专利名称：：从虎杖中提取的一种治疗糖尿病及并发症的物质的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医药领域，特别是一种从虎杖中提取的一种治疗糖尿病及并发症的物质。二
背景技术：
：糖尿病及其并发症(diabetesmellitus，DM)属中医"消渴"范畴，是以多饮、多食、多尿、身体消瘦，或尿浊、尿有甜味为特征的病症。现代医学认为糖尿病是一种由多种病因引起的慢性代谢性疾病，是由于体内胰岛素缺乏或拮抗胰岛素的激素增高或胰岛素在靶细胞内不能发挥正常生理作用而引起葡萄糖、蛋白质及脂质代谢紊乱的综合病症。临床上分为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)即I型和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)即II型两种类型，目前世界上糖尿病患者约有1.57亿，我国有2000万人以上，而且患病率在逐年增长，已成为威胁人类健康位于前3位的杀手，其发生除了与遗传和环境因素及饮食结构有关外，胰岛素抵抗也成为糖尿病发病的重要原因之一，有关资料表明在由发展中国家向发达国家过渡期间发病率明显增高。生活方式的调整和降糖药物的应用是控制2型DM及并发症的主要手段，目前降糖药物仍以西药为主，存在着低血糖症、胃肠道反应等副作用及对糖尿病症状疗效差等不足，且随着用药时间的延长，剂量也需加大，因而仍需进一步研发长效、高效、低毒的降糖药，特别是控制并发症和改善胰岛素抵抗的药物仍是医药专家追求的目标。中医药在防治DM方面有极大的优势，中医认为其发生与脾虚、肾虚、气阴两虚、血瘀有关，而且临床采取益气养阴、补肾健脾、活血化瘀中药治疗糖尿病有很好的疗效，且中药有毒副作用小、作用温和持久、具有综合治疗作用、可延缓并发症等优点，不失为寻找降糖新药的一条重要途径。利用先进的科学技术，把握好中药多靶点、多环节、综合作用及功能调节的特点，把重点放在对DM并发症的防治，是中药防治DM的优势所在，也是广大糖尿病患者和整个社会的共同需求。祖国医学认为糖尿病的基本病机是阴津亏损，燥热偏胜。津血同源，互为资生转化，阴虚者血必不足，而燥热又可消砾津液，耗伤阴血，使阴血更加亏虚，阴血亏虚则脉道不充,而致血行不畅，瘀血内停，瘀阻气滞。再者，消渴病久者，必然本元太伤，虚损之象迭现,若气虚则运血乏力,阴虚则血行艰涩，而成久病入络，久虚入络之血瘀证候，瘀滞即成，则陈者当去而不能去，新者当生而不能生，血愈虚而愈瘀，愈瘀而愈虚，互为因果，交相为患。最后导致气血阴阳俱衰，血脉瘀阻。所以消渴病必有瘀血的病理。由于大多数糖尿病患者具有瘀血征象。临床以活血化瘀方法能较好地改善患者糖、脂肪代谢和血液高粘状态及血管神经并发症症状。虎杖又名"九龙根"、"阴阳莲"，性微温，味苦，归肝、胆、肺经。为蓼科植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc)的干燥根茎及根。主要功能是祛风利湿，散瘀定痛，止咳化痰。虎杖作为活血化淤降糖中药在民间早有应用，近年也有散在的虎杖降糖的报道，但研究多不深入，缺少降糖作用机理探讨。虎杖作为降糖中药除入复方应用较多外，单味应用及有关其降糖成分及降糖作用的现代研究很少。现代药理研究表明虎杖有降血糖、抗氧化、正性肌力、抗休克、改善微循环、抑制血小板聚集、降血脂、镇咳、平喘、提高免疫、抗病原微生物、明显松弛肠肌、抗肿瘤、升高白细胞及血小板和抗氧化等作用。临床用于治疗糖尿病、高脂血症、上消化道出血、肝炎、新生儿黄疸、白细胞减少症、肺炎、关节炎、烧烫伤、阴道炎及玻璃体积血等症。虎杖主要含游离蒽醌及蒽醌苷、鞣质、黄酮类、少量多糖以及氨基酸等成分。已有实验研究表明虎杖水提物对a-葡萄糖苷酶有强烈的抑制作用，且有报道认为虎杖中蒽醌类化合物为降糖活性成分；有报道家兔静注从虎杖中提取到的草酸，可引起低血糖性休克。另有报道虎杖鞣质对四氧嘧啶糖尿病小鼠有很好的降糖作用。但对其降糖作用的研究还只局限于水煎剂，未明确其降糖活性部位及活性成分，其降糖机理的研究还只局限于整体水平，对于虎杖如何筛选活性部分提取所含的主要化学成分-蒽醌类，并用于治疗糖尿病及其并发症，至今未见有报导。三
