一种中药组合物在制备治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用的制作方法

专利名称：：一种中药组合物在制备治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种中药组合物的新用途，具体地，本发明涉及一种中药组合物在制备治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用，属中药应用领域。
背景技术：
：糖尿病性心肌病(diabeticcardiomyopathy,DC)是指糖尿病患者心肌细胞原发性损伤引起广泛的结构异常，最终引起心室肥厚、舒张期和(或)收縮期功能障碍的一种疾病状态[SajadA,Billal,RajdeepS,etal.Diabeticcardiomyopathy:mechanism,diagnosisandtreatment.ClinSci，2004，107:539-557.(糖尿病性心肌病机制，诊断与治疗.临床科学，2004,107:539-557.)]，由鲁伯乐(Rubier)等于1972年首先提出。近年大量研究证实糖尿病性心肌病是一种独立的病理生理状态，微血管病变是糖尿病心肌病变发生、发展的重要原因之一，其发生与冠状动脉供血障碍无关。以由舒张期和(或)收縮期功能障碍导致的充血性心力衰竭为主要临床表现，病理上出现心肌细胞凋亡或坏死等现象。本病发病机制还不十分清楚，尚缺乏特异性治疗方法。相关研究表明，糖尿病微血管并发症的发生是由持续存在的刺激启动了机体不可逆的、程序性的细胞功能改变与病理状态下的基因表达改变。迟发的、稳定的基因表达改变是慢性并发症发生的重要分子基础。随着统一发病机制被广泛接受，氧化应激机制与抗氧化治疗成为糖尿病及糖尿病微血管并发症的重点。大量研究证实高糖引起机体活性氧簇(ROS)生成增加，最终导致各种组织氧化应激损伤的发生。在缺乏抗氧化物的有效补充的情况下，氧化应激逐渐加重，进一步导致各种应激相关细胞内信号转导系统的激活。因此ROS可通过氧化应激直接损伤靶器官。已经证实糖尿病病人和糖尿病动物模型中均存在氧化应激。正常情况下，自由基的产生和消除处于动态平衡，对机体没有损伤。但是在糖尿病状态下，葡萄糖及糖化蛋白氧化致体内自由基及其产物增多，同时伴有机体抗氧化能力降低(如血中抗氧化剂维生素C、维生素E、辅酶Q10及硒水平降低，抗氧化物酶如SOD、GSH-P等活性下降)导致氧自由基清除障碍，机体氧化应激增加，自由基在体内过度聚集，破坏细胞膜的稳定性，引起机体组织损伤。近年的研究表明，氧化应激与心肌细胞凋亡有着极其密切的关系。ROS可作为促凋亡的第二信使，增加线粒体内膜穿透性，使线粒体膜电位下降，当膜电位的下降成为不可逆时，细胞色素C释放入胞质。线粒体内细胞色素C(Cytc)释放是激活半胱天冬酶(caspase)启动细胞凋亡信号传导的关键通路。本发明是在第01131203.3号和第200410048292.2号专利的基础上进行的改进发明，在此全文引用该两专利文件记载的内容。上述两项专利未公开该中药组合物在治疗糖尿病性心肌病的应用。本发明在其基础上进行了相关研究，提供了该中药组合物在制备治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用。
发明内容本发明目的是提供一种中药组合物在制备治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成人参3-10水蛭3-11土鳖虫5-10乳香(制)1-5赤芍3-9降香l-5檀香l-5全蝎3-9蝉蜕3-12蜈蚣l-3冰片l-7酸枣仁(炒)3-10;优选地，该中药组合物由如下重量份的原料药制成或:或:人参6檀香2人参10檀香2人参6檀香2水蛭10全蝎7水蛭8全蝎9水蛭11全蝎3土鳖虫7土鳖虫7土鳖虫7蝉蜕7乳香(制)2蜈蚣l冰片5乳香(制)2蜈蚣1冰片赤芍5降香2酸枣仁(炒)5;赤芍5降香2;酸枣仁(炒)5;乳香(制)2赤芍5降香2蜈蚣1冰片5酸枣仁(炒)5;更优选地，上述中药组合物的活性成分由下列成分组成:a平均粒径小于100pm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及制乳香药粉；b冰片药粉；c由降香和檀香提取的挥发油；d人参用乙醇提取后的醇提液经浓縮后的醇提浸膏；e提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和炒酸麥仁加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓縮成的水提浸膏。本发明还公开了含有上述中药组合物作为活性组分的药物制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。本发明还提供了该中药组合物在制备减少心肌细胞凋亡，上调糖尿病患者心肌组织物质代谢相关基因和细胞骨架相关基因药物中的应用。本发明还提供了该中药组合物在制备糖尿病患者心肌保护药物中的应用。本发明中药组合物中，作为活性组分的原料药的拉丁名及其加工方法来自《中药大辞典》(1977年7月，第一版，上海科学技术出版社)和《中国药典》(2005年版，化学工业出版社)。本发明中药组合物还可以按常规的提取和制剂工艺，例如，范碧亭《中药药剂学》(上海科学出版社1997年12月第1版)记载的制备工艺，制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂等。本发明的应用中，所述中药组合物为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂制剂中的一种，为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯垸酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括硬脂酸镁、十二烷基硫酵钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯垸酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括甜味剂及各种香精；防腐剂包括尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括PEG6000，PEG4000，虫蜡等。