脑损伤和疾病的mapc治疗的制作方法

专利名称：脑损伤和疾病的mapc治疗的制作方法
技术领域：
本发明的领域是4吏用多能成体3且细胞(multipotent adult progenitor cells, "MAPCs")治疗脑损伤、障碍、功能异常和疾病，特别是治疗缺氧 性和缺血性脑损伤，其包括但不限于缺氧性-缺血性脑损伤和中风。
背景技术：
脑损伤，包括脑疾病，在美国和全世界都是一种主要的健康问题。 许多脑损伤起因于缺氧，包括通常由给脑供应血液的狭窄或阻塞引起的 局部性缺氧，和通常由压缩受试者的空气供应引起的弥散性缺氧。局部
性缺氧可导致，例如，皮层梗死(cortical infarcts )和中风。弥散性缺氧 可导致缺氧性缺血性脑损伤("HI损伤")。皮层梗死和中风以及HI损伤是 重要的健康关注点。
HI损伤及其相关的结果每年影响着显著数量的活产。在儿童中测定 缺血性和缺氧性脑损伤的发病率和影响是复杂的；但是，通过任何评估 的染病患者数目都是巨大的。HI损伤发病率高达1/4000的活产。参见 Nelson W 丄朋cWA^wo/. 2:150-158 (2004)。这些婴儿大多数存活，具 有相当多的认知和运动缺陷。参见Barker,爿朋A/^/. H: Suppl 1:3-6 (1999)。因所有原因所致新生儿脑病发生于每1000个出生中的1至6个。 参见,例如，美国妇产科学会(American College of Obstetricians and Gynecologists)网址www.acog.org。产时新生儿窒息的风险估计有全部 活产的2.5%。参见Heinonen " 5J(9G巡261-264 (2002)。此大量的 婴儿中，较少量会经历明显足以产生与运动和认知残疾相关的脑损伤的 HI脑病。在美国，大脑性瘫痪，或者慢性、非进行性运动残疾，每1000 个人中影响到l至2个。这些患者的约6%通过与HI损伤相关的产伤而 获得其残疾。参见，例如，NINDS网址www.ninds.nih.gov。
目前HI损伤的足月儿全部临床结果很少。所有罹患HI损伤的足月 新生儿中，10°/。死亡，30%永久的神经损伤。参见Volpe, NEUROLOGY OF THE NEWBORN, 4th Ed" W.B. Saunders, Philadelphia ( 2001)。近来公 开的I期低体温试-验，即在足月儿中缺氧性-缺血性脑病的低体温的随机 对照试验的对照组产生的统计结果中，甚至发现更高水平的死亡率所 包括的新生儿中37%死亡，25%神经性损伤。参见Shankaran W a/., W 五"g〃她d坦1574-1584 (2005)。
除了支持疗法以外，HI损伤的治疗是有限的。在新生儿HI治疗中 的多中心I期临床试验中，已报道全身低体温是安全并且有益的。然而， 治疗的有效性显示限于出生后的短时间内。参见上文引述的Shankaran (2005)。
治疗的缺少、患病个体数量、结合便于护理和终生康复所需费用，显示HI损伤代表了流行的、重要的、尚未满足的医学需要。还同样适 用于多种其它病症，所述病症特征在于损伤脑组织，特别是皮层脑组织， 例如由缺氧、梗死及其它损伤和/或创伤所导致的那些，例如产生缺血和 /或坏死的损伤，例如导致和/或相关于HI脑损伤、脑意外和/或中风的缺 血和/或坏死。因此需要改进的方法，以用于治疗这些以及相关和相似的 损伤、病理和疾病。
干细胞的应用针对此目的已引起了一些兴趣，并且在此领域有一些 令人鼓舞的观测结果。在近年有多种干细胞已被分离和表征。它们是从 高度受限的分化潜能和在培养物中生长的有限能力的那些，到明显不受 限的分化潜能和在培养物中生长的无限能力的那些。前者通常更容易衍 生，并且能够从不同的成人组织获得。后者必须衍生自生殖细胞和胚胎， 并且被称为胚胎干("ES")细胞、胚胎生殖("EG")细胞和生殖细胞。胚胎 干("ES")细胞能无限的自我更新，并且可分化成所有的组织类型。ES细 胞得自胚泡的内细胞群。胚胎生殖("EG")细胞得自植入后胚胎的原始生 殖细胞。得自成体组织的干细胞价值有限，原因是它们是免疫原性的， 具有有限的分化潜能，并且具有有限的在培养物中繁殖的能力。ES、 EG 和生殖细胞不会遇到这些不利点，但是它们具有在同种异体宿主中形成 畸胎瘤的明显倾向，提高了它们在医学治疗中的预期担忧。对于此原因， 尽管它们的有利地扩大的分化潜能，但令人悲观的是有关它们在临床应 用中的效用。得自胚胎的干细胞还受到伦理学的争论，其可能防碍它们 在治疗疾病中的应用。
寻找替代ES、 EG和生殖细胞的一些努力已集中于得自成体组织的 细胞。虽然成体干细胞已在大多数哺乳动物组织中净皮鉴别，它们的分化 潜能是有限的，并且比ES、 EG和生殖细胞狭窄得多。事实上许多这类 细胞仅能引起一种或少数的分化细胞类型，并且许多其它的细胞限于单 一的胚细胞系。例如，造血干细胞仅能分化形成造血细胞系，神经干细 胞分化成仅神经外胚层的起源的细胞，并且间质干细胞("MSCs")限于间 质起源的细胞(中胚层的细胞类型)。相应地，这些类型的干细胞固有地 限于它们的治疗适用性。
相应地，有需要可用于治疗皮层梗死、HI损伤和其它疾病的干细胞， 所述干细胞具有ES、 EG和生殖细胞的自我更新和分化能力但不是免疫 原性的；当对于宿主是同种异体移植的或异种移植的时候不会形成畸胎瘤；不会出现与ES、 EG和生殖细胞相关的其它安全问题；保持ES、 EG和生殖细胞的其它优点；容易从易得来源中分离，该易得来源例如 胎盘、脐带、脐带血、血液和骨髓；可以长时间安全保存；可以容易获 得并且对志愿者、供体或患者以及其它表示同意者无风险；以及不会使 人承担与获得和操作ES、 EG和生殖细胞相关的技术和后勤的困难。
一种在本文称为多能成体祖细胞("MAPCs，，)的细胞类型已被分离 和表征(参见，例如，美国专利No.7,015,037,通过引用以其全部内容并 入本文)。("MAPCs"还称为"MASCs")。这些细胞提供了ES、 EG和生殖 细胞的许多优点而无它们的多数缺点。例如MAPCs能够无限的生长而 不丧失它们的分化潜能。它们在NOD-SCID小鼠中随多重发育语系显示 高效、长期的移入和分化，并且同时没有畸胎瘤形成(ES、 EG和生殖细 胞常见)的迹象(Reyes, M. and C.M. Verfaillie爿朋W爿cad 塑: 231-5 (2001))。
发明概述
因此，在它的一些实施方案中，本发明提供了治疗脑损伤、功能异 常、障碍或疾病的方法，其通过(a)给罹患脑损伤、功能异常、障碍和/ 或疾病的受试者施用细胞(MAPCs),该细胞(i)不是胚胎干细胞、不是 胚胎生殖细胞并且不是生殖细胞；(ii)可以分化成内胚层的、外胚层的和 中胚层的胚细胞系中的至少两种中每种细胞系的至少一种细胞类型；(b) 有或无附加的免疫抑制治疗。
在实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和/或疾病是大脑的损伤、 功能异常、障碍和/或疾病。在实施方案中它是在大脑皮层中的和/或大 脑皮层的损伤、功能异常、障碍和/或疾病。在实施方案中它是在海马中 的和/或海马的损伤、功能异常、障碍和/或疾病。在实施方案中它是在 脑皮层中的和/或脑皮层(还称为脑的皮层区域)的损伤、功能异常、障碍 和/或疾病。
在有关上述各个和全部的实施方案中，特别值得一提的是，所述损 伤、功能异常、障碍和/或疾病是与缺氧相关和/或因缺氧引起的损伤、 功能异常、障碍和/或疾病。在此关注的实施方案中，所述损伤、功能异 常、障碍和/或疾病是因缺氧引起的。在此关注的实施方案中，所述缺氧 是局部的。在此关注的实施方案中，所述缺氧是弥散的。在此关注的实施方案中，所述疾病是缺氧性缺血性脑损伤。
在进一步的有关相同的实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和 /或疾病是与血液供应不足相关的和/或因血液供应不足引起的损伤、功 能异常、障碍和/或疾病。在此关注的实施方案中，所述损伤、功能异常、 障碍和/或疾病是因动脉或静脉狭窄或阻塞引起的，其包括但不限于血栓 或栓塞引起的阻塞。在此关注的实施方案中，所述损伤、功能异常、障 碍和/或疾病是与梗死和/或缺血相关的和/或因梗死和/或缺血引起的。在 此关注的实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和/或疾病是与坏死相 关的和/或因坏死引起的。在此关注的实施方案中，所述梗死是皮层梗死。
在此关注的实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和/或疾病是中风。
在本发明的实施方案中，所述细胞(MAPCs)单独使用。在实施方案 中，所述细胞与其它治疗剂一起作为主要治疗形式使用。在实施方案中， 所述细胞作为唯一治疗剂使用。在一些实施方案中，所述细胞与一种或 多种其它治疗剂一起使用。在一些实施方案中，所述细胞单独使用或者 与一种或多种其它治疗剂在一种或多种主要治疗形式中使用。在一些实 施方案中，所述细胞单独使用或者与一种或多种其它治疗剂在一种或多 种附加治疗形式中使用。在一些实施方案中，所述细胞单独使用或者与 一种或多种其它治疗剂在一种或多种主要治疗形式中或在一种或多种 附加治疗形式中使用。
在一些方面和实施方案中，本发的主题进一步说明性地描述于下文 编号段落中。所述段落是说明而非限制本发明，并且本发明的全部理解 仅通过阅读本公开的全部内容即可获得，所述全部内容包括全部正文、 全部附图、由此提供的摘要，并且所述全部内容根据所述观点以及用与 此相关的和本发明适合的本领域技术人员的知识和经马全说明性地描述 来解释本文的主题。
在任一给定编号段落中引述的短语"根据上文或下文任一项的，，表 示该段落的主题单独地与任意一个或多个其它编号段落的主题呈各种 可能组合。在这方面，所述段落明确地支持要求本文引述主题的所有这 些组合。在某些实例中，其中编号段落的主题被从不同编号段落的主题 组合中排除，所述的排除是通过短语"根据上文或下文任一项的，除了 某编号以外"来表示的，其中所述的编号被当作该被排除的段落。
1.在受试者中治疗脑损伤和/或脑功能异常、和/或脑障碍和/或脑疾病的方法，其包括给可能罹患、正在罹患或已经罹患脑损伤和/或脑 功能异常、和/或脑障碍和/或脑疾病的受试者，通过有效途径并以有效 治疗所述脑损伤和/或脑功能异常、和/或脑障碍和/或脑疾病的量，施用 细胞(MAPCs),该细胞不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞， 并且可以分化成内胚层的、外胚层的和中胚层的胚细胞系中的至少两种 中每种细胞系的至少 一种细胞类型。
2. 根据上述或下述任一项的方法，除了60-65以外，其中所述的受 试者未用免疫抑制治疗附加性地与所述细胞一起治疗。
3. 根据上述或下述任 一 项的方法，其中所述的脑损伤和/或脑功能 异常、和/或脑障碍和/或脑疾病是因缺氧引起的。
4. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的脑损伤和/或脑功能 异常、和/或脑障碍和/或脑疾病是因给脑的血液供应的闭塞或阻塞引起 的。
5. 根据上述或下述任 一 项的方法，其中所述的脑损伤和/或脑功能
异常、和/或脑障碍和/或脑疾病是梗死。
6. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的脑损伤和/或脑功能 异常、和/或脑障碍和/或脑疾病是皮层梗死。
7. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的脑损伤和/或脑功能 异常、和/或脑障碍和/或脑疾病是中风。
