专利名称：一种高丽参提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，涉及一种高丽参提取物及其应用。
背景技术：
肌肉萎缩是指横紋肌营养不良，肌肉体积较正常缩小，肌肉纤维变细或消 失。失重、废用和疾病均可导致肌肉萎缩，进而导致肌无力使患者失去生活能
力甚至死亡。目前，对于肌肉萎缩的预防和治疗还没有4亍之有效的方法(Bodine SC， et al. Science 294: 1704-1798,2001 )。
.骨骼肌主要由I型(慢肌)和II型(快肌)肌肉纤维组成。I型肌比II型 肌含有更多的线粒体，以氧化代谢作为主要能量来源。而II型肌主要以糖酵解 产生ATP,同时伴有酸性物质的产生。因此，II型肌更易于疲劳(Bassel-DubyR and Olson EN. A腿.Rev. Biochem. 75:19-37， 2006)。
PGC-loc是转录因子共活化因子，它不直接与DNA结合，而是通过与结合在 DNA上的转录因子结合，发挥其转录调节功能。其功能包括，1:参与适应性产 热的调节；2:参与线粒体生成的调节；3:参与褐色脂肪细胞的分化(Puigserver P， et al. Endocrine Rewiews 24:78-90， 2003 )。最近发现PGC-1 oc在I型肌 中的表达高于II型肌。并且PGC-loc能促进I型肌的生成(Lin J, et. al. Nature 418: 797 801， 2002 )。疾病和废用性肌肉萎缩，PGC-1 oc降低，同时伴有线粒 体数量的下降，萎缩基因Atrogin-l和MuRFl表达上调。而过表达PGC-l oc能防 止肌肉纤维的变细，促进肌肉线粒体的生成，下调萎缩基因Atrogin-l和MuRFl 的表达，发挥4氐抗肌肉萎缩的作用(SandriM， et. al. PMS 103: 16260-16265，2006. Adhihetty PJ，et.al.J Appl Physiol 102: 1143-1151,2007 )。持续性 锻炼也能通过上调PGC-loc来促进I型月几的生成(Baar K, et al. FASEB， 16: 1879-1886， 2002. Norrbom J. et al. J A卯l. Physiol 96:189-194， 2004 )。 因此，上调PGC-lcc促进I型肌的生成，防止肌肉纤维蛋白的降解，对于预防和 治疗肌肉萎缩具有重要意义，但持续性锻炼显然有其局限性。
高丽参具有治疗疾病的功能，又有强身健体的功能。中医讲究的是"阴阳 调和"，认为疾病是由于寒热失调所引起的，这些理论体系显得过于虚幻，缺少 现代分子生物学研究支持。本发明以高丽参的提取物为研究对象，充分运用分 子生物学手段展开试验和研究。
发明内容
本发明解决的技术问题克服现有技术的不足，提供一种高丽参提取物及 其应用，充分运用了分子生物学手段，揭示了高丽参能抵抗萎缩骨骼肌中的 PGC-la的下调，促进I型肌的生成。同时，通过抑制Atrogin-1和MuRFl的 表达，抵抗失重和废用导致的肌肉纤维蛋白的降解。因此，高丽参提取物可作 为新的预防失重和废用导致的肌肉萎缩的药物，能够有效预防失重和废用等导 致的肌肉萎缩。
本发明的技术解决方案 一种高丽参提取物，其特征在于
(1) 称取高丽参，按每克高丽参中加入10-15毫升水的比例加水后烧开， 再用文火煎煮20—30分钟，留取上清，并吹干制成干粉，
(2) 加水调节浓度，每1.5—2.5克干粉加入1ml水，得到高丽参提取液。 所述的高丽参为红参。
'上述高丽参提取物的应用，用于制备预防和治疗失重、废用导致的肌肉萎
缩的药物。
本发明的有益效果
首次阐明了高丽参提取物具有抵抗肌肉萎缩时PGC-la表达的下调和萎缩 基因atrogin-1和MuRF-l表达的上调，促进II型肌纤维向I型肌纤维转变， 防止肌肉纤维变细及重量减轻。该结果表明高丽参能有效预防失重和废用导致 的肌肉萎缩。
本发明通过灌胃尾部悬吊造成后肢无负荷的肌肉萎缩模型大鼠，分离腓肠 肌、比目鱼肌和趾长伸肌，测定肌肉的重量、PGC-la和肌肉类型标志基因的表 达。近一步证明高丽参提取物能有效防止失重和废用导致的骨骼肌组织中 PGC-la和I型肌标志基因表达的下调，以及萎缩基因的上调，更为重要的是高 丽参提取物能有效预防失重和废用导致的肌肉重量的减轻和肌肉纤维变细。
图1为悬吊给药大鼠比目鱼肌重量的变化；
图2为悬吊给药大鼠14曰后，比目鱼肌形态(图2A图)及横截面积(图 2B图的变化；
图3为悬吊给药大鼠14日后，Western blot检测腓肠肌(Gas )、比目鱼 肌(Sol)和跖肌(PI) I型肌标志蛋白troponin I (slow)的变化；
图4为悬吊给药大鼠比目鱼肌3种基因mRNA水平表达的变化，图4A: PGC-la;图4B: MHC-I ( I型肌标志基因)；图4C: MHC-IIb(II型肌标志基因)；