本发明制剂优选通过以下制备方法制成将上述配比的水蛭、全蝎、蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣等五味药洗净，低温烘干，备用；檀香、降香提取挥发油，药渣及水溶液备用；人参用70%乙醇加热回流提取二次，第一次3小时，第二次2小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味；人参药渣与檀香、降香的药渣以水溶液合并，加入赤芍、酸枣仁(炒)，加水煎煮二次，第一次3小时，第二次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓縮至相对密度为1.20-1.25(60°C)的清膏，加入上述人参醇提液，混匀，低温干燥，粉碎成细粉；乳香(制)与水蛭等五味共粉碎成细粉；冰片研细，分别与上述细粉配研，混匀，喷入挥发油，混匀，装入胶囊，即得。或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成a)原料药的重量比为人参3-10份、水蛭3-ll份、土鳖虫5-10份、制乳香l-5份、赤芍3-9份、降香l-5份、檀香l-5份、全蝎3-9份、蝉蜕3-12份、蜈虫公l-3份、冰片l-7份、炒酸枣仁3-10份；b)药材粉碎工艺将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于IOO^m;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；c)提取浓縮和干燥工艺降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸麥仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓縮成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓縮成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓縮成水提浸膏；d)制剂工艺在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤C)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。或者，本发明制剂优选通过以下制备方法制成a)原料药的重量比为人参3-10份、水蛭3-ll份、土鳖虫5-10份、乳香(制)l-5份、赤芍3-9份、降香l-5份、檀香l-5份、全蝎3-9份、蝉蜕3-12份、蜈蚣l-3份、冰片l-7份、炒酸枣仁3-10份；b)药材粉碎工艺将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于IOO待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；c)提取浓縮和干燥工艺降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸麥仁加水煎煮，水提液过滤后，待浓縮成浸膏；人参用乙醇提取后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓縮成醇提浸膏，水提液过滤与所有的水提液混匀后浓縮成水提浸膏，将浸膏直接喷雾干燥成喷雾粉；d)制剂工艺将超微粉碎粉与步骤c)所得喷雾干燥粉一起加到沸腾制粒干燥机中，再喷溶媒制成颗粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成胶囊。本发明药物是由人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、赤芍、蝉蜕等组成的复方制剂，本发明药物可使心肌细胞活力上升，S0D2mRNA表达增加，对糖尿病心肌病变有一定保护作用，本发明药物可以纠正糖代谢、蛋白质代谢，增强抗氧化能力，抑制凋亡等方面发挥作用，本发明药物干预后细胞凋亡减轻，提示这些药物有抗凋亡作用。本发明药物组合物的用量，折算成原料药材的重量，为每次0.8-3克，每日服用2-4次，优选为每次l.ll-2.22克，每日服用三次。图l:各组心肌细胞SOD2mRNA表达(**P<0.01与NG组对比；##P<0.01与HG组对比)图2:半定量RT-PCR检测各组心肌细胞SOD2mRNA表达电泳结果图3:正常对照组(CN组)大鼠心脏透射电镜照片(X10000倍)图4:糖尿病组(DM组)大鼠心脏透射电镜照片(X10000倍)图5:本发明药物组(TLR组)大鼠心脏透射电镜照片(X10000倍)图6:各组大鼠心肌细胞凋亡系数比较图7:正常对照组(CN组)大鼠心肌TUNEL染色(X400倍)图8:糖尿病组(DM组)大鼠心肌TUNEL染色(X400倍)图9:本发明药物组(TLR2组)大鼠心肌TUNEL染色(X400倍)图10:总RNA琼脂糖凝胶电泳图图lh糖尿病组和正常对照组大鼠心肌基因芯片平均信号强度图12:本发明药物组和正常对照组大鼠心肌基因芯片平均信号强度图13:本发明药物组和糖尿病组大鼠心肌基因芯片平均信号强度图14:Illumina光纤微珠芯片信号表达图(局部)图15:大鼠心肌组织泛素D表达RT-PCR检测结果图16:大鼠心肌组织泛素D表达电泳图具体实施例方式实施例1:a)原料药配方为人参39.6g水蛭72.6g土鳖虫46.2g乳香(制)13.2g赤芍33g降香13.2g檀香13.2g全蝎19.8g蝉蛻46.2g蜈蚣6.6g冰片33g酸枣仁(炒)33g;b)药材粉碎工艺将全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五种虫药经净选、水洗处理后和净选炮制后的制乳香按处方配料，由粉碎机进行粉碎，药粉细度达到80目以上;粗粉后的药粉经各种超微粉碎技术进行超微粉碎，使药粉平均粒径小于30-40fim;待粉碎的药材经清洗烘干灭菌后，配料；c)提取浓縮和干燥工艺降香和檀香先加水提取挥发油后再用水提取，赤芍和酸枣仁加适量水煎煮二次，每次3小时，合并水提液，过滤后，待浓縮成浸膏；人参用适量70%的乙醇提取二次，每次3小时，合并提取液，回收乙醇至无醇味，再用水提取，醇提液浓縮成相对密度为0.91.1(6(TC)醇提浸膏，水提液过滤与上述所有水提液混匀后浓縮至相对密度为0.91.1(60。