8. 根据上述或下述任 一 项的方法，其中所述的脑损伤和/或脑功能 异常、和/或脑障碍和/或脑疾病是缺氧性缺血性脑损伤。9. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞在所述受试者 中不是免疫原性的。
10. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞可以分化成内 胚层的、外胚层的和中胚层的胚细胞系中每种细胞系的至少 一种细胞类 型。
11. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞表达端粒酶。
12. 才艮据上述或下述任一项的方法，其中所述的细月包对oct-3/4呈阳性。
13. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞在它们施用于
所述受试者之前在培养物中经历至少10至40细胞倍增。
14. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
15. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞是人、马、牛、 山羊、绵羊、猪、大鼠或小鼠细胞。
16. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞是人、大鼠或 小鼠细胞。
17. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞是人细胞。
18. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞得自从以下任 一项分离的细胞胎盘组织、脐带组织、脐带血、骨髓、血液、脾组织、 胸腺组织、脊髓组织、脂肪组织和肝脏组织。
19. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞得自从以下任 一项分离的细胞胎盘组织、脐带组织、脐带血、骨髓、血液和脾组织。
20. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞得自从以下任
一项分离的细胞胎盘组织、脐带组织、脐带血、骨髓或血液。
21. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞得自从骨髓或
血液中的任意 一种或多种分离的细月包。
22. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞对于所述受试 者是同种异体的。
23. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞对于所述受试 者是异种的。
24. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞对于所述受试 者是自体的。
25. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的受试者是哺乳动物。
26. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的受试者是哺乳宠物 动物、哺乳家畜动物、哺乳研究动物或非人类灵长动物。
27. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的受试者是人。
28. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞以一种或多种 剂量施用于所述受试者，所述剂量包括104至108所述细胞/千克所述受 试者质量。
29. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞以一种或多种 剂量施用于所述受试者，所述剂量包括105至107所述细胞/千克所述受 试者质量。30. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞以一种或多种 剂量施用于所述受试者，所述剂量包括5x 106至5乂 107所述细胞/千克 所述受试者质量。
31. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞以一种或多种
剂量施用于所述受试者，所述剂量包括2x 1(^至4x 107所述细胞/千克 所述受试者质量。
32. 根据上述或下述任一项的方法，其中除所述细胞之外， 一种或
多种因子被施用于所述受试者。
33. 根据上述或下述任一项的方法，其中除所述细胞之外， 一种或
多种生长因子、分化因子、信号因子和/或增加归巢(Homing)的因子被施 用于所述受试者。
34. 根据上述或下述任一项的方法，其中除所述细胞之外， 一种或 多种细胞因子被施用于所述受试者。
35. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞附加于另一治 疗施用于受试者，所述另一治疗是在所述细胞施用之前、同时或之后施用。
36. 根据上述或下述任一项的方法，其中另外的一种或多种抗生素 剂被施用于所述受试者。
37. 根据上述或下述任一项的方法，其中另外的一种或多种抗真菌 剂被施用于所述受试者。
38. 根据上述或下述任一项的方法，其中另外的一种或多种抗病毒 剂^L施用于所述受试者。
39. 根据上述或下述任一项的方法，其中抗生素剂和/或抗真菌剂和 /或抗病毒剂中的两种或多种的其它任意组合被施用于所述受试者。
40. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞在制剂中^皮施 用，该制剂包含一种或多种其它药物活性剂。
41. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞在制剂中^1施 用，该制剂包含一种或多种抗生素剂。
42. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞在制剂中#:施
用，该制剂包含一种或多种抗真菌剂。
43. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞在制剂中#1施 用，该制剂包含一种或多种抗病毒剂。
44. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过肠胃外途 径施用于所述受试者。
45. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过下述肠胃 外途径中的任意一种或多种施用于所述受试者静脉内、动脉内、心脏 内、脊柱内、鞘内、骨内、关节内、滑液内、皮内、真皮内、皮下和月几 内注射。
46. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过下述肠胃 外途径中的任意一种或多种施用静脉内、动脉内、皮内、真皮内、皮 下和月几内注射。
47. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过下述肠胃
外途径中的任意一种或多种施用静脉内、动脉内、皮内、皮下和肌内注射。
48. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过皮下注射 针头经注射器施用于所述受试者。
49. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过导液管施 用于所述受试者。
50. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过外科植入 施用。
51. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过使用关节 镜操作经植入施用于所述受试者。
52. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞通过立体定位 注射施用于所述受试者。
53. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞在支持体内或 支持体上施用于所述受试者。
54. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞以包嚢化的形 式施用于所述受试者。
55. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞被配制成适合 通过下述途径中的任意一种或多种施用口服、直肠、皮肤外
(epicutaneous )、目艮、鼻和肺。
56. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞以一个剂量施 用于所述患者。
57. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞是在连续两个或多个剂量的系列中施用于所述受试者。
58. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞是以单个剂 量、两个剂量或多于两个剂量施用，其中所述剂量相同或不同，并且它 们是以它们之间相等或不等的间隔施用。
59. 根据上述或下述任一项的方法，其中所述的细胞是历经以下的
期间施用的少于l天至l周、1周至1月、1月至1年、l年至2年、
或长于2年。
60. 根据上述或下述任一项的方法，除了2以外，其中除了用所述
细胞治疗外，所述受试者已经、将会、或正在用一种或多种免疫抑制剂 治疗。
61. 根据上述或下述任一项的方法，除了2以外，其中除了用所述
细胞治疗外，所述受试者已经、将会、或正在用以下的一种或多种治疗 皮质类固醇、环孢菌素A、环孢菌素类免疫抑制剂、环磷酰胺、抗胸腺 细胞球蛋白、硫唑嘌呤、雷帕霉素、FK-506和除FK-506以外的大环内 酯类免疫抑制剂、以及免疫抑制单克隆抗体剂(即， 一种免疫抑制剂，其 是一种免疫抑制单克隆抗体或者是一种在整个或者在一个或多个部分 包含单克隆抗体的药剂，例如包括单克隆抗体Fc或Ag结合位点的嵌合 蛋白质)。
62. 根据上述或下述任一项的方法，除了2以外，其中除了用所述 细胞治疗外，所述受试者已经、将会、或正在用以下的一种或多种治疗 皮质类固醇、环孢菌素A、石危唑嘌呤、雷帕霉素、环》粦酰胺、FK-506、 或免疫抑制单克隆抗体剂。
63. 根据上述或下述任一项的方法，除了2以外，其中所述细胞在 制剂中被施用，该制剂包含一种或多种其它免疫抑制剂。
64. 根据上述或下述任一项的方法，除了2以外，其中所述细胞在 制剂中被施用，该制剂包含以下的一种或多种皮质类固醇、环孢菌素 A、环孢菌素类免疫抑制剂、环磷酰胺、抗胸腺细胞球蛋白、硫唑嘌呤、 雷帕霉素、FK-506和除FK-506以外的大环内酯类免疫抑制剂、以及免 疫抑制单克隆抗体剂。
65. 根据上述或下述任一项的方法，除了2以外，其中所述细胞在 制剂中被施用，该制剂包含以下的一种或多种皮质类固醇、环孢菌素 A、硫唑噤呤、环磷酰胺、雷帕霉素、FK-506、和免疫抑制单克隆抗体剂。
附图简述


图1是流程图，其显示用于本文描述的某些实施例的 一般试验方案， 如实施例1所述。
图2是一组图，其显示同基因性和同种异体MAPC移植物促进新生 HI大鼠行为恢复，如实施例2所述。运动和神经功能的行为试验是在第 7天和第14天、在接受同基因性和同种异体MAPC移植物的动物中进 行。在移植后第7天动物开始显示更少行为缺乏的趋势，然后到移植后 第14天显示明显减少的运动异常，其与对照比较。星号表示统计学显 著性为p<0.05,其与阴性对照比较(介质输注)。