图5为悬吊给药大鼠2种导致肌肉萎缩基因mRNA水平表达的变化。
具体实施例方式
本发明所述高丽参提取物为红参提取物。
高丽参的提取和浓缩过程高丽参加水(10-15毫升水/克高丽参)烧开后， 文火煎煮30分钟，留取上清，残淹重复上述过程一次，并吹干制成干粉，加水 调节浓度，每2克干粉加入1毫升水，得到高丽参药液，于4。C保存备用。 下面通过试验阐述本发明的应用
高丽参药液灌胃尾部悬吊造成后肢无负荷的肌肉萎缩模型大鼠(200克左 右Wistar大鼠)按1亳升/只的量每日灌胃一次，共28日。发现高丽参能有 效预防失重和废用导致的肌肉萎缩。本模型为公认的模仿失重所造成的肌肉萎 缩的动物模型。
试验用材料与来源 i式剂Trizol购于Invitrogen 7〉司；M—MLV逆举争录酵购于Promega公司； Tag酶购于TaKaRa公司；ECL增敏化学发光底物为Santa Cruz试剂；羊抗 Troponin-1 (slow)购于Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG 为北京中山生物/>司产 品。
仪器ABI Prism 7000 Sequence Detection System PCR仪；Bio-radmini 电泳仪。
实施例
1. 高丽参的提取和浓缩过程取高丽参5000克加水(10-15毫升水/克高 丽参)烧开后，文火煎煮30分钟，留取上清，残渣重复上述过程一次，并吹干 制成干粉，加水调节浓度，每2克干粉加入1毫升水，得到高丽参药液，于4 匸保存备用。
2. 动物模型及样品准备60只200克左右Wistar大鼠在动物房内饲养 一周后，随机分为地面对照组，尾部悬吊组，地面灌药组，尾部悬吊灌药组。
尾悬吊方法使大鼠后肢刚好离地，身体与地面的倾斜角度大约为30° 。大鼠可 以在鼠笼内头低位自由活动、摄食和饮水。动物均单笼饲养，室温保持在23± 2'C，每日保持12小时光照。于实验第3， 7， "， 21, 28天，取大鼠后月支背侧 腓肠肌、比目鱼肌和跖肌，剪除多余脂肪及筋膜，称重。冻存于液氮中，待样 本齐全后共同提取RNA及蛋白。
3.组织RM的提取、RT-PCR和rea卜time PCR取适量组织加lml Trizol 研磨充分，转入1.5mL离心管中，室温放置30分钟后，加入200ial氯仿强烈 振荡，室温放置2-3分钟，4'C，12000g离心15分钟，小心吸取上清至另一洁 净的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，4。C，U000g离心10分钟，弃上 清，75%乙醇洗涤沉淀，室温干燥，适量DEPC水溶解，紫外分光法检测浓度和 纯度。2 jag RNA用于逆转录，反应体系为25jul，含2jugRNA, lmM dNTP， RNA 酶抑制剂1 U/|il, 01ig(dT)15引物2. 5 pmol/|il, M-MLV逆转录酶8 U/p 1， 轻轻混勻，42°C 90分钟，95。C10分钟，水上放置2分钟，所得cDNA可用于 real-time PCR。 real—time PCR为20jal反应体系，应用Sybr green染料法， Mix购于天根生化科技有限公司。所用引物序列Atroginl:上游5， GCAGAGAGTCGGCAAGTC 3，，下游5，CAGGTCGGTGATCGTGAG 3，(退火温度58 °C ) ; MuRFl : 上游5 ， CAACCTGTGCCGCAAGTG 3 ，， 下游5 ， CAACCTCGTGCCTACAAGATG 3，(退火温度62°C ) ;PGC-1 oc:上游5， AAAGGATGCGCTCTCGTTCA 3，，下游5， GGAATATGGTGATCGGGAACA 3，(退火温 度58 °C) ; GAPDH:上游5， TCCCTCAAGATTGTCAGCAA 3，下游5， AGATCCACAACGGATACATT 3， (退火温度60°C ) 。
PCR反应条件95°C5分 钟，95°C30秒-不同退火温度(见各基因引物后的退火温度)30秒-72匸30秒 (40个循环)72。C延伸3分钟。
4. 蛋白质的提取及Western blot 50-100mg肌肉组织加入到lmL组织裂解 液中(lMTris， 0. 5MEDTA， 5M NaCl， 10% Briji 96， NP40，使用时加入PMSF、 Leup印tin和Aprotinin，终浓度分另'j为100jig/ml、 2 n g/ml和2 |u g/ml )于 冰上充分匀浆。水上裂解30分钟。4'C，12000g离心20分钟。留取上清。常规 SDS-PAGE电泳，80jig/孔。电泳完毕，以1. 25mA/cii^恒流半干转膜。结束后， 5%脱脂奶粉室温封闭2小时。加一抗4'C过夜。洗膜3次。加二抗，室温2小 时。洗膜3次，ECL显色。