C)的清膏，备用；d)制剂工艺在沸腾制粒干燥机中加入超微粉碎粉，再将步骤c)所得提取浸膏喷入制粒；将制成的颗粒经整粒，加入冰片细粉，喷入由降香和檀香提取的挥发油，混匀后由胶囊充填机充填，制成1000粒胶囊。本发明药物的用量，为每次2-4粒，每日服用三次。为阐明本发明中药组合物对糖尿病性心肌病的治疗活性，用按上述实施例l方法制得的胶囊剂内容物细粉(以下称本发明药物)进行了下列试验以证明其疗效，但其不能对本发明的范围构成任何限制。实验例一、本发明药物对高糖诱导的乳鼠心肌细胞的保护作用材料与方法l.l材料l.l.l实验动物出生2天的SD大鼠，雌雄不拘，由第二军医大学动物实验中心提供。1.1.2主要药品和试剂DMEM培养基(美国GibcoBRL公司产品)、MTT试剂和胰蛋白酶(美国Sigma公司产品)、小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、本发明药物(石家庄以岭药业股份有限公司提供)、TRIzd试剂(Invitrogenlifetechnology公司产品)、TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0(宝生物工程(大连)有限公司)1.1.3主要仪器与设备MOC-15AC二氧化碳孵箱(日本Sanyo公司)、倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、44175-00震荡混合仪(美国Cole-Parmer公司)、UV-2401PC紫外分光光度计(Shimadzu公司)、荧光定量PCR仪(MJResearch公司)、Power/Pac300电泳仪(美国Bio-Rad公司)、复日FR-980生物电泳图像分析系统(上海复日生物实验技术公司)1.2方法1.2.1本发明药物水提物的制备分析天平准确称量100g本发明药物超细粉末，置于烧杯中，加入500毫升双蒸水(长海医院制剂室提供)，冷浸12小时，将药汤加入旋转蒸发仪中，再加入500毫升双蒸水，减压蒸发，蒸发至药液呈膏状，转移至蒸发皿中，在80摄氏度下浓縮，至大约100毫升。取出。准确量取lml本发明药物水提取物，计算初始浓度，余液4'C保存备用。将lml提取物根据初始浓度稀释至100mg/ml，用0.22um孔径滤膜过滤除菌消毒，成无菌液体。将100mg/ml液体稀释为10mg/ml，用100mg/ml~0.01mg/ml共5个浓度加入心肌细胞培养液中，培养48h，用MTT法测光密度检查细胞存活率，选取生存率>95%的最大浓度为培养浓度。1.2.2体外乳鼠心肌细胞原代培养取出生2天的SD大鼠乳鼠，引颈法处死动物，然后将其整个浸入盛有75。/。酒精的烧杯中5min，取出用无菌纸擦干，在无菌的条件下，开胸取出心脏，放入盛有无血清培养液的冰冷容器，移入超净工作台。用D-Hanks液冲洗3次后剪成约lmm3大小的碎块，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，消化完毕后60min差速贴壁法纯化心肌细胞。取已纯化的细胞，加入体积分数为0.15的小牛血清，0.84的DMEM培养基，及0.01的双抗液(含100U/ml青霉素，100U/ml链霉素)的培养基，吹打均匀后以1X104/孔的密度接种于24孔培养板，送入通以体积分数为0.05CO2及0.95空气的二氧化碳孵箱中培养。1.2.3实验分组及给药方法常规培养心肌细胞48h后，换液为无血清的DMEM培养基。将24孔培养板上的细胞每6孔分为一组，共分4组，换培养基的同时给药，每组给药如下第l组为正常对照组(CN组)，培养基中含葡萄糖5.5mmol/L(NG组)；第2组为给予25mmol/L葡萄糖的高糖组(HG组)；第3组为在第2组基础上加入浓度为lmg/ml的本发明药物组(TLR组)；给药48h后进行各项指标的测定。1.2.4MTT比色实验(1)设空白对照与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。其他实验步骤完全相同。最后比色时，以空白孔调零。(2)呈色培养48h后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)2(Vl，37。C继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150pl二甲基亚砜，振荡10min，使甲臜充分溶解。(3)比色选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。1.2.5RT-PCR法检测心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD2)mRNA的表达(1)实验分组心肌细胞纯化后以lX106/皿接种于6cm培养皿，每组给药如下第l组为正常对照组(CN组)，培养基中含葡萄糖5.5mmol/L(NG组)；第2组为给予25mmol/L葡萄糖的高糖组(HG组)；第3组为在第2组基础上加入浓度为lmg/ml的本发明药物组(TLR组)；给药48h终止培养。(2)总RNA的提取1)将培养皿置于冰上，小心吸取培养液。加入lmlTrizol试剂反复吹打。2)将细胞裂解液转移至新的1.5mlEppendor滑中，室温放置5min。