图3是一个图，其显示MAPC移植物减少CA3神经元细胞在HI受 损动物中的损失，如实施例3所述。该图显示了由海马切片组织分析观 测的存活细胞。在移植MAPCs后第14天将动物处死。制备脑切片，Nissl 染色，才企查MAPC和介质治疗动物的海马神经元的存活率。对每一切片 受损伤的和未受损伤的对侧海马区域计算每个视野存活的细胞，并且比 较这些计数。未受损伤的海马细胞数取值为100%。该数据证明了 MAPC 移植后CA3区域中神经元的统计学显著性保护。(ANOVAF值为35.33, df =2, 19和pO扁l; Fisher posthoc为pO扁l)。
图4是一组图，其显示异种MAPC移植物外科诱导缺血性中风之后 促进成年大鼠行为恢复，如实施例7所述。运动和神经功能的行为试-睑 在诱导中风之后第14和21天进行(颅内移植后第7和14天)。动物接受 100,000、 200,000和400,000异种MAPC细胞或者仅为对照的介质PBS。 星号表示对照组和MAPC实验组之间的显著差异(重复测定ANOVA, pO.0001; Fisher' s PLSD posthoc t誦检验，p，s<0.0001)。
图5是一个图，其显示在大鼠缺血性中风之后异种和同种异体 MAPC移植物促进持久的和统计学显著性的运动恢复。运动功能的行为 试验在第14天进行，以及在此后56天中每第14天进行，如实施例10 所述。星号表示统计学显著性为pO.OOOl，其与阴性对照比较(非存活 的辐照的MAPCs)。
图6是一个图，其显示在大鼠缺血性中风之后异种和同种异体 MAPC移植物促进持久的和统计学显著性的神经恢复。神经功能的行为试^r在第14天进行，以及在此后56天中每第14天进行，如实施例10 所述。星号表示统计学显著性为pO.OOOl,其与阴性对照比较(非存活 的辐照的MAPCs)。
图7是一个图，其显示给缺血性中风大鼠施用异种MAPCs后运动 功能的剂量依赖性改善，如实施例12所述。运动功能的行为试验在第 14天进行，以及在此后56天中每第14天进行。星号表示统计学显著性 为p<0.01,其与阴性对照比较(非存活的辐照的MAPCs)。
图8是一个图，其显示用异种MAPCs治疗的缺血性中风大鼠的神 经功能的剂量依赖性改善，如实施例12所述。神经功能的Bederson试 验在第14天进行，以及在此后56天中每第14天进行。星号表示统计 学显著性为p<0.01,其与阴性对照比较(非存活的辐照的MAPCs)。
图9是一个图，其显示用异种MAPCs治疗的缺血性中风大鼠的运 动功能的剂量依赖性改善，如实施例14所述。测定运动功能的EBST 是在IV输注之后1周进行，然后8周中每周1次进行，以证明长期效 果。延迟1表示诱导缺血性损伤之后接受细胞1天的组，延迟2表示损 伤之后接受细胞2天的组，以及延迟7为缺血性损伤之后接受细胞7天 的组。星号表示统计学显著性为p<0.001,其与阴性对照比较(中风后第 7天提供的非存活的辐照的MAPCs)。
图IO是一个图，其显示剂量依赖性地改善用异种MAPCs治疗的缺 血性中风大鼠的神经功能，如实施例14所述。测定神经功能的Bederson 试验是在IV输注之后1周进行，然后8周中每周1次进行，以证明长 期效果。延迟1表示诱导缺血性损伤之后接受细胞1天的组，延迟2表 示缺血性损伤之后接受细胞2天的组，以及延迟7表示缺血性损伤之后 接受细胞7天的组。星号表示统计学显著性为p<0.001，其与阴性对照 比较(中风后第7天提供的非存活的辐照的MAPCs)。
图ll是图和照片，其显示缺血性中风大鼠内源性神经元细胞损失 通过IV输注MAPCs随时间而减小，如实施例16所述。在MAPC输注 开始之后第56天将动物处死。为测定神经元的存活率，制备脑切片， Nissl染色。在全部植入的动物中测定存活率，在损伤之后不同时间接受 MAPCs的动物中比举支神经元存活率。对同一切片对侧区域中每一受损 伤位置和未受损伤位置计算每个视野存活的细胞，并且比较结果。未受 损伤的对侧位置数值设为100%。显示于图11的该数据表明了 MAPC移植后半影区中神经元的统计学显著性保护。星号表示统计学显著性为
p<0.05，其与其它组比较。该图上方的嵌入物显示了受损伤位置的代表 性的横切面。
词汇表
一4殳地，术语和短语才艮据它们本领域已确定的含义应用于本文。^旦 是，为了避免可能的歧义，本文所用的某些术语和短语的含义描述如下 "A"或"an"表示一个或多个；至少一个。 "附加的，，表示共同地、 一起、除...之外还、结合，等。 "脑梗死(cerebral infract)，，、"脑梗死(ceberal infarction)，，是指大 脑的缺血性病症，其由到达或通过大脑的血流梗阻引起。脑梗死通常导 致组织坏死，该组织已经因该梗阻致丧失血流而失氧。脑梗死通常导致 持久的病灶神经缺乏。
"脑血管意外，，与中风含义相同。
"脑缺血，，是指当流到大脑的血液降低到维持正常神经功能的最小 需求以下时所发生的病症。脑缺血通常由以下引起颈动脉狭窄、基底 动脉狭窄、推动脉狭窄和脑血管闭塞性疾病。其还可由烟雾病(moyamoya disease)和Takayasu氏动脉炎引起。
"共同施用"可包括同时或连续施用两种或多种药物。 "皮层的"是指器官或部分器官等的外侧部分。例如大脑的外侧部分 是指大脑皮层。人大脑皮层为2-4 mm (0.08-0.16英寸)厚并且在许多复 杂的脑功能中发挥中枢作用。人大脑皮层的表面是褶叠的，并且皮层表 面的三分之二以上位于所述褶叠的沟中，称为"沟，，。大脑皮层的种系
发育较老的部分称为海马。更近发育的部分称为新-皮层。
"皮层梗死"是指与到脑皮层的血液供应丧失相关的梗死；通常是与 到大脑的血液供应丧失相关的梗死；皮层梗死具有几乎与脑梗死相同的 含义。
"细胞因子"是指诱导或提高细胞运动的细胞因子，例如MAPCs或 其它干细胞、祖细胞或分化细胞的归巢。细胞因子还可刺激此类细胞分裂。
如用于本文的，"有害的"表示有害的。顺便说明，如用于本文的， "有害的免疫应答"表示有害的免疫应答，例如不足或太弱的那些，太强的那些，和/或指向错误的那些。此外有害的免疫应答是干扰药物作用 的免疫应答，包括其它方面的正常免疫应答。实例包括涉及排斥移植体 和移植物的免疫应答，以及引起移植物抗宿主病的在移植物和移植物中 免疫活性细胞的应答。
"分化因子"是指细胞因子，例如生长因子，其诱导谱系定型。 "功能异常"表示，如用于本文的，障碍、疾病或不同于正常过程的 有害作用。顺便说明，皮层梗死和氧缺乏(缺氧)可引起功能异常，例如 或导致缺血性损伤。其它功能异常还包括，例如，涉及排斥移植体和移 植物的免疫应答，以及引起移植物抗宿主病的免疫活性细胞在移植物和 移植物中的应答，然后其通常必需用免疫抑制治疗法来治疗。
"EC细胞"是指胚胎癌细胞。
"有效量"、"有效剂量"等通常表示一种量，其提供了需要的局部和 全身作用。例如有效量是足以实现有益的或需要的临床结果的量。有效 量可以在单次施用中一次性全部提供，或者分成几份量并在多次施用中 提供有效量。例如，MAPCs的有效量可在一次或多次施用中被施用， 并且可以包括任何预先选择量的细胞。应当考虑的精确计算有效量可以 基于每一受试者的个体因素，包括他们的大小、年龄、损伤、和/或待治 疗的疾病或损伤、从操作发生或疾病开始时的时间量。对于给定受试者， 基于本领域常规的考虑，本领域技术人员能够确定有效量。因此，例如， 本领域熟练技术人员，例如医生，基于如本文和本领域公开的MAPCs 的已知性质，同时考虑前述因素，将能够确定对于给定受试者的有效量。 如用于本文的，"有效剂量"与"有效量"含义相同。
通常，在本上下文中的术语有效表示足以达到需要的结果，其可为 在一些关注项中改善的预后和/或更好的患者状态。通常它是指损伤、功 能异常、障碍或疾病的好转或治愈。在脑损伤、功能异常、障碍或疾病 的情况中，例如，有效剂量可以是达到需要的神经学结果的那种，所述 神经学结果可包括减少未用"有效，，量治疗时将会发生的细胞损伤、整 个地阻止进一步的细胞损伤、和/或使细胞损伤反转。在本上下文中，"有 效"还可定义为临床结果，例如无进一步的神经功能下降和/或神经功能 改善。在此方面，为此目的，神经功能的改善可经由看护提供者通过多 种试3全和测量的4壬意 一种来判断。
几乎同样地将有效剂量和量用于其它损伤、功能异常、障碍和疾病。"EG细胞"是指胚胎生殖细胞。
"移入"是指细胞接触并掺合到存在的感兴趣的体内组织中。 "富集的群体"表示相对于原始群体中的其它的细胞或组分而言
MAPCs数目的相对增加，例如相对于培养物例如原始培养物或者体内 中的一种或多种非-MAPC细胞类型而言MAPCs数目的增加。
"ES细胞"是指胚胎干细胞。
"扩张"是指未分化的一个或者多个细胞的繁殖。
"GVHD"是指移植物抗宿主病，其表示的是进程，该进程最初发生 于免疫妥协的宿主中，此时其经由移植物的免疫活性细胞被认为是非自 身的。
"HVG"是指宿主抗移植物应答，其表示当宿主排斥移植物时发生的 进程。通常，当移植物被认为是外来的(非自身的)时，该HVG是通过宿 主的免疫活性细胞而^皮触发。
"缺氧"是指氧缺乏。在神经学的语境中，它是指到达脑的氧减少， 虽然供血充足它也可能发生。缺氧可能起因于气哽、抑制(strangling), 窒息、头部创伤、 一氧化碳中毒、心脏停搏、以及全身麻醉及血流闭塞 或阻塞的并发症。脑缺氧导致事件的级联，该级联会导致细胞损伤和细 胞死亡。脑缺氧/缺血可由影响心血管泵送系统或呼吸系统的广泛疾病i普 引起。脑缺氧/缺血被分成四类局部脑缺血、整体脑缺血、弥散性脑缺 氧和脑梗死。
局部脑缺血(FCI)是由脑中的血凝块引起，该血凝块减少了患病区域 的血流。FCI的严重度不同，并且通常对敏感神经元引起不可逆的损伤。 整体脑缺血(GCI)由心室纤颤或心搏暂停引起，其终止了到达脑的血流。 从持续长于5至10分钟的GCI恢复是有问题的。更长的GCI通常是致 命的。弥散性脑缺氧(DCH)是由血氧合作用不足引起，并且通常导致轻 度至中度低氧血症。纯粹的DCH引起脑功能异常，但是不会导致不可 逆的脑损伤。其可由肺部疾病、高空病、或严重贫血引起。脑梗死(CI) 起因于脑区域中的局部血管闭塞，其可引起坏死。
"梗死(infarct)"、"梗死(infarction)"是指组织中的坏死区域， 其起因于缺血(血流梗阻)，所述缺血通常由血栓或栓塞引起。它还是指 血流中的梗阻，导致缺血，其通常由血栓或栓塞引起。
"免疫抑制"是指在受试者中防止、抑制和/或反转免疫应答，例如对外来抗原的免疫应答，例如同种异体或异异种细胞或组织。在某些情况 下，例如，免疫抑制治疗需要抑制受试者的免疫应答，该免疫应答可能 对用细胞或器官的移植物治疗受试者的需要的临床结果不利。
"缺血，，是指血液供应的限制，通常是由于血管阻塞，导致对该阻塞 的血管供氧的组织的功能异常或损伤。缺血还指到达身体部位的血流不 足，其由血管的收缩或阻塞引起。脑组织中缺血引发了一个级联(称为缺 血性级联)，其导致蛋白水解酶、活性氧簇、和可损伤并最终杀死脑组织 的其它物质释放。
"分离的"是指 一种细胞或多种细胞，它们与 一种或多种细胞或者一 种或多种细胞组分不相关联，而后者与体内或原始培养物中的一种或多 种细胞相关联。
"MAPC"是"多能成体祖细胞"的首字母缩写。它是指非-ES、非-EG、 非-生殖细胞，其可产生一种以上胚层的细胞镨系，例如所有三种胚层 (即，内胚层、中胚层和外胚层)。MAPCs还具有端粒酶活性。它们对 oct-3/4(例如，人oct-3A)可以是阳性的。它们还表达rex-l、 rox-l、 sox-2、 SSEA-4和/或nanog中的 一种或多种。在MAPC中的术语"成体"是非限 制性的。其仅表示不是ES、 EG或生殖细胞的那些细胞。通常，如用 于本文的，MAPC是单数，MAPCs是复数。MAPCs还称为多能成体干 细胞(MASCs)。参见，例如美国专利No.7,015,037,其通过引用并入本 文，作为本文公开的方法，以用于分离和生长MAPCs/MASCs,此类方 法仅仅是示例性和说明性的，并且不以任何方式限制可根据本发明使用 的jt匕类方法。