发明内容针对上述情况，本发明之目的就是筛选虎杖活性部分从虎杖中提取治疗糖尿病及其并发症的物质，可有效制备治疗糖尿病及其并发症的药物，解决糖尿病及其并发症的治疗问题，其解决的技术方案是，该物质由虎杖干燥根茎及根的切片制成，取虎杖切片，粗粉碎，置圆底烧瓶中，加6倍量乙醇(70%)浸泡30min后，回流提取2h，过滤，药渣加6倍量乙醇(70%)再回流提取1次，提取2h，过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓縮后加入预处理和再生的大孔吸附树脂柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用质量浓度为70%乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含蒽醌类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干即得虎杖提取物质总蒽醌，得率为2-2.5%，纯度64-70.7%。所说的预处理与再生的大孔吸附树脂柱为所用的大孔吸附树脂要经过预处理和再生，其中预处理是取D301大孔吸附树脂用质量浓度为95%的乙醇浸泡24h,不断搅拌，除去气泡后装入柱中，用质量浓度为95%的乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣，再依次用3倍体积的lmol/LNaOH水溶液、2倍体积的蒸馏水、3倍体积的lmol/LHCL水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，之后，对大孔吸附树脂再生，即用lmol/LNaOH水溶液洗脱，洗至洗脱液透明，然后用2倍体积蒸馏水洗脱，再用lmol/LHCL水溶液洗脱，洗至洗脱液透明，最后用蒸馏水洗脱至pH中性(可重复使用)，其工艺程流见图l所示。本发明产品制备方法科学，易操作，制备物质总蒽醌质量好，纯度高，使用效果好，有效用于制备治疗糖尿病及其并发症药物，是虎杖药物开发与应用上的一大创新，造益于人类。四图1为本发明产品的制备工艺流程图。图2为本发明产品含量测定标准曲线图。图3为本发明产品不同体积对a-葡萄糖苷酶活力影响的曲线图。五具体实施例方式根据前述技术方案，本发明在实施中是由以下具体方式实现的。将虎杖的根茎及根去其泥土，洗静，粉碎成粗粉(50-80目)，取1000克粗粉，加6000ml的质量浓度为70。/。的乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤，得药液备用，药渣再加入6000ml质量浓度为70%的乙醇，回流提取2h，过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓縮至50%的体积后，加入预处理和再生的大孔吸附树脂柱中(所说的大孔吸附树脂柱的预处理和再生同前)，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用质量浓度为70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含蒽醌类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干得虎杖提取物总蒽醌21.25克，纯度为70.7%，可有效用于制备治疗糖尿病及其病发症的药物，该提取物经试验对治疗糖尿病及其病发症有突出的作用，原比虎杖原药要好得多，其效果为研制前所未料到，有关实验资料如下。(一)虎杖总蒽醌的显色反应1.Feigl反应取虎杖总蒽醌少许于试管中，加水溶解，加入25%碳酸钠水溶液，4%甲醛及5%邻二硝基苯的苯溶液各少许，混合后置水浴上加热，2分钟，产生显著的紫色。2.与碱试剂的反应取虎杖总蒽醌5mg，加水约5ml，充分搅拌，取上清夜，加氯仿10ml，振摇提取，分取氯仿液，蒸干，滴入5%氢氧化钠2滴，呈樱红色。3.醋酸镁显色反应取虎杖总蒽醌少许，加乙醇溶解，滴于滤纸上，吹干，喷0.5%醋酸镁甲醇溶液，于90度加热分钟，呈樱红色。4..薄层鉴别取虎杖总蒽醌15mg，加2.5mol/L硫酸溶液5ml，加热水解30分钟，放冷，用氯仿提取2次，每次5ml，合并氯仿液，蒸干，残渣加氯仿lml使溶解，作为供试品溶液。