3)加入0.2ml氯仿，盖紧后，手摇剧烈混匀15秒。4)室温放置2-3min。5)12,000rpm，4。C离心15min。6)可见上层水相，中间混合相，下层酚相。吸取水相，转至新Eppendorf管中，约O.5ml。7)加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。8)12，OOOrpm，4。C离心10min。9)吸去液体可见白色沉淀，加入75%乙醇1ml，用漩涡混合器剧烈混匀。10)9000rpm，4。C离心5min。11)吸去液体，真空干燥5min。12)溶于DEPC处理水中，约25pl，60°C10min。(3)RNA纯度与完整性鉴定1)取少量提取好的RNA，紫外分光光度计测定260nm和280nm处读数(即OD260和OD280)，计算所获RNA样品的纯度。以OD260/OD280比值确定RNA纯度，比值应在1.82.0范围内。OD260值为1的RNA溶液约含有40吗/ml。因此样品RNA浓度二稀释比例xOD260值x40吗/ml。RNA总量Oig)二RNA浓度X总体积(ml)2)琼脂糖电泳分析RNA的完整性用DEPC处理水制备l%琼脂糖胶30ml，微波炉加热沸腾，见琼脂糖溶解，室温冷却至60。C，加入3ml的10XMOPS，1.6ml去离子甲酰胺，制胶，放置梳子。胶凝固后，加入IXMOPS电泳缓冲液。5-10昭RNA样品，加入加样缓冲液，共10pl，60。C5min,加入l^il溴化乙锭，离心后加入梳孔开始走胶，由负极走向正极，l-5V/cm。当溴酚蓝走至胶边缘后，紫外灯下观察RNA样品。经过变性RNA琼脂糖凝胶电泳可分离RNA，用溴化乙锭染色后在紫外灯下观察RNA条带。28S和18S比值应在2:1。(4)引物设计与合成引物设计在GenBank中确定大鼠SOD2和(3-actin的基因序列，将各自的一对引物输入，确定引物正确。同时遵循引物设计的一般原则，如引物长度在18-25bp，一对引物的两个引物长度差异小于3bp;基本成分G+C的含量为40%-60%，引物自身不应有反向重复序列或大于3bp的自身互补序列，以免自身折叠形成发夹结构，影响引物与待增靶序列的杂交结合。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表l:_表l大鼠P-actii^QSOD2mRNA寡核苷酸引物序列_GenBank序列号引物序列PCR产物长度卩actin~NM一031144正义5'-GCCCTAGACTTCGAGC陽3'212bp反义5'-CGGATGTCAACGTCAC-3'SOD2NM—017051正义5'曙GGCCAAGGGAGATGTTACAA-3'149bp反义5'-GCTTGATAGCCTCCAGCAAC-3'(5)反转录扩增cDNA1)RNA和反转录引物的混合的变性混合RNA模板及cDNA引物，用预冷的DEPC水补足体积至IOpl/反应。反应体系如下RNA2jigRandomprimer1DEPC水_Zjig终体积10|il盖紧离心管，70°C，5min，立即置于冰浴5min，短暂离心，冰浴备用。2)反转录按以下顺序加入各反应试剂并混匀，置于冰浴上①DEPC水17pl、5xRT缓冲液(buffer)8pl、dNTP混合液，10mM各2(J、核糖核酸酶抑制剂(RNasinRibonucleaseInhibitor)lpl、M-MLVRTaseH—2ji1，终体积共30pl。在30(xl混合液与10plRNA模板和引物混合液混合。②模板和引物退火，条件25°C，5min;③cDNA链合成，条件42°C，lhr;反转录酶灭活，条件70°C，15min;⑤保存于-2(TC按照以下配制PCR反应液①cDNA2pl、10xPCR缓冲液(含Mg2+)5|til、Forward引物(10pmol/|il)l(il、Reverse引物(10pmol/pl)1|al、dNTP混合物(2.5mMeach)4高保真Taq聚合酶(HighfidelityTaqpolymerase)0.75^1、ddH2036.25pi，总体积共50|il②94°C，2min③94°C，15sec;55°C，30sec;72°C，45sec(x35cycles)④72°C，7min◎10°C，终止(6)扩增产物的分析配制1%琼脂糖，凝胶电泳分离鉴定目的片段。(凝胶溴化乙锭终浓度为0.5ug/ml，缓冲液0.5XTAE)，取扩增产物10pl，加入溴酚蓝电泳液2inl，混匀后上样，水平槽电泳30分钟，电泳条件为80V、70mA、5W，凝胶长10cm。紫外灯下观察结果，采用复日FR-980生物电泳图像分析系统进行图像扫描和分析。对PCR电泳条带进行计算机灰度扫描，以每例组织电泳带面积灰度值与P-actin电泳带面积灰度值之比作为该例标本目的基因表达的相对值。(7)统计分析实验数据用均数土标准差表示，实验数据为重复3次结果取平均值，方差齐性检验后，组间差异用单因素方差分析比较，确定存在统计学差异后，组间均数用LSD法进一步比较。结果1心肌细胞的形态学观察在倒置显微镜下可见刚分离出的心肌细胞呈透亮的、较小的圆形细胞，在2-3小时以后逐渐贴壁并变大，于培养数小时或次日出现自发性节律收縮，频率20-100余次/分不等，细胞形态呈不规则多边形，细胞可伸出伪足，细胞核较大，l-2个不等，心肌细胞易出现聚集成团的现象，镜下观察这些细胞搏动同步一致。三组不同处理细胞放大400倍在光镜下未发现形态学明显改变。2心肌细胞MTT比色实验结果对不同处理的心肌细胞培养48h后MTT比色实验的OD值进行统计分析，与NG组相比，其余三个干预组的OD值均显著下降，存在统计学差异(P<0.01);TLR组OD值较HG组升高，存在统计学差异(P<0.01)。见表2表2不同处理下心肌细胞MTT实验结果(f±S)组别OD值NG0.67±0.024TLR0.47±0.036**aaHG0.39士0.0295^**尸<0.01与正常组对比；aa尸<0.01与高糖组对比3用Trizol试剂抽提总RNA，1X琼脂糖凝胶电泳了解总RNA的完整性可见各组样品均呈现18s和28s两条清晰条带，说明总RNA完整性较好。