"MASC"参见MAPC。
"MNC"是指单核细胞。
"形式"表示类型、途径、手段或方法，例如，治疗形式；即治疗的类型。
"MSC"是间质干细胞的缩写。
有关MAPCs的"多能"是指分化时可产生一种以上胚层的细胞谱系， 例如所有三种原始胚层(即，内胚层、中胚层和外胚层)。
"持久性"是指细胞在体内抵抗排斥的能力，以及随时间(例如，数日、 数周、数月或数年)在数目上保持和/或增加的能力。
"原始培养物"是指细胞群体，其直接得自来自生物体的物质在传代培养前的分离块。通常，原始培养物是通过以下建立的(a)从生物体分 离组织；(b)将该组织解剖和/或分解，和(c)使来自该组织的细胞开始生 长，可混悬于介质中或者，更典型的，附加到培养容器的表面。原始培 养物不包括，并且优选地，传代培养分离块的细胞，例如通过细分或稀 释该细胞以及将它们重新接种于新鲜介质和/或新鲜培养容器中。通常， 附着细胞的原始培养物是通过使细胞从附着于适宜底物的组织碎片中 迁移出来而获得，或者是通过将该组织经机械或酶分解以产生细胞混悬 液而获得，然后将它们中的一些附着于底物。
用于多能成体祖细胞(MAPCs)的"祖(Progenitor)"表示这些细胞可 以产生其它细胞，例如进一步分化的细胞。该术语是非限制性的，并且 并不是将这些细胞限于具体的谱系。
"自我更新"是指产生复制子代干细胞的能力，该子代干细胞具有分 化成相同于其起源的那些细胞的潜能。用于本上下文的类似术语是"增 殖"。
"中风，，是急性神经损伤。其通过中断到达脑的血液供应而引起80% 的病例(指的是缺血性中风)，该供应的中断扰乱(梗死)、并且通常是打断 了脑的血液灌流。该打断可产生于动脉血流中的中断，^旦它还可产生于 静脉流中的中断。灌流被扰乱的那部分脑不能接受足够的氧，造成细胞 损伤和死亡。其结果是中风。
中风可导致暂时的神经损伤、永久损伤或死亡。损伤可能是局部性 的或全身性的。缺血性中风通常分类为血栓性中风、栓塞性中风、全身 性灌注不足(Watershed或BorderZone中风)或静脉血栓。血栓性中风是 由动脉狭窄通过血栓(通常包括动脉粥样硬化斑块)引起的。栓塞性中风 通过栓塞(最常见为血凝块)阻塞动脉而造成的。
"受试者"是脊推动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括，但 不限于，人类、畜养动物、体育动物和宠物。通过本发明方法需要治疗 的受试者包括罹患障碍、功能异常或疾病的那些，所述疾患例如皮层梗 死和/或缺氧性缺血性脑损伤、或者其副作用、或者其治疗，其可受益于 作为主要的或附加的治疗的MAPCs的施用。
如用于本文的，"移植物"表示引入到受试者中的细胞、组织或器官。 该移植物可得自所述受试者、得自培养物或者得自非受试者来源。
"治疗(treat)，，、"治疗(treating)，，、"治疗(treatment)，，等与患者的处理和护理有关，特别是有关与障碍或疾病的斗争，其包括但不 限于预防、改善、抑制和/或治愈缺乏、功能异常、障碍或疾病或其它导 致有害作用的其它进程，例如斗争、预防、改善、抑制和/或治愈损伤、 功能异常、障碍或疾病。还参见有效、有效量、有效剂量。
"治疗(therapy)"是治疗(treatment)的同义词。
发明详述
如本文描述的，根据本发明的某些方面和实施方案，MAPCs可用 于治疗脑损伤、功能异常、障碍和/或疾病，例如，但不限于皮层梗死和 缺氧性缺血性脑损伤，有和没有附加的免疫抑制治疗。
本发明不同的实施方案提供了使用MAPCs的方法，用于将脑的损 伤、功能异常、障碍和/或疾病排除、预防、斗争、改善、减轻、减少、 減到最小、消除和/或治愈等。在实施方案中，它是在脑皮层中和/或脑 皮层(还称为脑的皮层区域)的损伤、功能异常、障碍和/或疾病。在实施 方案中，它是在大脑中和/或大脑的损伤、功能异常、障碍和/或疾病。 在实施方案中，它是在大脑皮层中的和/或大脑皮层的损伤、功能异常、 障碍和/或疾病。在实施方案中，它是在海马中的和/或海马的损伤、功 能异常、障碍和/或疾病。
在有关上述各个和全部的实施方案中，特别值得一提的是，所述损 伤、功能异常、障碍和/或疾病是与缺氧相关和/或因缺氧引起的损伤、 功能异常、障碍和/或疾病。在此关注的实施方案中，所述损伤、功能异 常、障碍和/或疾病是因缺氧引起的。在此关注的实施方案中，所述缺氧 是局部的。在此关注的实施方案中，所述缺氧是弥散的。在此关注的实 施方案中，所述疾病是缺氧性缺血性脑损伤。
在进一步的有关相同的实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和
P;碍和/或:病、。在、此关注的实施^方案中，所述损伤 功能异常、障碍和 /或疾病是因动脉或静脉狭窄或阻塞引起的，其包括但不限于血栓或栓塞 引起的阻塞。在此关注的实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和/ 或疾病是与梗死和/或缺血相关的和/或因梗死和/或缺血引起的。在此关 注的实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和/或疾病是与坏死相关的 和/或因坏死引起的。在此关注的实施方案中，所述梗死是皮层梗死。在此关注的实施方案中，所述损伤、功能异常、障碍和/或疾病是中风。
本发明实施方案提供了使用MAPCs的方法，其中使用了附加的免 疫抑制治疗和/或治疗。实施方案提供了使用MAPCs的方法，其中未使 用附加的免疫抑制治疗。
因此，在它的一些实施方案中，本发明提供了细胞，该细胞(i)不 是胚胎干细胞、不是胚胎生殖细胞并且不是生殖细胞；(ii)可以分化成内 胚层的、外胚层的和中胚层的胚细胞系中的至少两种中每种细胞系的至 少一种细胞类型；以及(iii)对治疗脑损伤和/或功能异常和/或障碍和/或疾 病是有效的。
在实施方案中，所述的脑损伤和/或功能异常和/或障碍是由氧缺乏 引起和/或与氧缺乏相关。在实施方案中，它是由缺氧引起或与缺氧相关。 在实施方案中，它是由血液供应的狭窄或阻塞引起或与血液供应的狭窄 或阻塞相关。在实施方案中，它是梗死和/或缺血或与梗死和/或缺血相 关。在实施方案中，它是中风。在实施方案中，它是缺氧缺血性脑损伤。 在实施方案中，它是皮层梗死或与皮层梗死相关。
在本发明的实施方案中，所述细胞在其中单独使用或者和其它治疗 剂和形式作为主要治疗形式一起使用。在本发明的一些实施方案中，所 述细胞作为唯一治疗剂使用或者与其它治疗剂 一起使用。在本发明的一 些实施方案中，所述细胞单独使用或与其它治疗剂或形式使用，均在一 种或多种主要治疗形式中以及在一种或多种附加的治疗形式中。
MAPCs
根据本发明的细胞在此作更详细地描述，并且在本文通常是指"多 能成体祖细胞"，以及首字母缩写"MAPC"(并且"MAPCs，，通常用作复数)。 应当理解，这些细胞不是ES、不是EG、并且不是生殖细胞，并且它们 具有分化成三种原始胚层谱系(外胚层、中胚层和内胚层)中的至少两种 的细胞类型，例如分化成所有三种原始镨系的细胞。
MAPCs可以形成以下细胞，例如，特别值得一提的是，内脏中胚层 细胞、肌细胞，骨细胞，软骨细胞，内分泌细胞、外分泌细胞、内皮细胞、 毛发形成细胞、牙形成细胞、内脏中胚层细胞、造血细胞、基质细胞、 骨髓基质细胞、神经元细胞、神经外胚层的细胞、上皮细胞、目艮细胞、 胰脏细胞和肝细胞类细胞，以及特别值得一提的许多相同谱系的细胞。例如，在由MAPCs形成的细胞中是成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、 骨骼肌肉细胞、骨骼肌细胞、胆上皮细胞、胰腺腺泡细胞(pancreatic acinary cells)、系膜细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、cardiomyocytes、骨 细胞、血管形成细胞、少突胶质细胞、神经元(其包括5-羟色胺能、GABA 能、多巴胺能神经元)、神经胶质细胞、小神经胶质细胞、胰脏上皮细胞、 肠上皮细胞、肝上皮细胞、皮肤上皮细胞、肾上皮细胞、肾脏上皮细胞、 胰岛细胞、成纤维细胞、肝细胞，以及特别值得一提的是如前述的相同 i普系的其它细月包。
MAPCs具有端粒酶活性，其对于自我更新以及避免复制性衰老是 必需的。通常它们还表达oct-3/4。 Oct-3/4(在人中为oct-3A)特别不同于 ES、 EG和生殖细胞。它^fe认为是具有广泛分化能力的未分化细胞的标 志物。Oct-3/4通常还被认为具有维持细胞在未分化状态下的作用。Oct-4 (在人中为oct-3)是一种转录因子，其表达于原肠形成前期胚胎、早期卵 裂期胚胎、胚泡的内细胞群的细胞和胚胎癌("EC")细胞(Nichols, J. et al. (1998)^195: 379-91)，并且当细胞被诱导分化时其被下调节。oct-4(在 人中为oct-3)基因转录到人的至少两种剪接变体即oct-3A和oct-3B中。 oct-3B剪接变体发现于许多分化细胞中，然而oct-3A剪接变体(以前还 表示成oct-3/4)被报道对未分化的胚胎干细胞是特异的。参见Shimozaki et al. (2003) Development 130: 2505-12。 oct-3/4的表达在决定胚胎发生 和分化的早期步骤中发挥重要作用。Oct-3/4与rox-1 —起引起Zn-指蛋 白rex-1的转录激活，其还^皮要求保持ES细胞呈未分化的状态(Rosf5ord, E. and Rizzino, A. (1997) Biochem Biophvs Res Commun 203: 1795-802; Ben-Shushan, E. et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 1866-78)。
MAPCs还可表达其它标记物。它们是rex-l、 rox-1和sox-2。 rex-1 :故oct-3/4控制，该oct-3/4激活rex-1的下游区表达。rox-1和sox-2在非 -ES细胞中表达。
在本发明的一些实施方案中，将MAPCs与一种或多种其它药物和/ 或治疗形式作为主要治疗形式使用。在本发明的一些实施方案中，所述 细胞作为附加的治疗形式使用，即作为另一主要治疗形式的附加物。在 一些实施方案中，所述细胞用作附加的治疗形式的唯一活性剂。在其它 实施方案中，所述细胞与一种或多种其它药物或治疗形式一起作为附加 的治疗形式使用。在一些实施方案中，所述细胞既作为主要的又作为附加的治疗药物和/或形式4吏用。在此两方面，细月包可以单独在主要的和/ 或在附加的形式中使用。它们还可以与其它治疗剂或形式一起，在主要 的或在附加的形式中或者在两种形式中使用。
如上文所述，主要的治疗，例如治疗药物、治疗、和/或治疗形式， 靶向于(即，将要作用于)主要的功能异常，例如疾病，也就是待治疗的。 附加的治疗，例如治疗和/或治疗形式，可以与主要治疗(例如治疗药物、 治疗、和/或治疗形式)组合施用，以作用于主要的功能异常，例如疾病， 以及所述主要的治疗的补充的作用，从而增加该治疗方案的总体效果。 也可以施用附加的治疗，例如药物、治疗、和/或治疗形式，以作用于主 要的功能异常的并发症和/或副作用，所述功能异常例如疾病和/或由治 疗例如治疗药物、治疗、和/或治疗形式引起的那些。关于这些应用的任 一种， 一种、两种、三种或更多种主要的治疗可以与一种、两种、三种 或更多种附加的治疗一起使用。