另取大黄素对照品2mg，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。吸取供试品、对照品溶液各2ul，分别点与同一硅胶G薄层板上，以体积的醋酸乙酯甲醇水=100:16.5:13.5为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在于对照品色谱相应的位置上，显相同的橙色荧光斑点；置氨蒸气中熏后，日光灯下检视，斑点变为红色。(二)虎杖总蒽醌的含量测定采用比色法测定总蒽醌含量，以大黄素为标准品，用分光光度法测定吸收度。1.对照品溶液的制备精密称取10mg大黄素对照品，置于100ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度(100ug/ml)，摇匀，即得(每lml中含大黄素O.lmg)。2.标准曲线的制备精密吸取对照品溶液4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.Oml分别置25ml容量瓶中，在水浴上回收甲醇,加5%氢氧化钠-2%氢氧化铵混合碱液至刻度，摇匀，使溶解，用三号垂熔漏斗滤过，取续滤液，以试剂为空白，照分光光度法(2005年版附录VB)，30min后，在520nm的波长出分别测定吸收度(A)。以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制吸光度(A)-浓度(C)的曲线，得回归方程为A:5.26XC+0.021，相关系数r二O.9996。线性范围为0.0160.056mg/ml，见表1所示_表l虎杖总蒽醌含量测定标准曲线数据序号对照品溶液体积(mL)对照品溶液浓度(mg/mL)吸收度14.00.0160.11026.00.0240.14038.00.0320.176410.00.0400.252512.00.0480.273614.00.0560.316标准曲线见图2所示。3.样品含量测定方法-精密称取干燥至恒重的虎杖总蒽醌7.5mg,置于100ml圆底烧瓶中，加2.5mol/L硫酸溶液20ml，加热回流1小时，稍冷，加氯仿约30ml，继续回流2小时，冷却，移置分液漏斗中，用少量氯仿洗涤容器，洗液并入分液漏斗中，分取氯仿层置50ml量瓶中，酸液用氯仿提取2次，每次8ml，氯仿液并入50ml量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀，即得，精密量溶液10ml，蒸干；精密加入2%氨溶液与5%氢氧化钠溶液的等量混合溶液20ml使溶解，用三号垂熔漏斗滤过，取续滤液，以试剂为空白，在520nm的波长出分别测定吸收度，由线性回归方程计算虎杖总蒽醌以大黄素(C15H10O5)为对照品对照其总蒽醌含量。按照上述方法测定提取的虎杖总蒽醌中的总蒽醌含量，测定6次，结果见表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上表可以看出，本实验所提取的虎杖总蒽醌中总蒽醌的平均含量为67.33%0(三)虎杖总蒽醌对大、小鼠糖尿病模型的影响1实验材料1.1药物虎杖总蒽醌，按提取工艺提取；盐酸二甲双胍，上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂，批号060310，0.25g/片，48片/盒。1.2试剂链脲佐菌素，sigma公司；生理盐水，郑州永和制药有限公司，批号060810012，规格500ml/瓶；柠檬酸(分析纯)，湖北省医药公司化玻站，批号20020623;柠檬酸钠(分析纯)，宿州化学试剂厂，批号20010624;浓硫酸，洛阳市化学试剂厂，批号051102;血糖试剂盒，浙江东瓯生物工程有限公司，批号2006060350;糖化血清蛋白(GSP)测定试剂盒，南京建成生物工程研究所第一分所，批号20061007;糖元试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号20060907;冰醋酸(分析纯)，中国莱阳市双双化工有限公司，批号20050321;SOD试剂盒(测总)，南京建成生物工程研究所，批号20070131;丙二醛(MDA)测试盒，南京建成生物工程研究所，批号20070206;低密