紫外分光光度计测定，以OD260/OD280比值确定RNA纯度，各组样品比值均在1.82.0范围内。4各组心肌细胞SOD2mRNA表达半定量结果与NG组相比，HG组和TLR组SOD2mRNA/P-actinmRNA灰度比值表达均明显下降，有统计学意义(P〈0.01);TLR组SOD2mRNA/P-actinmRNA灰度比值表达较HG组上升，差异有统计学意义(P<0.01)，见图1，电泳结果见图2。二、本发明药物对糖尿病心肌病变大鼠心肌形态学变化的作用1材料与方法1.1材料1.1.l实验动物SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠共56只，体重160-180克，6周龄，购自第二军医大学动物实验中心。1.1.2药物与试剂本发明药物(石家庄以岭药业股份有限公司)、甘油三酯测试盒、总胆固醇测试盒、丙二醇测试盒、肌酐测试盒(南京建成生物工程研究所产品)TUNELAP试剂盒(cat#1584809)(罗氏公司产品)。1.1.3主要仪器与设备722s可见分光光度仪(上海精密科学仪器有限公司)、日立H-800型透射电子显微镜(日本日立公司)1.2方法1.2.1药物配制方法将本发明药物药粉直接溶于双蒸水，再加入乙醇调节溶质成分，按本发明药物1.0g/kg/d浓度灌胃，含乙醇浓度2%。对照溶剂以双蒸水稀释无水乙醇至2°/。乙醇。1.2.2STZ糖尿病大鼠模型建立与分组SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠，6周龄，56只，体重160到180克。购进后普通饲料适应性喂养3天，随机分为二组对照组(CN)8只，模型组48只。禁食12小时后模型组以65mg/kg的剂量腹腔注射STZ(PH=4.5的O.lmol/L无菌拧檬酸盐缓冲液用前新鲜配制)，对照组同时腹腔注射等体积的上述缓冲液作为对照。于注射STZ后第3天，用罗氏优势型快速血糖仪检测大鼠尾尖血，以随机血糖持续》16.7mmol/L的大鼠确定为建模成功。根据血糖对造模成功大鼠使用随机表进行随机实验分组，共分为3组,每组8只糖尿病组DM对照溶剂每日一次灌胃本发明药物处理组TLR1.0g/kg/d,每日一次灌胃正常对照组CN对照溶剂每日一次灌胃所有大鼠均饲养在清洁级环境下，给予普通饲料喂养(蛋白质21%，脂肪4.5%，碳水化合物62.6%，包括纤维素在内的其他成分11.9°/。，按重量百分比计算)，自由摄食饮水，饲养环境为每笼4只，人工光循环，一天中光照黑暗时间为12h/12h,温度为21±2°C，湿度为55±2%，实验期间监测尾尖血血糖和体重，根据血糖体重情况，皮下注射长效胰岛素l-2IU/d。实验持续时间为12周。1.2.3标本收集与代谢指标检测(1)一般情况体重每周测量记录大鼠体重，每只大鼠置于称重仪上读数，精确到克。血糖尾静脉采血，用罗氏优势型血糖仪及血糖试纸监测血糖水平。(2)形态学指标实验12周末，大鼠空腹24小时，用10。/。水合氯醛3.2ml/kg腹腔注射麻醉后放血处死，迅速打开胸腔，可见大鼠心脏仍呈窦性搏动，自主动脉根部游离整个心脏，迅速移入预冷的生理盐水漂洗血液，取出吸干后迅速在分析天平上称重，精确至0.0001g。迅速移入盛有DEPC水的玻璃皿中，下面垫冰块。用锋利剪刀剪开心脏，取100mg左心室心肌组织放入冻存管，迅速投入液氮中速冻保存。取lmmS左心室心肌组织投入4n/。多聚甲醛固定液中，按电镜标本制作要求进行固定、包埋、修块、制备超薄切片、染色等操作，用日立H-800透射电镜观察细胞超微图像并摄片。(3)血生化指标大鼠麻醉后腹主静脉取血，放血处死。血甘油三酯、总胆固醇、肌酐、丙二醛浓度按测试盒说明书操作。(4)心肌细胞凋亡检测心肌组织经10%中性福尔马林缓冲液固定后，用自来水浸泡12小时，浸泡过程中多次换水。乙醇梯度脱水(75%-80%-95%-无水乙醇)，二甲苯透明、浸蜡包埋，制成蜡块，切成片厚约3um的连续切片，置6(TC烤箱中烘干备用。流程如下①4pm石蜡切片常规脱蜡至水②PBS洗，三次，每次3min③3。/。H2O2室温下处理20min，④蛋白酶K20)ig/ml在37°C消化20min⑤PBS洗，三次，每次3minTUNEL混合液A液lmlTDTBufferxl+10)ilTDTB液10(xlbiotin-dNTP①A、B二液混合，3(HU/每片，37。C作用lh②PBS洗，三次，每次3min③Streptavidin-HRP(1:200)37。C作用30minPBS洗，三次，每次3min⑤0.04。/。DAB+0.03。/。H2O2显色10min，水洗◎苏木素衬染lmin，水洗蓝化⑦吹干后常规树脂封片观察细胞核内棕色颗粒为阳性。凋亡指数(apoptosisindex,AI)为计数1000个细胞凋亡细胞所占的百分比。每张切片选取5个高倍镜视野，使用ImagePro—Plus系统计算凋亡指数。(5)统计学处理所有数据用均数士标准差表示，经方差齐性检验后组间差异比较采用单因素方差分析，经检验存在差异后采用LSD法检验组间差异。应用SPSS10.0软件包进行分析。2.结果2.1—般情况及生化检查结果与CN组大鼠相比，STZ诱导的糖尿病大鼠均有明显多饮、多食、多尿症状，体型小，毛色差，活力下降。与CN组相比，模型组血糖水平均显著升高(PO.01)。与CN组相比，DM组Tch升高(P<0.01)，TLR组Tch升高(P<0.05)，差异有统计学意义。DM组TG显著高于CN组(P<0.01)，TLRTG与CN组相比均无统计学意义(P〉0.05);与DM组相比TLR组TG明显下降，差异有统计学意义(PO.01)。与CN组相比，DM组大鼠血清肌酐明显上升(P<0.01)，TLR组肌酐水平上升(P0.05)，存在统计学差异；与DM组相比，TLR组肌酐明显下降(PO.01)(P<0.05)。DM组MDA显著高于CN组(P<0.01)，TLRMDA与CN组相比均无统计学意义(P>0.05);与DM组相比ALA组MDA明显下降(PO.01)，TLR组也下降，差异有统计学意义(P〈0.05)。