在一些实施方案中，将MAPCs在功能异常例如疾病和/或副作用发 病之前施用于受试者。在实施方案中，将所述细胞在功能异常发展时施 用。在一些实施方案中，将所述细胞在功能异常确立之后施用。MAPCs 可以在功能异常的发展、持久、和/或传播的任何阶段或者其消退之后施 用。
如上文所述，本发明的实施方案提供了用于主要的或附加的治疗的 细胞和方法。在本发明的某些实施方案中，所述细胞被施用于同种异体 受试者。在一些实施方案中，它们对于所述受试者是自体的。在一些实 施方案中，它们对于所述受试者是同基因性的。在一些实施方案中，所 述细胞对于受试者是异种的。不论是同种异体、自体的、同基因性的、 或异种的，在本发明不同的实施方案中，所述MAPCs在所述受试者中 仅是弱免疫原性的或者是非-免疫原性的。在实施方案中，所述的MAPCs 具有充分低的免疫原性或者是非-免疫原性的，并且有害的免疫应答大体 上基本没有，即当施用于同种异体受试者时，它们可用作"万能"供体 细胞而无组织分型和匹配。根据本发明不同的实施方案，所述的MAPCs 还可保存并维持在细胞库中，并且因此可保持在需要时有效使用。
此外，在此方面，不同实施方案中的MAPCs可以被施用而无附加 的免疫抑制治疗。
在所有的这些和其它方面，本发明的实施方案提供了来自哺乳动物的MAPCs,该哺乳动物包括，在一种实施方案中为人类；在其它实施 方案中为非人类灵长动物，大鼠和小鼠，以及狗、猪、山羊、绵羊、马 和牛。从如上文所述的哺乳动物制备的MAPCs可以用于本文所述的本 发明所有方法和其它方面。
根据本发明不同实施方案的MAPCs可以从此类哺乳动物的不同隔 室和组织中分离，其中它们发现于，包括但不限于，骨髓、外周血液、 脐带血、血液、脾脏、肝脏、肌肉、脑、脂肪组织、胎盘和其它下文讨 论的。在一些实施方案中，MAPCs在使用之前被培养。
在一些实施方案中，MAPCs是遗传工程的，例如改善它们的免疫 调节性质。在一些实施方案中，遗传工程的MAPCs是通过体外培养产 生的。在一些实施方案中，遗传工程的MAPCs是从转基因的生物体产 生的。
MAPCs的作用才几理
对于MAPCs性质、活性和作用，不限于任意一种或多种解释性机 理，值得一提的是，它们可发挥有益的作用，例如通过不同的形式用 MAPCs治疗的作用。例如，MAPCs可具有直接有益的作用。此直接的 作用可以主要地是MAPCs与宿主细胞之间直接接触的事件。该接触可 以用细胞的结构组件或者用在它们的直接环境中的组分。此类直接机理 可涉及直接接触、扩散、摄取、或本领域技术人公知的其它过程。MAPCs 的该直接活性和作用可能是空间上受限的，例如限于局部沉积的区域或 者限于经注射到达的身体腔室。
MAPCs还可"归巢(Home)"以应答"归巢"信号，例如在损伤或疾病位 置释放的那些。由于归巢通常由信号介导，该信号的固有的功能是将细 胞召集到需要修复的位置，该归巢行为可能是将MAPCs浓集到治疗靶 位的有力工具。此作用可以通过如下文讨论的特殊因子刺激。
MAPCs还可通过其对因子的应答来调节有益的作用，例如用 MAPCs治疗的作用。这可发生另外的或可选的直接调节。此类因子可 包括归巢因子、促细胞分裂剂和其它刺激因子。它们还可包括分化因子、 以及激发具体细胞过程的因子。后者是这样的因子，即它们通过其它特 定因子的细胞(例如涉及召集细胞的那些，例如干细胞(包括MAPCs))引 起向损伤或疾病的位置分泌。除了上述和另选的那些，MAPCs可分泌作用于内源性细胞例如干 细胞或祖细胞的因子。所述因子可作用于其它细胞，以引起、提高、减 少、或抑制它们的活性。MAPCs可以分泌作用于干细胞、祖细l包或分 化细胞的因子，造成这些细胞分裂和/或分化。归巢到需要修复的位置的 MAPCs可分泌吸引其它细胞到此位置的营养因子。这样，MAPCs可以 吸引干细胞、祖细胞或分化细胞到它们需要的位置。MAPCs还可以分 泌造成这些细胞分裂和分化的因子。
此类因子包括营养因子的分泌可归功于MAPCs在例如以下中的作 用限制炎症损伤、限制血管渗透、改善细胞生存、以及引起和/或增加 修复细胞到达损伤位置的归巢。此类因子还直接影响T-细胞增殖。通过 减少它们的吞噬性和抗原呈递活性，此类因子还可影响树状突细胞，其 还可影响T-细胞的活性。
通过这些和其它机理，MAPCs可在不同的损伤、功能异常、障碍 和疾病的治疗中提供有益的作用。
MAPC施用 M4尸C賴务
MAPCs可以从不同的组织制备，例如/人骨髓细月包，如本文其它处 更详细讨论的。
在许多实施方案中，供施用于受试者的MAPCs的纯度约为100%。 在其它实施方案中，它是95%至100%。在一些实施方案中，它是85% 至95%。特别在与其它细胞的混合物的情况下，MAPCs的百分数可以 为2%画5%、 3%隱7%、 5%曙10%、 7%誦15%、 10%-15%、 10%画20%、 15%-20%、 20%-25%、 25%國30%、 30%-35%、 35%-40%、 40%-45%、 45%-50%、 60%-70%、 70%誦80%、 80%-90%或90%-95%。
在给定体积中MAPCs的数目可以通过公知的和常规的操作和仪器 测定，其中使用存在和/或不存在的某些标记物，包括本文描述的那些， 例如端粒酶(teleomerase),以及，此时需要的是分化成三种如本文所述 三种原始谱系中的 一种以上的细胞的能力。在给定体积细胞混合物中的 MAPCs百分数可以通过计数细胞(例如在一等份样品中的细J包)和测定 为MAPCs的细胞的数目来测定，其中使用前述筌别MAPCs的操作。细 胞可以容易地:故人工计数，或者通过使用自动细胞计数器计数。MAPCs可以:故测定，例如在给定体积中的MAPCs，其是通过特异性染色，例
如使用特异性结合试剂，其通常为结合到萸光标记物的抗体，接着目测
或计数，或者通过自动鉴别和计数仪器例如通过FACS (焚光激活细胞分 析器)仪。
以MAPCs治疗障碍或疾病等可以用未分化的MAPCs。治疗还可使 用已经处理的MAPCs以便它们定型到分化的途径。治疗还可包括已被 处理分化成具有有限分化潜能的低效能干细胞的MAPCs。其还包括已 被处理分化成具有最终分化的细胞类型的MAPCs。 MAPCs的最佳类型 或混合物可通过它们使用的具体环境来确定，对于本领域技术人员而言 其为常规设计的情形，以确定在此方面MAPCs的有效类型或组合。
備
对于给定的应用，供施用MAPCs的制剂选择取决于不同的因素。 它们中突出的是受试者的物种，待治疗障碍、功能异常或疾病的性质及 其在所述受试者中的状态和分布，被施用的其它治疗和药物的性质，施 用MAPCs的最佳途径，MAPCs经由该途径的残存率，给药方案，以及 对于本领域技术人员而言将会明显的其它因素。特别地，例如，适宜的
载体和其它添加物的选择将取决于确切的施用途径和特定剂型的性质。
细胞存活可能是使用MAPCs的治疗效果的重要决定因素。对于主 要的和附加的治疗均如此。当耙位对细胞播种和细胞生长均不适宜时产 生了另 一顾虑。这可能防碍治疗性MAPCs到达该位置和/或移入到那里。 在实施方案中，本发明包括测量增加细胞生存和/或克服由播种和/或生 长的障碍产生的问题的用途。
包含MAPCs的组合物的实例包括液体制剂，其包括溶液剂、混悬 剂和供肌肉内或静脉内施用的制剂(例如可注射的施用)，例如无菌混悬 剂或乳剂。此类组合物可包括MAPCs与适宜载体、稀释剂或赋形剂的 混合物，所述载体、稀释剂或赋形剂例如无菌水、生理盐水、葡萄糖、 右旋糖等。该组合物还可以是冷冻干燥的。该组合物可以含有辅助性物 质例如润湿剂或乳化剂、pH緩冲剂、凝胶化或增粘添加物、防腐剂、 调味剂、着色剂等，取决于施用途径和所需要的制剂。可以参考标准教 科书例如"REMINGTON，S PHARMACEUTICAL SCIENCE,"第17版, 1985(其通过引用并入本文)以制备适宜的制剂，而不必过多的试验。本发明的组合物通常方便地以液体制剂提供，例如等渗水溶液剂、
混悬剂、乳剂、或粘稠组合物，其可以被緩沖至选择的pH值。液体制 剂通常比凝胶剂、其它粘稠组合物和固体组合物更容易制备。此外，液 体组合物稍微更为方便施用，尤其是通过注射。另一方面，粘稠组合物 可以配制到适宜的粘度范围，以提供与特定组织更长的接触期。
通常将会包括多种添加物，以提高该组合物的稳定性、无菌性和等 渗性，例如抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和緩冲剂是特别值得一 提的。预防微生物的作用可通过多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲 酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸等来保证。在许多情况下，期望包括 等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸 铝和明胶，可以使可注射药物制剂的吸收延长。然而，根据本发明，所 用的任何载体、稀释剂、添加物应当与所述细胞相容。
除了细胞外，MAPC溶液、混悬液和凝胶通常含有大量的水(优选纯 化的、无菌水)。还可以存在少量的其它成分，例如pH调节剂(例如，碱 例如NaOH)、乳化剂或分散剂、緩冲剂、防腐剂、润湿剂和胶凝剂(例 如甲基纤维素)。
通常该组合物是等渗的，即当它们适宜地制备以供施用时具有与血 液和体液相同的渗透压。
本发明组合物需要的等渗性可使用氯化钠或其它药学可接受的试 剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇、或其它无机或有才几溶质来实 现。对于含有钠离子的緩冲剂而言氯化钠是特别优选的。
如果需要，使用药学可接受的增稠剂，可以将组合物的粘度维持在 选定的水平。甲基纤维素是优选的，原因是它容易且经济可得，而且它 容易处理。其它适宜的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟 丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选择的试剂。重点 是使用一定的量，此量将达到所选择的粘度。粘稠组合物通常从溶液通 过添加此类增稠剂来制备。
药学可接受的防腐剂或细胞稳定剂可以用于增加MAPC组合物的 保存期。如果包括此防腐剂，其将在本领域技术人员公知的选择不会影 响MAPCs的存活性和效果的组合物的范围内。
本领域技术人员将认识到，所述组合物的组分应当是化学惰性的。 这对于熟知化学和药学原则的本领域技术人员而言将不会存在问题。通过参考标准教科书或通过简单试验(不涉及过度的试验)使用本公开、本 文引用的资料和本领域通常可得的资料提供的信息，可以容易地避免所 述问题。
根据需要，通过将在需要量的适宜溶剂中的实施本发明所用的细胞 与不同量的其它成分合并，可以制备无菌可注射溶液。
还优选的是注射用溶液，包括立体定位注射剂和输液剂，例如IV
输液剂。
在一些实施方案中，MAPCs被配制成单剂量可注射的剂型，例如 溶液剂、混悬剂或乳剂。适合MAPCs注射的药物制剂通常是无菌水溶 液和分散体。可注射制剂的载体可以是含有例如水、盐水、磷酸盐緩冲 盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)及其适宜的混合物 的溶剂或分散介质。
熟练技术人员可容易确定在以本发明方法施用的组合物中的细胞 和任选添加物、介质和/或载体的量。通常，任何添加物(除了所述细月包 夕卜)是以在溶液(例如在磷酸盐緩沖盐水)中的0.001-50 wty。的量存在。所 述活性成分是以微克至毫克级的量存在，例如约0.0001至约5 wt%,优 选约0.0001至约1 wt%,最优选约0.0001至约0.05 wt%,或者约0.001 至约20wt。/Q,优选约0.01至约10 wt%,最优选约0.05至约5wt。/0。