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(LDL-C)，浙江东瓯生物工程有限公司，批号2006080265;高密度脂蛋白胆固醇测定试剂盒(HDL-C)，浙江东瓯生物工程有限公司，批号2006120002;甘油三脂测定试剂盒(TG),浙江东瓯生物工程有限公司，批号2006110001;总胆固醇测定试剂盒(TCH),浙江东瓯生物工程有限公司，批号2006090002;胰岛素(INS)放射免疫分析药盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20063082;消脂素(L印tin)放射免疫分析药盒，中国人民解放军总医院科技开发中心放免，批号070126;C-肽(C-P)放射免疫分析药盒(RIA)，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20070125;胰岛素抗体(INS-Ab)放射免疫分析药盒，北京科美东雅生物技术有限公司，批号20070125。1.3仪器UV-2000紫外可见分光光度计尤尼柯(上海)仪器有限公司；恒温水浴锅，北京市光明仪器厂；离心机，北京医疗仪器修理厂；FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司；OLYMPUS光学显微镜；日立H-7500透射电子显微镜。1.4动物小鼠昆明种，雄性，体重1820g;由河北省实验动物中心提供，合格证号611040。大鼠Wistar,雄性，体重180200g;由河北省实验动物中心提供，合格证号701022。1.5试液配制试剂的配制按试剂盒说明，加入一定量的浓硫酸，搅拌使溶，使用前新配。枸橼酸缓冲液的配制pH:4.2:柠檬酸O.lmol/L+柠檬酸钠0.lmol/L12.3+7.7分别称取1292.4mg柠檬酸和1132.3mg柠檬酸钠配成100ml溶液，此溶液即为Ph为4.2枸橼酸缓冲液，为确保其准确性可用Ph仪器校正调配。(链脲佐菌素不十分稳定，且对血管刺激较大，用缓冲液配制链脲佐菌素可减轻这些副面影响)临用前配制。10%福尔马林固定液的配制36%甲醛溶液101111，用蒸馏水配成100ml。4%的戊二醛固定液的配制磷酸氢二钠35.61g，用双蒸水配成1000ml;磷酸二氢钠27.60g，用双蒸水配成1000ml。取磷酸氢二钠溶液40.5ml和磷酸二氢钠溶液9.5ml混匀后加入25%戊二醛16.0ml，再加双蒸水至100ml。2统计学处理数据分析用SPSS10.0forwindows统计软件，计量资料组间比较采用单因素方差分析，等级资料采用Ridit分析。3实验方法及结果3.1虎杖总蒽醌对小鼠糖尿病模型的影响取雄性小鼠，正常词养3天，禁食12h后，尾静脉注射链脲佐菌素80(mg/kg，0.02ml/10g)，于注射第11天禁食12h后，尾部采血测空腹血糖值，选取血糖值〉ll.lmmol/L并具有明显多饮、多食、多尿症状的小鼠50只，按血糖值随机均分为5组，即大、中、小剂量虎杖组，阳性对照组和模型组，分别灌服大、中、小剂量虎杖总蒽醌(400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，0.2ml/10g)，二甲双胍(0.5g/kg，25mg/ml，0.2ml/10g)及同体积生理盐水，另取10只小鼠作为空白对照组，灌服同体积生理盐水。每天给药l次，连续给药30天。于给药第IO、20、30天尾部取血测血糖值。第30天在禁食12h末次给药lh后，取血，测血糖(按试剂盒说明)、糖基化血清蛋白(按试剂盒说明)，处死小鼠，取肝测肝糖元(按试剂盒说明测)；取胰腺，10%福尔马林液固定，作病理切片。结果见表3，4，5。表3虎杖总蒽醌对链脲佐菌素所致小鼠血糖的影响(；土s)<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>**:表示与模型组相比P〈0.01*:表示与模型组相比P〈0.05从上面图表可以看出，与空白组比，模型组血糖水平在开始、第IO、20、30天均显著高于空白组(p〈0.01)，说明链脲佐菌素造糖尿病模型成功。