见表3表3各组大鼠血生化指标比较(I±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>P<0.05，**P<0.01与正常组对比；aP<0.05，mP<50.01与糖尿病组对比2.2心脏形态学观察2.2.1心重/体重与CN组大鼠相比，DM、TLR组大鼠体重均显著降低(PO.01);与CN组大鼠心脏重量相比，DM组大鼠心重明显下降(PO.Ol)，有统计学意义。与CN组大鼠比较，模型组大鼠心脏/体重比值均升高，TLR组明显上升(PO.Ol);与DM组大鼠相比，TLR组心脏/体重比显著上升(P<0.05)，有统计学意义。见表4。表4各组大鼠心脏体重比较(X士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>2.2.2电镜结果电镜下可见CN组大鼠心肌细胞线粒体形态完整，嵴呈平行排列，肌丝结构清晰，闰盘结构正常(图3)。DM组大鼠心肌细胞存在明显的超微结构的改变，主要表现为肌丝排列紊乱、扭曲；线粒体出现肿胀变形，原本平行排列的嵴成花环状排列，有些嵴断裂，基底空化，并可见部分线粒体内出现空泡化(图4)。这些超微结构的改变，是糖尿病心肌病变重要特征。TLR组电镜下可见部分线粒体肿胀，嵴紊乱，部分肌丝扭曲(图5)。CN组大鼠胸主动脉内皮表面光滑，相邻细胞间连接紧密。DM组大鼠内皮细胞肿胀，细胞排列紊乱，细胞向血管腔突起至内皮表面凸凹不平，相邻细胞间不再呈紧密连接，内皮通透性增高，细胞表面粗糙，血管内皮细胞的细胞膜有破损，未见明显脂质结晶。TLR组病变程度则明显改善，细胞肿胀减轻，细胞间排列近正常，相邻细胞排列尚紧密，但仍有细小缝隙，膜破损明显减轻。2.3心肌细胞凋亡结果DM组阳性染色细胞数最多，CN组阳性染色细胞数目最少，两组比较有统计学意义(P<0.01)，TLR组阳性染色细胞数较DM组明显减少，有统计学意义(P0.05)。见图6。各组心肌细胞TUNEL染色图见图7—9。三、本发明药物对糖尿病大鼠心肌组织基因表达谱变化的干预作用1.材料与方法1.1材料1.1.1实验动物SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠共56只，体重160-180克，6周龄，购自第二军医大学动物实验中心。造模方法同实验二。糖尿病组DM对照溶剂每日一次灌胃本发明药物处理组TLR1.0g/kg/d，每日一次灌胃正常对照组CN对照溶剂每日一次灌胃根据血糖对造模成功大鼠使用随机表进行随机实验分组，共分为3组，每组8只1.1.2主要试剂Trizol总RNA抽提试剂(Invitrogen公司产品)、大鼠全基因组Illumina芯片(RatRef_12—v1—11222119A)(上海博星基因芯片有限公司)、AmbionIlluminaRNA扩增试剂盒(cat存1755)(上海博星基因芯片有限公司)、TaKaRaRNAPCR试剂盒Ver.3.0(CodeNo.:DRR019A)(大连宝生物工程有限公司)，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，限制性内切酶SfiI，Notl，HindIII，XhoI(NewEnglandBiolabs)、T4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)、高保真Taq聚合酶(HighfidelityTaq)(Roche公司)、琼脂糖(上海生工生物工程技术服务公司)。1.1.3主要仪器紫外分光光度计(GeneQuantpro公司)、荧光定量PCR仪(MJResearch公司)、CA950-2超净工作台(上海净化仪器厂)、5810R台式低温离心机(德国Eppendorf公司)、复日FR-280电泳仪(上海复日生物实验技术公司)、复日FR-980生物电泳图像分析系统(上海复日生物实验技术公司)、BeadArray芯片扫描仪(Illumina公司)、BeadStation500System图像分析系统(Illumina公司)。1.2方法1.2.1基因表达芯片检测方法(1)总RNA的提取取DM、TLR、CN组大鼠各3只，麻醉后放血处死，迅速打开胸腔，可见大鼠心脏仍呈窦性搏动，迅速取下心脏移入盛有DEPC水的玻璃皿中，下面垫冰块。用锋利剪刀剪开心脏，取100mg左心室心肌组织放入冻存管，迅速投入液氮中保存。从液氮中取出心肌组织加入lmlTrizol试剂，使用电动匀浆器反复匀浆。将细胞裂解液转移至新的1.5mlEppendorf管中，室温放置5min，加入0.2ml氯仿，盖紧后，剧烈混匀15sec，室温放置2-3min。12,000rpm，4t离心15min，可见上层水相，中间混合相，下层酚相。小心吸取水相，转至新Eppendorf管中，约0.5ml，加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。12，000rpm，4。C离心10min。吸去液体可见白色沉淀，加入75。/。乙醇lml，用漩涡混合器剧烈混匀。9000rpm，4。C离心5min。吸去液体，真空干燥5min。溶于DEPC处理水中，约25(^1，60°C10min。(2)RNA质检紫外分光光度计测定260nm和280nm处读数，计算所获RNA样品的含量、纯度。样品RNA浓度=稀释比例XOD260X40ug/ml。以OD260/OD280比值确定RNA纯度，比值应在1.72.0范围内。1%琼脂糖电泳分析RNA的完整性，28S和18S比值应在2:1。(3)RNA线性扩增采用AmbionllluminaRNAAmplificationKit，按试剂盒步骤进行。(4)芯片杂交将样品与杂交试剂混合后加入芯片，杂交舱58'C孵育16-22h，用无RNA酶水和乙醇清洗芯片，用Streptavidin-Cy3染色检测，清洗芯片,离心干燥。(5)芯片扫描用IlluminaBeadChipReader读取图像(6)数据分析用IlluminaBeadStudioApplication进行数据分析，两样本差异分值大于20为基因表达上调，小于20为基因表达下调。