对于任何待施用于动物和人的组合物，以及对于任何特别的施用方 法，优选的是确定毒性，例如通过测定在适宜动物模型中的致死剂量 (LD)和LD50,所述动物例如啮齿类例如小鼠或大鼠；以及，组合物的 剂量、其中的组分的浓度、和施用所述组合物的时间，其引发了适宜的 应答。根据本领域技术人员的知识、本公开、和本文引述的资料，此类 测定不需要过度的试验。并且，连续施用的时间可以;f皮确定，而不必过 多的试马全。
在一些实施方案中，MAPCs被包嚢以供施用，特别是其中包嚢提高 了治疗的有效性，或者提供了处理和/或保存时间的益处。结果是，在一 些增加免疫抑制介导的MAPC的作用的实施方案中，包嚢还可减少对免 疫抑制药物治疗的需求。
此外，在一些实施方案中包嚢提供了对受试者免疫系统的屏障，其 可进一步减少受试者对MAPCs的免疫应答(其通常在同种异体移植物中 是无免疫原性的或者仅仅是弱免疫原性的)，从而减少任何在施用所述细胞时可能会发生的移植物排斥或炎症。
在其中MAPCs与另 一类型的细胞(其在同种异体或异种环境中更具 有典型的免疫原性)混合使用的不同的实施方案中，如果该混合的细胞 是具有免疫能力的并且将该宿主识别为非自身的时，包嚢可减少或消除 不良的宿主对该非-MAPC细胞和Z或GVHD的免疫应答，所述减少或消除 可发生在免疫妥协的宿主中。
在植入之前可以通过薄膜和月交嚢将MAPCs包嚢。预计许多可用的细 胞包嚢方法的任一种均可使用。在一些实施方案中，细胞各自被包嚢。 在一些实施方案中，许多细胞被包嚢在相同的膜中。在植入后所述细胞 将被移除的实施方案中，包嚢许多细胞的相对更大的结构，例如在单一 的膜中，可以提供用于回收的便利的手段。
广泛变化的材料可用于不同的实施方案中以用于MAPCs的微包嚢。 此类材料包括，例如，聚合物胶嚢、藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐微胶嚢、 聚-L-赖氨酸-藻酸钡胶嚢、藻酸钡胶嚢、聚丙烯腈/聚氯乙烯(PAN/PVC) 空心纤维和聚醚砜(PES)空心纤维。
用于可供MAPCs施用的细胞微包嚢的技术是本领域技术人员已知 的，例如在Chang, P., et al., 1999; Matthew, H.W., et al., 1991; Yanagi, K., etal.， 1989; Cai Z.H., et al.， 1988; Chang， T.M., 1992中以及在美国专利 No.5,639,275 (例如，其描述了用于稳定表达生物活性分子的细胞的长期 维持的生物相容的胶嚢)中。包嚢的另外的方法是在欧洲专利公开号 No.301,777以及美国专利No.4,353,888、 4,744,933、 4,749,620、 4,814,274、 5,084,350、 5,089,272、 5,578,442、 5,639,275和5,676,943中。前述全部文 献与MAPCs的包嚢相关的部分通过引用并入本文。
某些实施方案将MAPCs掺入到聚合物中，例如生物聚合物或合成 聚合物。生物聚合物的实例包括，但不限于，纤连蛋白、fibin、血纤蛋 白原、凝血酶、胶原和蛋白聚糖。其它因子，例如上文讨论的细胞因子， 也可以掺入到该聚合物中。在本发明的其它实施方案中，MAPCs可以 被掺入到三维凝胶的间隙中。通常，大量的聚合物或凝胶将以外科植入。 可以配制在足够小的粒子或纤维中的聚合物或凝胶可以通过其它常用 的、更方便的、非外科的途径施用。
本发明的药物组合物可以制备成许多形式，其包括片剂、硬或软明 胶胶嚢剂、水性溶液剂、混悬剂和脂质体，以及其它緩释制剂，例如成形的聚合物凝胶。口服液体药物组合物可以是例如以下的形式水性或 油性混悬剂、溶液剂、乳剂、糖浆剂、或酏剂，或者可以以干燥产物呈 现，以供用水或其它适宜的介质在使用前重构。此类液体药物组合物可 含有常规添加物，例如混悬剂、乳化剂、非水性介质(其可包括食用油) 或防腐剂。可以配制这样的口服剂型，其中细胞在穿过胃后释放到肠中。 此类制剂描述于美国专利No.6,306,434以及其中包含的文献中。
适合直肠施用的药物组合物可以制备成单位剂量的栓剂。适宜的载 体包括盐水溶液和其它本领域常用的材料。
对于通过吸入施用，细胞可以方便地从吸入器、雾化器或加压包装 递送，或者从递送气雾剂的其它方便手段递送。加压包装可包括适宜的 推进剂例如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其 它适宜的气体。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀以递送计量化的 量来确定剂量单位。
另选的，对于通过吸入或吹入施用，可以釆用干粉组合物形式的方 式，例如调节剂和适宜的粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物。该粉末 组合物可以以单位剂型存在于例如胶嚢或药筒(cartridges)中，或者例如 存在于明胶或泡罩包装中，所述粉末可以在吸入器或吹入器的帮助下从 上述形式中施用。对于鼻内施用，可以通过液体喷雾例如通过塑料瓶雾 化器施用细胞。
岸它活^^为、
MAPCs可以与其它药物活性剂施用。在一些实施方案中，此类活 性剂的一种或多种与MAPCs —起配制以供施用。在一些实施方案中， MAPCs和一种或多种活性剂是在分离的制剂中。在一些实施方案中， 包含MAPCs和/或一种或多种活性剂的所述组合物以彼此附加的应用而 净皮配制。
MAPCs可以在包含免疫抑制剂的制剂中施用，例如任何数目的皮 质类固醇、环孢菌素A、环孢菌素类免疫抑制剂、环磷酰胺、抗胸腺细 胞球蛋白、石危唑嘌呤、FK-506和除FK-506以外的大环内酯类免疫抑制 剂、以及雷帕霉素的任何组合。在某些实施方案中，此类药物包括皮质 类固醇、环孢菌素A、 ^琉唑嘌呤、环磷酰胺、雷帕霉素和/或FK-506。 根据前文的免疫抑制剂可以是唯一的此类另外的药物，或者可以与其它药物例如本文记述的其它药物组合。其它免疫抑制剂包括他克莫司、麦 考酚酸吗乙酯和西罗莫司。
此类药物还包括抗生素剂、抗真菌剂和抗病毒剂，以指定可根据本 发明实施方案使用的几种其它药理活性物质和组合物。
典型的抗生素或抗真菌化合物包括，但不限于，青霉素、链霉素、 两性霉素、氨苄西林、庆大霉素、卡那霉素、麦考酚酸、萘啶酸、新霉
素、制霉菌素、巴龙霉素、多粘菌素、噪罗霉素、利福霉素(rifampicin)、 大观霉素、四环素、泰洛星、zeocin,以及头孢菌素类、氨基糖苷类和 棘球白素类(echinocandins)。
此类其它添加物涉及这样的事实，即MAPCs，像其它干细胞，施 用于受试者之后可以"归巢"到有利于其生长和功能的环境中。此"归巢" 通常在其需要的位置浓缩所述细胞，例如免疫障碍、功能异常或疾病的 位置。已知许多物质刺激归巢。它们包括生长因子和营养信号因子例如 细胞因子。它们可用于刺激MAPCs的归巢以治疗靶向的位置。它们可 以在用MAPCs治疗之前、与MAPCs—起或在MAPCs施用之后施用于 受试者。
某些细胞因子，例如，改变或影响MAPCs或其分化的相似物迁移 到治疗所需位置，例如免疫妥协的位置。可用于此方面的细胞因子包括， 但不限于，基质细胞衍生的因子-1 (SDF-1)、干细胞因子(SCF)、血管生 成素-1、胎盘衍生的生长因子(PIGF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、刺 激内皮黏附分子例如ICAMs和VCAMs表达的细胞因子、和引起或促进 归巢的细胞因子。
它们可以作为预治疗施用于受试者、与MAPCs—起施用、或者在 MAPCs已^皮施用之后施用，以通过改善归巢或通过其它才几理促进归巢 到需要的位置并且达到改善的治疗作用。此类因子可以与MAPCs合并 到适合它们一起施用的制剂中。或者，此类因子可以分别地配制和施用。
特别值得一提的是，因子(例如上文讨论的细胞因子)和MAPCs的施 用顺序、制剂、剂量、给药频率和施用途径通常会随所治疗的障碍或疾 病、其严重度、受试者、被施用的其它治疗、障碍或疾病的阶段和预后 因素而改变。对于其它治疗已经确立的一般方案提供了一个在MAPC-介导的直接或附加的治疗中确定适宜给药的框架。这些，与本文提供的 其它信息 一起，将使本领域技术人中能够确定根据本发明实施方案的适宜的施用操作，而无需过多的试验。
在实施方案中，细胞被配制成适合治疗脑损伤，其包括本文所述的 脑损伤和/或功能异常和/或障碍和/或疾病。在实施方案中，所述制剂可
有效地用于肠胃外施用。在实施方案中，所述的制剂可有效地用于I.V.
输注。在实施方案中，所述的制剂可有效地用于立体定位注射。 途径
通过任何本领域技术人员已知的可用于将细胞施用于受试者的各
种途径，可以将MAPCs施用于受试者。
在不同的实施方案中，可以将所述MAPCs通过有效递送细胞治疗 的任何途径施用于受试者。在一些实施方案中，所述细胞通过注射(包括 局部和/或全身注射)施用。在某些实施方案中，所述细胞在待治疗的功 能异常的位置内和/或接近于该位置施用。在一些实施方案中，所述细胞 在功能异常的局部而不是接近于该位置通过注射施用。在一些实施方案 中，所述细胞通过全身注射例如静脉注射施用。
可用于本发明实施方案所关注的方法是用于通过肠胃外途径施用 MAPCs的方法。特别值得一提是，用于本发明不同的实施方案中的施 用的肠胃外途径包括通过静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内、鞘内、骨 内、关节内、滑液内、皮内、真皮内、皮下和/或肌内注射施用。在一些 实施方案中，使用静脉内、动脉内、皮内、真皮内、皮下和/或肌内注射。 在一些实施方案中，4吏用静脉内、动脉内、皮内、皮下和/或肌内注射。
在本发明不同的实施方案中，MAPCs通过全身注射施用。对于施 用MAPCs而言，全身注射，例如静脉注射，提供了一种最简单及最小 侵入的途径。在某些情况下，为了最佳效能和/或通过MAPCs归巢到靶 位，这些途径可能要求高的MAPC剂量。在许多种实施方案中，MAPCs 可以通过耙向和/或局部注射施用，以确保在粑位的最佳作用。
在本发明某些实施方案中，MAPCs可以通过皮下注射针头经注射 器施用于所述受试者。在不同的实施方案中，MAPCs通过导液管施用 于所述受试者。在许多种实施方案中，MAPCs通过外科植入施用。在 此进一步的方面，在本发明不同的实施方案中，MAPCs通过使用关节 镜操作植入施用于所述受试者。在一些实施方案中，MAPCs通过立体 定位注射施用于所述受试者。在一些实施方案中，MAPCs在固体支持体内或固体支持体上施用于所述受试者，该固体支持体例如聚合物或凝
胶。在不同的实施方案中，MAPCs以包嚢化的形式施用于所述受试者。 在本发明另外的实施方案中，MAPCs被适宜地配制成供口服、直
肠、皮肤夕卜(epicutaneous)、眼、鼻和/或肺递送，并且相应地净支施用。 在实施方案中，肠胃外施用被用于治疗脑损伤，其包括本文所述的
脑损伤和/或功能异常和/或障碍和/或疾病。在实施方案中，使用IV输注。
在实施方案中，使用立体定位注射。
絲
组合物可以在剂型中施用，或者通过医学和兽医学领域技术人员公 知的技术施用，其中考虑例如以下的因素年龄、性别、体重、具体患 者的条件、以及将要施用的制剂(例如固体还是液体)。对于人类或其它 哺乳动物的剂量可以根据本公开、本文引述的资料和本领域的知识，通 过本领域:技术人员确定而无不必过多试^^ 。