与模型组比，在给药第20天，大、中剂量虎杖总蒽醌组和二甲双胍组都能显著降低血糖水平(p<0.01)，小剂量虎杖总蒽醌能明显降低血糖水平(p<0.05)，在给药第30天，大、中、小剂量虎杖总蒽醌组和二甲双胍组都能显著降低血糖水平(p〈0.01)。表4虎杖总蒽醌对链脲佐菌素致糖尿病小鼠糖化血清蛋白_和肝糖元的影响(7土s)_<table>complextableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>**:表示与模型组相比P〈0.01*:表示与模型组相比P〈0.05从上表可以看出，与空白组比，造模型组肝糖原水平显著降低，糖化血清蛋白水平显著升高(p<0.01)。与模型组比，大、中剂量的虎杖总蒽醌及二甲双胍均能显著升高肝糖原水平(p〈O.OD，小剂量虎杖总蒽醌能明显升高肝糖原水平(p〈0.05)。大、小剂量虎杖总蒽醌和二甲双胍能显著降低血清糖化血清蛋白水平(p〈0.01)，中剂量虎杖总蒽醌能明显降低血清糖化血清蛋白水平(p<0.05)。表5虎杖总蒽醌对链脲佐菌素所致糖尿病小鼠胰脏组织的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>"-"为胰岛细胞胞浆丰富，未出现萎縮，水肿和空泡变性均正常的；"+"为胰岛细胞呈现萎縮现象，而无水肿和空泡变性的；"++"胰岛细胞大部分出现萎縮，细胞少数出现水肿而无空泡变性的。"+++"胰岛细胞出现萎縮，同时出现水肿和空泡变性明显者。从上表可以看出，空白组小鼠各胰岛细胞胞浆丰富，未出现萎縮，水肿和空泡变性均正常的，与空白组比，模型组绝大部分胰岛细胞出现萎缩，同时出现水肿和空泡变性明显，经Ridit检验P〈0.01，说明造模成功。与模型组比，大、中、小剂量虎杖总蒽醌组和二甲双胍组大部分胰岛细胞胞浆丰富，胰岛体积增大，少部分细胞萎縮，细胞胞浆明显减少，细胞核呈现密集现象，经Ridit检验P〈0.01。与二甲双胍组比，大、中剂量虎杖总蒽醌组胰岛细胞胞浆较丰富，出现萎縮更少，水肿和空泡变性较轻，经Ridit检验P〈0.01。结果提示大、中、小剂量虎杖总蒽醌对链脲佐菌素所致的胰岛损伤有保护作用，作用明显强于二甲双胍组。3.2虎杖总蒽醌对大鼠糖尿病模型的影响取雄性大鼠100只，禁食12h后，其中90只尾静脉注射链脲佐菌素60mg/kg(用PH为4.2的枸橼酸缓冲液配制)，另10只设为完全空白对照组，尾静脉注射等体积的枸橼酸缓冲液。第10天尾部取血测血糖值，选取血糖值〉11.lmmol/L并具有明显多饮、多食、多尿症状的大鼠50只，按血糖值随机均分为5组，分别灌服大、中、小剂量的虎杖总蒽醌(400mg/kg、200mg/kg、100mg/kg，配成浓度为20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml，灌胃体积为2ml/100g)溶液，二甲双胍片208mg/kg(20.8mg/ml，2ml/100g)，模型组与空白对照组给予同体积生理盐水，每天给药1次，连续给药30天，分别于给药的第IO、20、30天测空腹血糖值，于最后一次测血糖前一天禁食12;灌药2h后，取血，分离血清，测血糖(FBG)、胰岛素(Ins)、胰岛素抗体、C肽、瘦素、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化脂质产物丙二醛(MDA)水平。处死大鼠后取胰腺和肾脏作常规病理及胰腺作透射电镜观察其病理改变。结果见表6，7,8，9，10。表6虎杖总蒽醌对大鼠糖尿病血糖的影响(；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>与模型组比，林表示代O.Ol，*表示代0.05从上表可以看出与空白组比，模型组血糖水平在开始、第10、20、30天显著高于空白组(代O.Ol)，说明链脲佐菌素造糖尿病模型成功。与模型组比，二甲双胍可显著降低给药后第20、30天血糖值(代O.01)，对第10天血糖值无明显影响；大剂量虎杖总蒽醌可明显降低第20天血糖值(代0.05)，可显著降低第30天血糖值(代0.01);中剂量虎杖总蒽醌可显著降低第20、30天血糖值(代O.Ol)，有降低第10天血糖值趋势；小剂量虎杖总蒽醌有降低第30天血糖值趋势。