发明更为清楚，虽然前述发明以已利用说明及实施例进行了一定的详细说明，但对于本领域技术人员来说显然可以进行某些变化及修饰的技艺。例如，对于本领域技术人员来说，本发明方法可与一或多种已知抗-肿瘤、抗-血管生成或免疫增进治疗法及组合物组合，例如鲨鱼软骨，酪胺酸神经鞘胺醇或神经鞘胺醇。因此，本说明书及实施例不理解为用以限制所附权利要求限定的本发明范围。
权利要求
1.自白花蛇舌草(Hedyotis Diffusae)组合物中制备生物活性级分AHD04的方法，其包括提取光学吸收值介于约210nm至约250nm的级分。
2.自白花蛇舌草组合物中制备生物活性级分EHDa的方法，其包括将有效量的白花蛇舌草浸泡在有效量的热水中而获得液态提取物，并过滤提取物而获得EHDa的步骤。
3.权利要求第1项的方法，其包括步骤(a)将有效量白花蛇舌草浸泡于有效量热水中，获得液态提取物；(b)离心获得澄清的液态提取物；(c)干燥液态提取物并重悬浮于可接受的载体中，及(d)通过层析法获得效用级分，从而获得吸收值介于约210nm至约250nm的生物活性提取物AHD04。
4.由权利要求第1项的方法获得的生物活性提取物。
5.包含权利要求第4项的提取物及药物可接受载体的组合物。
6.权利要求第1项的组合物，进一步包含有效量的选自抗-血管生成剂、抗-肿瘤剂及免疫增进剂的药剂。
7.抑制内皮细胞生长的方法，其包括向细胞传送生长抑制含量的权利要求第4项的提取物。
8.抑制组织中血管生成的方法，其包括向组织中传送抗-血管生成含量的权利要求第4项的提取物。
9.治疗受体病理性新血管生成相关疾病的方法，其包括对受体施用治疗有效量的权利要求第4项的提取物。
10.权利要求第9项的方法，其中疾病选自癌症、关节炎疾病、基于新血管的皮肤疾病、糖尿病性视网膜病、再狭窄症、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相关的斑退化症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移值排斥、伤口肉芽作用、血管纤维瘤、欧斯勒-伟柏综合症、心肌血管生成作用、及硬皮症。
11.权利要求第10项的方法，其中疾病为关节炎疾病，选自牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎及骨关节炎。
12.权利要求第10项的方法，其中传送以经口、静脉内、腹膜内、及经皮方式实施。
13.权利要求第9项的方法，其中受体为动物。
14.权利要求第13项的方法，其中动物选自宠物、农场动物或人类患者。
15.权利要求第7、8或9项中任一项的方法，进一步包括对受体施用有效量的选自抗-血管生成剂、抗-肿瘤剂或免疫促进剂的药剂。
16.筛选可抑制新血管化或内皮细胞生长的治疗药剂的方法，其包括步骤(a)将药剂与适当的细胞或组织样品接触；(b)将另一份适当的细胞或组织与治疗有效量的权利要求第4项的本发明提取物接触；及(c)比较步骤(a)样品的生长与步骤(b)样品的生长，其中步骤(a)的生长抑制情况与步骤(b)样品具有相同或相似程度的任何药剂为抑制新血管生成或内皮细胞生长的治疗药剂。
17.权利要求第16项的方法，其中接触为体外或体内接触。
18.权利要求第16项的方法，进一步包括将步骤(b)样品与选自抗-血管生成剂、抗-肿瘤剂及免疫促进剂的药剂接触。
19.治疗宿主病理性新血管生成相关疾病的试剂盒，其包含治疗有效量的权利要求第4项的提取物及使用说明书。
20.权利要求第19项的试剂盒，其中疾病选自癌症、关节炎疾病、基于新血管的皮肤疾病、糖尿病性视网膜病、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相关的斑退化症、再狭窄症、毛细血管扩张、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、伤口肉芽作用、血管纤维瘤、欧斯勒-伟柏综合症、心肌血管生成作用、及硬皮症。
21.权利要求第20项的试剂盒，其中疾病是关节炎疾病，选自牛皮癣关节炎、类风湿性关节炎及骨关节炎。
全文摘要
本发明提供自白花蛇舌草提取出药物活性级分的方法；本发明提供通过传送生长抑制含量的本发明级分至细胞，而抑制内皮细胞生长的方法；本发明亦提供通过传送抗－血管生成作用含量的本发明级分至组织中，而抑制组织中血管生成的方法；本发明亦提治疗各种疾病的方法，包括癌症。
文档编号A61P17/02GK1499979SQ01822410
公开日2004年5月26日 申请日期2001年12月12日 优先权日2000年12月13日
发明者汪建平 申请人:维克沃姆有限公司