适合于根据本发明不同的实施方案使用的MAPCs的剂量将取决于 许多因素。其可能考虑不同的环境而变化。对于主要的和附加的治疗， 决定待施用的MAPCs最佳剂量的参数通常包括以下的部分或全部所 治疗的疾病及其阶段；受试者的物种，其健康、性别、年龄、体重和代 谢速率；受试者的免疫反应能力；被施用的其它治疗；根据受试者病史 或遗传型所预期的潜在并发症。所述参数还包括MAPCs是同基因性 的、自体的、同种异体的还是异种的；它们的效能(特异活性)；对于 MAPCs必需靼向有效的位置和/或分布；以及所述位置的此类特征例 如对于MAPCs和/或MAPCs的移入物的可接受性。另外的参数包括与 其它因子(例如生长因子和细胞因子)的MAPCs同时施用。在给定情况下 的最佳剂量还将考虑细胞被配制的方式、它们被施用的方式、以及施用 之后细胞集中于靶位的程度。最后，最佳剂量的确定必将提供有效的剂 量，该有效的剂量既不会低于最大有益作用的阈值，也不会高于与 MAP C s剂量相关的有害作用大于增加剂量的益处的阈值。
对于一些实施方案，MAPCs的最佳剂量将在供自体的单核骨髓移 植使用的剂量范围内。根据动物研究通过外推法，考虑大小(质量)和代 谢因素的差异，以及根据对于其它细胞治疗(例如移植治疗)所确立的 剂量需求，可以估计出上述的剂量范围。在实施方案中，每次施用的最佳剂量范围为1(^至l(^MAPC细胞/kg 受者质量。在实施方案中，每次施用的最佳剂量为105至108 MAPC细 胞/kg。在实施方案中，每次施用的最佳剂量为5xl()S至5xl(fMAPC 细胞/kg。在实施方案中，每次施用的最佳剂量为1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()6的任一个至1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()7的任一个。
通过参考，在前述中的一些中-高剂量是类似于自体的单核骨髓移植 的有核细胞的剂量。 一些中-低剂量类似于用于自体的单核骨髓移植的 CD34+细胞/kg的数目。
应当理解，单一剂量可以一次、分次或经一定时间连续递送。全部 剂量还可以递送到单个位置或者经数个位置分开扩散。
在不同的实施方案中，MAPCs可以在初始剂量中施用，然后通过 进一步施用MAPCs来维持。MAPCs可以通过最初的一种方法施用，然 后通过相同的方法或者通过一种或多种不同的方法施用。受试者的 MAPC水平可以通过细胞继续进行的施用来维持。不同的实施方案通过 静脉注射，既可以初始施用MAPCs,也可以维持其在受试者中的水平， 或者两者均可。在许多种实施方案中，使用了施用的其它形式，其取决 于本文其它处所讨论的患者的病症和其它因素。
应当注意，人受试者通常比试验动物治疗得更长；但是，治疗通常 具有与疾病过程和治疗有效的长度相称的长度。本领域技术人员考虑使 用人和/或动物例如大鼠、小鼠、非人类灵长动物等进行的其它操作的结 果，以确定对于人的适宜剂量。根据这些因素并考虑由本公开和现有技 术提供的指导，此类确定将使本领域技术人员能够这样做而不必过多试 验。
对于初始施用和进一步的剂量或者对于后续的施用的适宜方案可 以全部相同或者可以变化。适宜的方案可以通过熟练技术人员根据本公 开、本文引述的文献、和本领域的知识确定。
剂量、频率、治疗持续时间将取决于许多因素，包括疾病的性质、 受试者和其它可以施用的治疗。因此，广泛变化的方案可用于施用 MAPCs。
在一些实施方案中，MAPCs以一个剂量施用于受试者。在其它实 施方案中，MAPCs是在连续两个或多个剂量的系列中施用于受试者。 在一些其它实施方案中，其中MAPCs以单次剂量、两次剂量和/或两次以上剂量施用，所述剂量可以相同或者不同，并且它们可以以相互之间 相等或不等的间隔施用。
MAPCs可以在宽范围的时间中以许多频率施用，例如直到达到需 要的治疗效果。在一些实施方案中，MAPCs历经少于一天的时间施用。 在其它实施方案中历经两天、三天、四天、五天或六天施用。在一些实 施方案中，MAPCs每周施用一次或多次，历经数周时间。在其它实施 方案中，它们历经数周时间达一至数月施用。在不同的实施方案中，它 们可以历经数月时间施用。在其它实施方案中，它们可以历经一年或多 年的时间施用。治疗的一般时限将会与疾病过程时长、所用治疗法的效 果和^^皮治疗的受试者的病症和应答相称。
在一些实施方案中，MAPCs施用一次、两次、三次或三次以上， 直到达到需要的治疗效果，或者施用不再显示出可能对所述受试者提供 益处。在一些实施方案中，MAPCs连续施用达一定时间，例如通过静 脉滴注。MAPCs的施用可以是短的时间，达数天、数周、数月、数年 或更长的时间。
在实施方案中，施用单次弹丸浓注治疗脑损伤，其包括本文所述脑 损伤和/或功能异常和/或障碍和/或疾病。在实施方案中，两个或多个单 次弹丸浓注的施用是在时间上经一天或多天分开施用。在实施方案中， 每一剂量历经从数分钟至数小时时间的任何时限通过I.V.输注施用。在 实施方案中，单次剂量的细胞是通过立体定位注射施用。在实施方案中， 两个或多个剂量是通过立体定位注射施用到脑的相同或不同区域。在此 关注的涉及弹丸浓注、IV和立体定位注射以用于治疗脑损伤的实施方案 中，每一施用的细胞剂量是每一施用104至1(^MAPC细胞/kg受者质量。 在实施方案中，所述的剂量是105至108 MAPC细胞/kg。在实施方案 中，所述的剂量是5xl()S至5xl(^MAPC细胞/kg。在实施方案中，所 述的剂量是l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()6至l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或9xl()7中的任一个。
如美国专利No.7,015,037中描述的MAPCs
人MAPCs描述于现有技术中。对于人和小鼠，分离MAPC的方法 是现有技术已知的。因此目前对于本领域技术人员而言可能的是获得 骨髓抽吸物、脑或肝活组织检查物、和其它器官，并使用本领域技术人中可得的阳性和/或阴性选择技术分离，这依赖于表达(或未表达)在那些 细胞中的基因(例如，通过机能或形态学分析，例如上文引用申请中公开 的那些，其通过引用并入本文)。说明性的方法描述于例如，美国专利
No.7,015,037中，其内容通过引用并入本文以用于MAPCs的说明和制备 的方法。
如美国专利No.7，015，Q37中描述的MAPCs的分离和生长 来自例如人、大鼠、小鼠、狗和猪的MAPC分离的方法是本领域已 知的。i兌明性的方法描述于，例如，美国专利No.7,015,037和 PCT/US02/04652 (以WO 02/064748公开)中，以及这些方法，连同本文 公开的MAPCs的特征，仅通过说明和非限制性实例的方式，通过引用 并入本文。
MAPCs最初从骨髓中分离，随后从包括脑和肌肉的其它组织建立 (Jiang, Y. et al.， 2002)。 MAPCs可以从包括但不限于以下的许多来源分 离骨髓、胎盘、脐带和脐带血、肌肉、脑、肝、脊髓、血液、脂肪组 织和皮肤。例如，MAPCs可以得自骨髓抽吸物，其可通过本领域:忮术 人员可得的标准方式获得(参见，例如，Muschler, G,F., et al., 1997; Batinic: D., et al., 1990)。
在美国专利No.7,015,037所述条件下的人MAPC表型 通过22-25细胞倍增之后获得的人MAPCs的FACS免疫表型分析， 显示所述细月包不表达CD31、 CD34、 CD36、 CD38、 CD45、 CD50、 CD62E 和-P、 HLA-DR、 Mucl8、 STRO-l、 cKit、 Tie/Tek;并且表达寸氐水平的 CD44、 HLA-I型和卩2-微球蛋白，但表达CDIO、 CD13、 CD49b、 CD49e、 CDw90、 Flkl (N〉10)。
在培养物中以约2 x 10Vcm2重复播种， 一旦细胞经历>40的倍增， 所述表型变得更同质，并且没有细胞表达的HLA-I型或者CD44 (n=6)。 当细胞以更高的融合生长时，它们表达高水平的Mucl8、 CD44、 HLA-I 型和卩2-凝:J求蛋白，其类似于针对MSC所述的表型(N二8) (Pittenger, 1999)。
免疫组织化学显示，以约2 x 10"cm2播种密度生长的人MAPCs表 达EGF-R、 TGF-R1和-2、 BMP-R1A、 PDGF-Rla和-B,并且MAPCs的小的亚群体(在1和100/()之间)用抗-SSEA4抗体染色(Kannagi, R, l983)。
使用Clontech cDNA阵列，测定了人MAPCs的表达的基因图，其 以约2 x 103细胞/cm2的播种密度培养22和26细胞倍增。
A. MAPCs不表达CD31, CD36， CD62E, CD62P, CD44國H, cKit, Tie, IL1、 IL3、 IL6、 ILll、 G CSF、 GM國CSF、 Epo、 Flt3國L或CNTF的 受体，以及低水平的HLA-I型、CD44-E和Muc-18 mRNA。
B. MAPCs表达4十对细l包因子BMP1 、 BMP5、 VEGF、 HGF、 KGF、 MCP1的mRNA;细月包因子受体Flkl、 EGF-R、 PDGF-Rla、 gpl30、 LIF-R、 activin画Rl和國R2、 TGFR画2、 BMP國R1A;粘着受体CD49c、 CD49d、 CD29; 以及CDIO。
C. MAPCs表达针对hTRT和TRF1的mRNA; POU域转录因子 oct-4、 sox-2 (要求有oct-4以保持未分化状态的ES/EC, Uwanogho D., 1995)、 sox 11 (神经发育)、sox 9 (软骨形成)(Lefebvre V., 1998); homeodeomain 4争录因子Hox画a4和画a5(颈和胸廓细节(specification);呼 吸道器官发生)(Packer AI, 2000)、 Hox-a9 (髓细胞生成)(Lawrence H, 1997)、 Dlx4(头的前脑和边缘结构的细节)(AkimenkoMA, 1994)、 MSX1 (胚胎的中胚层、成年的心脏和肌肉、软骨-和骨发生)(Foerst-Potts L, 1997), PDX1 (胰脏)(pffield MF, 1996)。
D. oct-4、 LIF-R和hTRT mRNA的存在通过RT-PCR证实。
E. 此外，RT-PCR显示rex-l mRNA和rox-l mRNA在MAPCs中 表达。
将Oct-4、 rex-l和rox-l在得自人和鼠科动物骨髓以及得自鼠科动 物肝脏和脑的MAPCs中表达。人MAPCs表达LIF-R，并用SSEA-4阳 性染色。最后，发现oct-4、 LIF-R、 rex-l和rox-l mRNA水平增加培养 超过30细胞倍增的MAPCs,其导致表型更同质的细胞。相反，以高密 度培养的MAPCs损失了这些标记物的表达。这与在40细胞倍增之前 的衰老以及分化到不同于成软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞的细胞的损 失有关。因此，与rex-l、 rox-l和sox-2结合的oct-4的存在与MAPCs 培养物中的大多数原始细胞的存在相关。
培养MAPCs的方法是本领域公知的(参见例如，美国专利 No.7,015,037，其关于培养MAPCs的方法通过引用并入本文)。培养 MAPCs的密度可以从约100细胞/cm2或约150细胞/cm2至约10,000细胞/cm2变化，包括约200细胞/cm2至约1500细胞/cm2至约2000细胞/cm2。 该密度可以在物种之间变化。另外，最佳的密度可以根据培养条件和细 胞来源而变化。对于给定培养条件和细胞的组，确定最佳密度是在本领 域普通技术人员的技能范围内。