表7虎杖总蒽醌对链脲佐菌素致糖尿病大鼠血清胰岛素、瘦素、胰岛素抗体、C-肽的影响(；士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>n二6**:表示与空白组比P〈0.01t表示于空白组比P〈0.05从上表可以看出，与空白组比,模型组胰岛素、C肽水平显著降低(P〈0.01)，瘦素水平显著升高(P〈0.01)，胰岛素抗体水平没有明显变化。与模型组比，二甲双胍、中剂量虎杖总蒽醌组胰岛素显著升高(P<0.01)大剂量组胰岛素明显升高(P〈0.05)，小剂量组有升高胰岛素的趋势；中剂量组和小剂量组C肽水平显著升高(P<0.01)，二甲双胍组有升高C肽水平的趋势，而大剂量却不明显；大、中、小和二甲双胍组均能显著降低瘦素水平(P〈0.01);二甲双胍有显著降低胰岛素抗体水平(P〈0.01)，而大剂量却明显升高胰岛素抗体水平(P<0.05)。表8虎杖总蒽醌对链脲佐菌素致大鼠糖尿病模型血清丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)活力的影响(x±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>**:表示与模型组比P〈0.01*:表示与模型组比P〈0.05从上表可以看出，与空白组比，模型组过氧化脂质(LPO)的代谢产物丙二醛(MDA)的量显著高于空白组，而SOD的活力显著低于空白组(P〈0.0D，说明链脲佐菌素致糖尿病模型存在脂质过氧化损伤和SOD活力的下降。与模型组比，中、小剂量的虎杖总蒽醌和二甲双胍能显著降低血清中MDA的水平(P〈0.01)，大剂量虎杖总蒽醌能明显降低血清中MDA的水平(P〈0.05)，大、中剂量虎杖总蒽醌能和二甲双胍能显著升高造模型后SOD的活力(P〈0.01)，小剂量虎杖总蒽醌有升高SOD活力的趋势(P>0.05)。表9虎杖总蒽醌对链脲佐菌素致糖尿病大鼠模型脂代谢的影响(；±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>**:表示与模型组比P〈0.01*:表示与模型组比P0.05从上表可以看出，与空白组比，链脲佐菌素造大鼠糖尿病模型组TG、TC、LDL-C水平显著高于空白组(PO.Ol)，HDL-C水平显著低于空白组(PO.Ol)，说明该模型存在脂类代谢紊乱。与模型组比，各灌药组均能不同程度改善脂类代谢紊乱。大剂量虎杖总蒽醌能显著降低TG、TC和LDL-C水平(PO.01)，显著升高HDL-C水平(P<0.01);中剂量虎杖总蒽醌能显著降低TC、TG、LDL-C水平(PO.Ol)，有显著升高HDL-C水平(PX).01);小剂量虎杖总蒽醌能显著降低LDL-C水平(PO.Ol)，有显著升高HDL-C水平(PX).Ol)，有明显降低TC和TG水平(P〈0.05);二甲双胍能显著降低TC、TG、LDL-C水平(PO.OO和显著升高HDL-C水平(PO.Ol)。表10虎杖总蒽醌对糖尿病模型大鼠肾脏和胰腺组织的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>"-"为胰岛细胞胞浆丰富，未出现萎缩，水肿和空泡变性均正常的；"+"为胰岛细胞出现萎縮现象，而无变性水肿改变；"++"胰岛细胞大部分出现萎縮，少数细胞出现变性水肿现象。"+++"胰岛细胞出现萎縮，并出现水肿和空泡变。从上表可以看出，空白组胰岛细胞胞浆丰富、胞体较大，细胞核也呈现松散状态。与空白组比，模型组绝大部分胰岛细胞部分出现明显的萎縮，胞浆明显减少，胞体縮小，细胞核密集，部分细胞出现水肿和空泡变，经Ridit检验，P〈0.01，说明造模成功。与模型组比，大剂量虎杖总蒽醌组大部分胰岛细胞胞浆丰富，胰岛体积增大，少部分细胞萎縮，无变性水肿改变，经Ridit检验，P<0.01。中剂量虎杖总蒽醌组胰岛细胞大部分细胞萎縮，细胞胞浆明显减少，细胞核呈现密集现象，而少部分细胞出现变性水肿现象，经Ridit检验，P〈0.05;二甲双胍组有改善胰岛损伤的趋势。结果提示，虎杖总蒽醌对链脲佐菌素所致的胰岛损伤有保护作用。(四)虎杖总蒽醌对a-葡萄糖苷酶活力的影响1实验材料1.1试剂a-葡萄糖苷酶，sigma公司，Lot081K7415;PNPG(4—硝基酚一a—D一吡喃葡萄糖苷)，sigma公司；谷胱甘肽，sigma公司；虎杖总蒽醌，双蒸水，67mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)，0.1mol/LNa2C03。