5. 冰冻切片的制备及肌肉纤维直径的变化将新鲜组织放置于包埋剂中， 置于用液氮预冷的异戊烷中0. 5-l分钟，待包埋剂变成乳白色，切片。将切片 放置丙酮中固定5分钟，-20。C保存。将切片依次用抗兔抗Laminin(Calbiochem 公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (北京中山生物公司)二抗处理，显 色后拍照。ITP软件分析肌肉纤维直径的变化。
如图1-图5所示，图1为悬吊给药大鼠比目鱼肌重量的变化(Con:对照 组；Drug:给药组，以下相同)。给药组肌肉重量降低明显低于对照。
图2为悬吊给药大鼠14日后，比目鱼肌形态(A图)及4黄截面积(B图，ground 为地面组，unloading为悬吊组)的变化。高丽参有效保护后肢悬吊所导致的肌 肉萎缩。
图3为悬吊给药大鼠14日后，Western blot检测腓肠肌(Gas )、比目鱼 肌(Sol)和跖肌(PI)I型肌标志蛋白troponin I (slow)的变化。高丽参能有效 刺激比目鱼肌和跖月几troponin I (slow)的表达。
图4为悬吊给药大鼠比目鱼肌3种基因mRNA水平表达的变化。A: PGC-la;
B: MHC-I (I型肌标志基因)；C: MHC-IIb (II型肌标志基因)。高丽参能有效 预防后肢悬吊所导致的PGC-la和MHC-I的下调以及MHC-IIb的上调。
图5为悬吊给药大鼠2种导致肌肉萎缩基因mRNA水平表达的变化。与对照 组相比较，高丽参能有效抑制后肢悬吊所导致的atrogin-1 (图5A)和MuRF-l (图5B)的mRNA表达的上调。
本发明通过对人体的临床试验对高丽参提取物的应用作进一步的验证 6名志愿者，随机分为2组，每组3名(其中A组为对照组，B组为服药组 每次服用2. 5-3. 5ml高丽参提取物药液，每日3次)，按30天为一个疗程进行 地面人体卧床实验，两组人员均预先在小腿部围径最大处作标记，以备实验期 间测量。用皮尺测量卧床前(-7天)、卧床中(1, 5， 10, 18， 22， 29天)和 卧床后(2天)人体下肢小腿围径的动态变化，收集实验数据的结果如下
表30天卧床小腿围径的变化(mm)
controlbr-ldaybr-5daybr-10daybr-18daybr-22daybr-29dayR+2day
A333. 2±332. 6±329. 4 ±324. 0±320. 0±317. 2±315. 8±315. 5±
组19. 1821.0420. 39*21.12**18. 26**17. 69氺*承20. 17承氺承20. 06***
B335. 8 ±335. 3 ±334. 9±333. 7±330, 6±328. 8 ±326. 2 ±326. 1±
组16.8111,7813.9812, 37承13. 14*11.08*13. 03**10. 45*
*p<0.05，氺承p〈0.01，氺氺承p〈0. 001， as compared with control .以往实验和理论已证明，随着模拟失重时间的延长，下肢肌萎缩程度逐渐
增加，该实验测试结果与其相一致。两组受试人员自身卧床前后小腿围径测试
结果显示，随着卧床时间的延长，受试人员的小腿围径值逐渐减小，其中A组
人员受试前与卧床29天后对比有显著性差异(P = 0. 0005， P復画5)， B组人
员受试前与卧床29天后对比虽然也有显著性差异(P = 0.009, P<0.01),但其
肌萎缩发生时间较A组明显延后且其萎缩程度明显减轻。
本发明中的高丽参提取物的药液最好在4摄氏度的环境中，保质期可达3 个月，而且根据病人肌肉萎缩程度的不同，服用量和疗程可作适当的变换。
权利要求
1.一种高丽参提取物，其特征在于(1)称取高丽参，按每克高丽参中加入10-15毫升水的比例加水后烧开，再用文火煎煮20-30分钟，留取上清，并吹干制成干粉，(2)加水调节浓度，每1.5-2.5克干粉加入1ml水，得到高丽参提取液。
2、 根据权利要求1所述的一种高丽参提取物，其特征在于，所述的高丽 参为红参。
3、 根据权利要求1所述的一种高丽参提取物，其特征在于，所述的留取 上清后的残渣可以重复使用 一次。
4、 根据权利要求1所述的高丽参提取物用于制备预防和治疗失重、废用 导致的肌肉萎缩的药物的应用。
全文摘要
一种高丽参提取物及其应用，(1)称取高丽参，按每克高丽参溶液中加入10-15毫升水的比例加水后烧开，再用文火煎煮20-30分钟，留取上清，并吹干制成干粉，(2)加水调节浓度，每1.5-2.5克干粉加入1ml水，得到高丽参提取液。该药液可用于制备预防和治疗失重、废用导致的肌肉萎缩的药品。
文档编号A61K36/258GK101181325SQ20071017750
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者姜世忠, 孙国勋, 鹏 张, 张辰宇, 白延强, 陈晓萍 申请人:中国航天员科研训练中心