1.2.2RT-PCR法检测心肌细胞泛素DmRNA的表达上述7组大鼠，每组8只，动物饲养和处死同第二部分。取大鼠左心室心肌组织100mg，放入标记好的冻存管，投入液氮速冻保存。(1)引物设计与合成根据基因芯片结果，选择检测泛素D(UbiquitinD,UbD)mRNA表达验证芯片结果。引物设计在GenBank中确定大鼠UbD和(3-actin的基因序列，将各自的一对引物输入，确定引物正确。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，见表5:表5大鼠P-actin和UbmRNA寡核苷酸引物序列~~GenBank序列号引物序列PCR产物长度卩-actinNM一031144正义5'-GCCCTAGACTTCGAGC-3'212bp反义5'-CGGATGTCAACGTCAC-3'UbDNM—53299正义5'-TTTGTGAGGACTGCAGCC-3'280bp反义5'-TCACAAAGATCTGCATGCC-3'(2)总RNA的提取方法同基因芯片样品提取总RNA的方法。(3)RNA纯度与完整性鉴定取少量提取好的RNA，紫外分光光度计测定260nm和280nm处读数，计算所获RNA样品的纯度。以OD260/OD280比值确定RNA纯度，比值应在1.82.0范围内。用DEPC处理水制备P/。琼脂糖胶30ml，微波炉加热沸腾，见琼脂糖溶解，室温冷却至6(TC，加入3ml的IOXMOPS，1.6ml去离子甲酰胺，制胶，放置梳子。胶凝固后，加入1XM0PS电泳缓冲液。5-10吗RNA样品，加入加样缓冲液，共10nl，60。C5min,加入lpl溴化乙锭，离心后加入梳孔开始走胶，由负极走向正极，1-5V/cm。当溴酚蓝走至胶边缘后，紫外灯下观察RNA样品。经过变性RNA琼脂糖凝胶电泳可分离RNA，用溴化乙锭染色后在紫外灯下观察RNA条带。28S和18S比值应在2:1。(4)反转录扩增cDNA1)RNA和反转录引物的混合的变性混合RNA模板及cDNA引物，用预冷的DEPC水补足体积至10pl/反反应体系如下RNA2吗Randomprimer1jagDEPC水_7叫终体积10^盖紧离心管，70°C，5min，立即置于冰浴5min，短暂离心，冰浴备用。2)反转录按以下顺序加入各反应试剂并混匀，置于冰浴上①DEPC水17pl、5xRTbuffer8pl、dNTP混合液，10mM各2pl、核糖核酸酶抑制剂(RNasinRibonucleaseInhibitor)1|il、M-MLVRTaseH—2|il，终体积共30|il。在30|il混合液与10|ilRNA模板和引物混合液混合。②模板和引物退火25°C，5min;③cDNA链合成42°C，lhr;④反转录酶灭活70°C，15min;⑤保存于-2(TC按照以下配制PCR反应液①cDNA2jlU、10xPCR缓冲液(含Mg2+)5(^1、Forward引物(10pmol/(il)1|Lil、Reverse引物(IOpmol/|ul)1jil、dNTP混合物(2.5mMeach)4^、高保真Taq聚合酶(HighfidelityTaqpolymerase)0.75|il、ddH2036.25pi，总体积共50②94°C，2min;③94。C，15sec;55°C，30sec;72°C，45sec(x35循环)；72°C，7min;⑤10°C，终止。(5)扩增产物的分析配制1%琼脂糖，凝胶电泳分离鉴定目的片段。(凝胶溴化乙锭终浓度为0.5ug/ml，缓冲液0.5XTAE)，取扩增产物lO)il，加入溴酚蓝电泳液2nl，混匀后上样，水平槽电泳30分钟，电泳条件为80V、70mA、5W，凝胶长10cm。紫外灯下观察结果，采用复日FR-980生物电泳图像分析系统进行图像扫描和分析。对PCR电泳条带进行计算机灰度扫描，以每例组织电泳带面积灰度值与P-actin电泳带面积灰度值之比作为该例标本目的基因表达的相对值。(6)统计分析实验数据用均数士标准差表示，使用SPSS10.0统计软件包进行统计分析，实验数据为重复3次结果取平均值，方差齐性检验后，组间差异用单因素方差分析比较，确定存在统计学差异后，组间均数用LSD法进一步比较。2结果2.1RNA质检结果用Trizol试剂抽提总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳可见各组标本均显示18s和28s两条清晰条带，说明总RNA完整性较好。经紫外分光光度计测定，各个样本OD260/OD280比值均在1.82.0范围内，说明RNA纯度良好。见图10。2.2基因芯片结果分析可见芯片背景均匀，管家基因均被检测到，提示mRNA质量良好，杂交和检测体系可靠，基因芯片表达结果可靠。下列散点图为两组样本平均信号强度比较。坐标轴代表各样本信号强度，每一个数据点代表一个基因的杂交信号。以两样本差异分值士20作界线，界线以外说明该基因为差异表达。见图11—14。DM组与CN组比较，心肌组织差异表达862条，上调597条，下调265条。差异分值大于20及小于-20的基因共有42条。一部分基因功能与名称已明确，另一部分为表达序列标签，功能还未确定。表4列出部分已知名称和功能的基因及其序列号、差异分值。表6糖尿病组和正常对照组大鼠心肌部分基因差异表达谱Genbank序列号基因名称差异分值糖代谢相关NM一19286脂代谢相关NM一17004NM一24386NM一138828蛋白质合成相关NM一22699菌一3謂能量代谢相关NM一31543NM一2124卯蘭—53502凋亡相关NM一53299NM一22303细胞骨架相关NM一12893NM一20086丽—32085信号转导相关NM一139089NM12947乙醛还原酶1酯酶23-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A分解酶载脂蛋白E核糖体蛋白L30核糖体蛋白S9细胞色素P450三磷酸腺苷酶ATP结合盒泛素D半胱天冬酶补充区域家族肌动蛋白胞浆膜小泡相关蛋白胶原趋化因子配体10真核生物延长因子-2激酶-30.2-27.438.0-20.7-84.1-61.526.065.9-27.445.2-84.1-29.4-28.554.227.454.4其它NM—31834硫转移酶家族1A23.9NM—17131隐f丐素228.5NM—31810防卫素卩-1-83.6NM—12612A型利钠肽前体-39.3NM—13015前列腺素D2合酶-22.5TLR组与DM组比较，心肌组织差异表达1584条，上调957条，下调627条。