1.2仪器752分光光度计，上海第三分析仪器厂；FA(N)/JA(N)系列电子天平，上海民桥精密仪器有限公司；TGL-16G高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂；可调式移液器，上海雷勃分析仪器有限公司。2实验方法通过检测a-葡萄糖苷酶的活性降低，间接测定虎杖总蒽醌对a-葡萄糖苷酶的抑制活性。对照管中a-葡萄糖苷酶活力测定以PNPG(4—硝基酚一a—D—吡喃葡萄糖苷)为底物。反应系统为67mmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)1.7ml、lmg/ml还原型谷胱甘肽50u1、20mg/mla-葡萄糖苷酶1，37。C保温10min后，加入0.010mol/LPNPG50ul，于37。C反应10min后，加入0.1mol/LNa2C03终止液lOrnl。在400nm处测定在酶的作用下释放出硝基酚的量(A2值)。虎杖总蒽醌抑制活性的测定精确称取虎杖总蒽醌100mg,用活性炭脱色，干燥，加双蒸水至5ml，配制成浓度为20mg/ml的虎杖总蒽醌溶液。分别取25，50，100，200，400ta溶液加入到酶活力测定系统中(系统缓冲液体积相应减少)，而后先与酶保温(37'C)10min，再加底物反应10min，Na2C03终止反应，测定400nm处吸收值(A3值)。以中药药液提取物加缓冲液为空白管，反应步骤同上，测定400nm处吸收值(Al值)。均以缓冲液加谷胱苷肽加PNPG加终止液为调零管。3统计学处理数据分析用SPSS10.0forwindows统计软件，采用曲线拟合进行统计分析。a-葡萄糖苷酶活力单位的定义pH6.8、37'C时每分钟释放l"molPNP为一个活力单位。抑制剂活力单位的定义PH6.8、37"C相同时间内能使一个酶活力单位失活为一个抑制单位。抑制百分率=抑制剂活力/酶活力X100%考虑到本实验的酶活力与抑制剂活力的测定方法相同，主要试剂用量一致，故抑制百分率的计算公式简化为抑制百分率=A/BX100%。注A=对照管A2值一(测试管A3值一空白管A1值)B二对照管A2值。结果见表ll。_表ll不同体积虎杖总蒽醌对a-葡萄糖苷酶活力的影响加样体积对a-葡萄糖苷酶活力的抑制率(％)("l)第一批第二批第三批第四批平均抑制率(％)2530.628.930.136.031.405056.452.249.960.254.6810071.468.288.481.677.6520080.890.892.888.988.8340087.698,699.699.096.20由图3可知在一定范围内不同量的虎杖总蒽醌对a-葡萄糖苷酶有抑制活性，曲线拟合分析表明不同量的虎杖总蒽醌同a-葡萄糖苷酶活性抑制率存在S形曲线模型关系。方程为lny=0.004141+(-31.426988/x)(F=758.43959，P值(SignifF)二O.000K0.0005，按0.05检验水准，拒绝无效假设，可认为方程显著。其中自变量T值=-27.540，P-0.0001,按0.05检验标准，拒绝无效假设，可认为自变量X的回归系数不为O。)经计算，加入45.07u1(20mg/ml)虎杖总蒽醌溶液可产生50%以上的抑制活性，提示其对于a-葡萄糖苷酶有较好的结合能力和较强的抑制作用。(五)结论蒽醌是虎杖的主要活性成分之一，根据大量的相关文献资料、本实验室的前期研究资料及本次实验研究结果，我们认为蒽醌是其降糖的主要活性部位。虎杖总蒽醌能明显降低由肾上腺素、四氧嘧啶所造高血糖小鼠模型血糖水平和链脲佐菌素所造大、小鼠糖尿病模型血糖和糖化血清蛋白水平，有促进胰岛素分泌和肝糖原形成的趋势，能降低糖尿病模型大鼠甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白水平，升高高密度脂蛋白水平，能降低血中过氧化脂质中间产物MDA水平，提高SOD活力。通过光镜病理观察分析表明虎杖总蒽醌可以保护造模大、小鼠的胰岛细胞，对抗造模药物对胰岛细胞的损伤，对造模大鼠的肾脏有保护作用，可减轻远曲小管上皮细胞水肿状态；电镜观察分析表明虎杖总蒽醌可增加大鼠肾小管上皮细胞线粒体数量，减少线粒体异染色质数量，减轻线粒体嵴的溶解和消失；通过对组织微观结构的改善一定程度上有利于延缓糖尿病大鼠肾脏的病变过程。另外虎杖总蒽醌体外可以降低a-葡萄糖苷酶活性。虎杖总蒽醌的降糖作用与其促进胰岛素分泌、促进糖原合成、调节自由基代谢有一定的关系。同时，还可以降低糖化血清蛋白水平、降低血脂水平，从而延缓糖尿病并发症的发生和发展，有效应用于制备糖尿病及其并发症药物，是虎杖药用上的一大创新，有突出的经济和社会效益，为中医药学作出创造性贡献。权利要求1、一种从虎杖中提取的一种治疗糖尿病及并发症的物质，其特征在于，该物质由虎杖干燥根茎及根的切片制成，取虎杖切片，粗粉碎，置圆底烧瓶中，加6倍量质量浓度为70％的乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤，药渣加6倍量质量浓度为70％的乙醇再回流提取1次，提取2h，过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓缩后加入预处理和再生的大孔吸附树脂柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用质量浓度为70％乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含蒽醌类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干即得虎杖提取物质总蒽醌，得率为2-2.5％，纯度64-70.7％。所说的预处理与再生的大孔吸附树脂柱为所用的大孔吸附树脂要经过预处理和再生，其中预处理是取D301大孔吸附树脂用质量浓度为95％的乙醇浸泡24h，不断搅拌，除去气泡后装入柱中，用质量浓度为95％的乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣，再依次用3倍体积的1mol/LNaOH水溶液、2倍体积的蒸馏水、3倍体积的1mol/LHCL水溶液洗脱，最后用蒸馏水洗脱至pH中性，之后，对大孔吸附树脂再生，即用1mol/LNaOH水溶液洗脱，洗至洗脱液透明，然后用2倍体积蒸馏水洗脱，再用1mol/LHCL水溶液洗脱，洗至洗脱液透明，最后用蒸馏水洗脱至pH中性。2、根据权利要求1所述的从虎杖中提取的一种治疗糖尿病及并发症的物质，其特征在于，该物质由虎杖的根茎及根去其泥土，洗静，粉碎成粗粉，取1000克粗粉，加6000ml的质量浓度为70﹪的乙醇浸泡30min后，回流提取2h，过滤，得药液备用，药渣再加入6000ml质量浓度为70﹪的乙醇，回流提取2h，过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓縮至50%的体积后，加入预处理和再生的大孔吸附树脂柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用质量浓度为70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含蒽醌类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干得虎杖提取物总蒽醌21.25克，纯度为70.7%。3、从虎杖中提取的一种治疗糖尿病及其并发症的物质为制备治疗糖尿病及其并发症药物的应用。全文摘要本发明涉及从虎杖中提取的一种治疗糖尿病及并发症的物质，可有效制备治疗糖尿病及其并发症的药物，解决糖尿病及其并发症的治疗问题，该物质为虎杖粗粉，置圆底烧瓶中，加6倍量乙醇浸泡后，回流提取，过滤，药渣加6倍量乙醇再回流提取，过滤，合并2次滤液，减压回收乙醇，浓缩后加入预处理和再生的大孔吸附树脂柱中，用蒸馏水洗脱至洗脱液无色，然后用质量浓度为70％的乙醇洗脱，收集洗脱液，至洗脱液中不含蒽醌类成分为止，回收乙醇，水浴上挥干即得虎杖提取物质总蒽醌，其产品制备方法科学，易操作，制备物质总蒽醌质量好，纯度高，使用效果好，有效用于制备治疗糖尿病及其并发症药物，是虎杖药物开发与应用上的一大创新，造益于人类。文档编号A61K36/704GK101204428SQ20071019316公开日2008年6月25日申请日期2007年12月17日优先权日2007年12月17日发明者苗明三申请人:苗明三