差异分值大于20及小于-20的基因共有218条。一部分基因功能与名称已明确，另一部分为表达序列标签，功能还未确定。表6列出部分已知名称和功能的基因及其序列号、差异分值。表7本发明药物组与糖尿病组大鼠心肌部分基因差异表达谱Genbank序列号基因名称差异分值糖代谢相关NM—53551NM—130755NM」73D6脂代谢相关丽—53923菌—100421NM一138828蛋白质合成相关蘭_3函NM—22699氧化应激相关NM一134349NM—13083凋亡相关薩53299丙酮酸脱氢酶柠檬酸合成酶醛酮还原酶家族1磷脂酰肌醇3激酶岩藻糖苷酶载脂蛋白E核糖体蛋白S9核糖体蛋白L30谷胱甘肽硫转移酶热休克蛋白5泛素D152.825.834.939.437.854.6254.6159.620.820.5-32.9丽—12749核仁素37.1细胞骨架相关丽—12893肌动蛋白27.3丽—12678原肌球蛋白28.8丽—31556小窝蛋白31.5NM—138509微管相关蛋白27.3NM—32085胶原-76.4雨—53819金属蛋白酶组织抑制剂23.5信号转导相关NM—13125钠通道41.6NM—31511胰岛素样生长因子233.2丽—17309蛋白磷酸酶349.8凝血纤溶相关NM—19322纤溶酶2-20.4其它NM—172008钙联接蛋白104.9NM—13092糜蛋白酶-42.62.3半定量RT-PCR检测泛素DmRNA表达结果与CN组相比，DM、TLR、MEL1、ALA组大鼠心肌组织泛素DmRNA/P-actinmRNA灰度比值表达均显著增多(P<0.01)，MT组和MEL2组大鼠心肌组织泛素DmRNA/P-actinmRNA灰度比值也增多(P<0.05)，差异有统计学意义。见图15—16。结论1、高糖培养48h，对心肌细胞活力有抑制作用，本发明药物处理后心肌细胞活力上升，SOD2mRNA表达增加，可见本发明药物对糖尿病心肌细胞具有保护作用。2、STZ腹腔注射诱导的糖尿病模型大鼠普通饲料喂养12周后，形态学改变符合糖尿病心肌病变的变化，本发明药物对糖尿病心肌病变均有改善作用。3、糖尿病大鼠心肌组织凋亡加速，本发明药物干预后细胞凋亡减轻，可见本发明药物有抗凋亡作用。4、基因芯片结果提示本发明药物对糖尿病心肌病变的保护作用可能是通过纠正糖代谢、蛋白质代谢，增强抗氧化能力，抑制凋亡等方面发挥作用。综上所述，本发明药物能上调糖尿病患者心肌组织物质代谢相关基因和细胞骨架相关基因，具有抗糖尿病患者心肌细胞凋亡的作用，具有心肌保护作用，可以用于治疗糖尿病性心肌病。权利要求1.一种中药组合物在制备治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用，其特征在于，该中药组合物由如下重量份的原料药制成人参3-10水蛭3-11土鳖虫5-10乳香(制)1-5赤芍3-9降香1-5檀香1-5全蝎3-9蝉蜕3-12蜈蚣1-3冰片1-7酸枣仁(炒)3-10。2.如权利要求l所述的应用，其特征在于，该中药组合物由如下重量份的原料药制成人参6水蛭10土鳖虫7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎7蝉蜕7蜈蚣1冰片5酸枣仁(炒)5。3.如权利要求l所述的应用，其特征在于，该中药组合物由如下重量份的原料药制成人参10水蛭8土鳖虫7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎9蝉蜕7蜈蚣1冰片5酸枣仁(炒)5。4.如权利要求l所述的应用，其特征在于，该中药组合物由如下重量份的原料药制成人参6水蛭11土鳖虫7乳香(制)2赤芍5降香2檀香2全蝎3蝉蜕7蜈蚣1冰片5酸枣仁(炒)5。5.如权利要求l-4中任一项所述的应用，其特征在于，所述中药组合物的活性成分由下列成分组成a平均粒径小于100pm的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕及乳香(制)药粉；b冰片药粉；c由降香和檀香提取的挥发油；d人参用乙醇提取后的醇提液经浓縮后的醇提浸膏；e提取成分c后的降香和檀香药渣的水提液、赤芍和酸枣仁(炒)加水煎煮后的水提液以及提取成分d后的人参药渣的水提液过滤、混匀后浓縮成的水提浸膏。6.如权利要求l-4中任一项所述的应用，其特征在于，该中药组合物作为活性成分的药物制剂为胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液或丸剂。7、如权利要求l-4中任一项所述的应用，其特征在于，该中药组合物在制备减少心肌细胞凋亡，上调糖尿病患者心肌组织物质代谢相关基因和细胞骨架相关基因药物中的应用。8、如权利要求l-4中任一项所述的应用，其特征在于，该中药组合物在制备糖尿病患者心肌保护药物中的应用。全文摘要本发明公开了一种中药组合物在制备治疗糖尿病性心肌病的药物中的应用。通过试验证明该药物组合物可增强体外培养的乳鼠心肌细胞活力，通过促进超氧化物歧化酶(SOD2)mRNA表达，清除自由基，抑制氧化应激保护高糖引起的心肌细胞损伤；同时可改善糖尿病大鼠模型心肌病变，抑制心肌细胞凋亡；基因芯片检测结果显示该药物组合物可通过纠正糖及蛋白质代谢，增强抗氧化能力，抑制细胞凋亡等方面发挥治疗糖尿病性心肌病的作用，实验结果提示该药物组合物可对糖尿病患者心肌起保护作用，对糖尿病性心肌病具有治疗作用。文档编号A61P9/00GK101361841SQ20071014357公开日2009年2月11日申请日期2007年8月10日优先权日2007年8月10日发明者吴以岭申请人:河北以岭医药研究院有限公司