而且，低于约10%的有效大气氧浓度，包括约3-5%,可以在培养 物中的MAPCs分离、生长期和分化的任何时间使用。
本发明通过以下说明性的、非限制性的实施例作附加描述。
实施例
实施例l:在大鼠中用MAPCs的缺氧性-缺血性损伤以及用MAPCs和免 疫抑制治疗
通过单侧颈动脉结扎术的方法，接着通过8°/。缺氧，将7日龄 Sprague Dawley (SD)大鼠幼崽(每试验组11=7)经受HI损伤，如描述于 Rice Wa/.,爿wzTV^ro/. 2: 131-141(1981)，其通过引用以其全部内容并且 特别是有关此方法并入本文。损伤之后7天，用冷藏保存的MAPCs(移 植前临时融化)使动物经受脑功能区定位(stereotaxic)移植到海马区域， 所述MAPCs得自SD大鼠(同基因性的，GFP-标记的，每只动物200,000 个细胞)或Fisher大鼠(同种异体，P-gal-标记的，每只动物200,000个细 胞)。在整个生命过程中全部动物每天用免疫抑制治疗(CSA, lmg/kg, i.p.)。在移植后的第7天和第14天，进行提高身体摆动试3全(Elevated Body Swing Test, EBST)和旋转棒试验，以揭示全身性的和协调的运动 和神经功能，如描述于Borlongan"(2/.,JA^wmy"'., j^: 5372-5378 (1995) 中的，其通过引用以其全部内容特别是有关这些评价行为性能的方法并 入本文。在试-睑之后第14天，使动物安乐死以用于移植的MAPCs的免 疫组织化学分析。试验的流程图描绘于图1。在试验过程期间在接受 MAPC移植物的动物中未观察到死亡。
实施例2A: HI-损伤大鼠在MAPC注射后第7天和第14天的运动技能 的评价。
将动物如实施例1所述处理。与介质灌注损伤的动物相比较，在移 植后第7天，MAPC移植的HI损伤动物显示出由EBST测定的较少的 运动不对称倾向(64%-65%对75%)，以及在旋转棒(rotarod)上花费更长的时间(14.1-16.5对18秒)。比之于接受介质灌注的那些对照动物，在 移植后第14天，MAPC移植的动物显示出明显减少运动不对称 (66%-70%对87%),以及在旋转棒上花费更长的时间(27.3-28.3对21秒)。 在它们的行为改善方面，在两个试验期间，移植到受损伤动物中的同基 因性和同种异体MAPCs无显著差异。结果在图2中作图示性描述。通 过运动和神经测定，结果显示了在大鼠HI损伤;溪型中注射MAPCs的治 疗作用。
实施例2B: MAPC注射到HI大鼠脑之后第14天MAPC植入物的组织 分析
将动物如实施例1所述处理。在移植后第14天处死之后的HI损伤 动物的脑检中，通过组织学检查来检测移植的MAPCs。检测GFP-阳性 同基因性移植物主要在原始的海马CA3移植位置和邻近的CA2区域， 其用DAPI共同标记。通过抗-p-gal染色和用DAPI共同标记4企测的同种 异体移植物显示了在HI损伤的脑中移植存活的相似模式。在14天时移 植物存活为0.96%(ANOVA F值为24.27， df = 2, 19以及p < 0.0001; Fisher posthoc为p< 0.0001)。结果显示，在大鼠HI损伤才莫型动物中直接脑内 注射后，同种异体和同基因性MAPCs植入到注射位置，并且持续至少 2周。
实施例3:植入的MAPCs保护内源性神经
将动物如实施例1所述处理。多数如实施例2B所述进行组织分析， 但将预备的脑切片Nissl染色，以测定内源性神经元存活的水平。与用 对照介质注射的动物相比，用同基因的或同种异基因的MAPCs注射的 动物中内源性神经元死亡显著减少。该结果图示性地描述于图3。结果 显示，MAPC施用保护了来自缺氧性缺血性损伤的内源性神经元，导致 神经元成活率增加。
实施例4:通过标记物分析显示植入的MAPCs和神经元的共区域化
将动物如实施例1所述处理。对于上文所述MAPC标记物(对于同 基因性MAPCs为GFP,或者对于同种异体MAPCs为p-gal),同时对于 MAP2即一种良好表征的神经元标记物，将由MAPC治疗的大鼠产生的
40脑切片共染色。表达各个MAPC标记物和神经元标记物的少数细胞被 发现于同基因性和同种异体植入的动物中，显示一些MAPCs已分化成 神经元；尽管可能的是， 一些双重染色细胞是植入的MAPC细胞与内源 性神经元细胞的融合的罕见结果。在大鼠HI损伤模型中施用于动物中 之后第14天，该结果显示了 MAPCs的早期表型神经元分化。
实施例5:当通过立体定位注射或通过I.V.输注施用而无免疫抑制时， MAPCs在新生大鼠HI损伤模型中是治疗有益的
通过单侧颈动脉结扎术，接着通过8%缺氧，将7日龄Sprague Dawley(SD)大鼠幼崽(每试验组i^7)经受HI损伤，如上文实施例1和本 文引述的参考文献所述。HI损伤7天之后，用冷藏保存的MAPCs(移植 前临时融化)使动物经受脑功能区定位移植到海马区域，所述MAPCs得 自Fisher大鼠(同种异体，(3-gal-标记的，每只动物200,000个细胞)。在移 植后的第7天和第14天，使用EBST试验和旋转棒试验进行行为试验， 以揭示全身性的和协调的运动和神经功能。到第14天，与仅接受PBS 的对照组相比，在EBST和旋转棒试验中，MAPC治疗的动物在颅内和 IV递送组中均显示出统计学显著的改善(两个试马全均为p<0.05)。
实施例6:在MCA闭塞啮齿动物中风才莫型中用异种(人〗MAPCs治疗中
28只SD成年大鼠经历大脑中动脉(MCA)闭塞手术，以诱发动物手 术中风。诱发中风7天之后，将动物分成四组，每组7只。各组接受直 接大脑内施用以下中的一种(1)3^1的PBS注射液(对照)，(2)3pl的PBS 注射液，其含有100,000人MAPCs, (3) 3^1的PBS注射液，其含有200,000 人MAPCs，和(4) 3|il的PBS注射液，其含有400,000人MAPCs。如以 下实施例所述测试动物，并于第21天处死动物。
实施例7:在中风才莫型中由运动和神经试驺3正实的MAPC施用的治疗益
将动物如实施例6所述处理。在细胞移植之后第7和第14天，将 各动物经历EBST和Bederson试验，以确定运动和神经功能，如上文所 述。与对照相比，在移植之后第7天，接受200,000或400,000细胞的动物在EBST的摇摆偏移中观察到统计学显著改善。经过14天，与对 照组相比，全部三组接受人MAPC注射的动物显示显著改善。结果描绘 于图4左侧的上和下图。
同时进行但是与EBST分开，将各大鼠经历四个任务Bederson板， 以评1介MCA闭塞中风之后14天和21天的神经功能。对于四个试-睑的 每一个，将四个试一睑记分为O(无可观测的神经缺损)至3(严重的神经缺 损)。然后将四个得分取均值，得到神经功能的总测量值。MAPC移植后 第7天，与对照动物相比，接受200,000或400,000细胞的动物在神经 功能方面显示出统计学显著改善。经过14天，与对照组相比，接受人 MAPC注射的全部3组证明了显著的改善。结果描绘于图4右侧的上和 下图。
在用200,000或400,000 MAPCs处理的动物的运动和神经试马全中， 根据第一试验点(注射后7天)，结果显示动物的剂量依赖性、统计学显 著改善。(用IOO，OOO MAPCs处理的动物比之后仅用对照介质处理的动 物未显示统计学显著改善)。该结果证明，当与仅用介质处理的动物相比 时，通过直接大脑内注射到大鼠中风脑中，在早到注射后至少一周并且 保持长到注射后至少二周，在运动和神经有益性试验中施用异种MAPCs 均得到了统计学显著改善。
实施例8:在大鼠HI中风模型中MAPC植入到脑中
将动物如上文实施例6所述处理。在MAPC移4直后第14天最后的 行为测定之后，将动物处死，再收集脑。将石蜡植入组织的半-薄切片用 DAPI染色，以显现所有的细胞核和小鼠抗-HuNu (人细胞核)多克隆抗 体，接着用FITC-结合羊抗小鼠单克隆抗体以染色植入的人MAPCs。在 皮层(CTX)、室下区(SVZ)和紋状体(STR)中发现MAPCs。结果显示在大 脑内注入大鼠后，人MAPCs生存并且植入，其显示MAPC施用的显著 治疗作用。细胞的分布显示，MAPCs迁移到脑的第二区域以及在原始 位置的植入处，在此处细胞^皮注入。对于100,000和200,000 MAPCs注 射可见到生存和迁移的相同模式。在仅注射介质的对照中风动物的脑 中，未检测到HuNu免疫反应性。在中风之后14天，对于100,000、 200,000 和400,000 MAP植入剂量，移植存活百分数分别为0.55%、 0.7%和 0.51%。该结果清楚地显示，在中风才莫型脑中，MAPCs不但存活并且植入到注射的位置，而且它们还迁移并植入到远离注射位置的第二位置。
总之，到直接大脑内注射后至少两周，异种人MAPCs存在于损伤和注 射(紋状体)的位置，并且存在于受注射的脑的第二位置，包括皮层和在 室下区中。
实施例9:在大鼠手术模型中用同种异体(大鼠)MAPCs、用异种 (人)MAPCs,并且均同时用和不用免疫抑制治疗缺血性中风
35只SD大鼠经受大脑中动脉(MCA)结扎手术以诱导动物手术性中 风。在诱导中风之后7天，将各动物分成5组，每组7只动物。每组接 受直接大脑内施用以下中的一种(1)3^1的PBS注射液，其含有400,000 大鼠MAPCs,无免疫抑制；(2)3^1的PBS注射液，其含有400,000大鼠 MAPCs,有免疫抑制治疗(CSA, lmg/kg， i.p.); (3)3^1的PBS注射液， 其含有400,000人MAPCs,无免疫抑制；(4) 3^1的PBS注射液，其含有 400,000人MAPCs,有免疫抑制治疗(CSA, lmg/kg， i.p.),和(5) 3pl的 PBS注射液，其含有400,000辐照的、不可存活的人MAPCs，有免疫抑 制治疗(CSA, lmg/kg, i.p.)。
实施例10:在大鼠手术模型中用同种异体(大鼠)MAPCs、用异种 (人〗MAPCs,并且均同时用和不用免疫抑制治疗缺血性中风的行为和神 经学评价
将动物如实施例9所述处理。在细l包移植之后14天，以及此后8 周每隔14天，将各动物经历EBST和Bederson试-睑以测定运动和神经 功能。在有和没有免疫抑制治疗的情况下，在EBST和Bederson评价中， 异种和同种异体MAPCs的施用均导致统计学显著的和持续的改善。该 结果显示，缺血性损伤之后7天移植MAPCs在行为和神经功能方面得 到了统计学显著的长期(8-周)的持续治疗益处。该结果进一步显示，对 于证实的治疗作用而言不需要免疫抑制。结果图示性地描述于图5和6。
实施例11:在大鼠手术才莫型中用异种(人)MAPCs经注射或I.V.输注递送， 并且用和不用免疫抑制治疗缺血性中风
42只SD大鼠经受大脑中动脉(MCA)结扎手术以诱导动物手术性中 风。在诱导中风之后7天，将各动物分成6组，每组7只动物。每组接受静脉内施用以下中的一种(1)400,000人MAPCs,有免疫抑制治疗 (CSA, lmg/kg, i.p.); (2)400,000人MAPCs，无免疫抑制；(3)1,000,000 人MAPCs,有免疫抑制治疗(CSA， lmg/kg, i.p.); (4)1,000,000人MAPCs， 无免疫抑制治疗；(5)1,000,000辐照的、不可存活的人MAPCs,有免疫 抑制治疗(CSA， lmg/kg, i.p.),和(6) 1,000,000辐照的、不可存活的人 MAPCs,无免疫抑制治疗。
实施例12:在大鼠手术才莫型中用异种(人)MAPCs经注射或I.V.输注递送， 并且用和不用免疫抑制治疗缺血性中风一行为和神经学评价
将动物如实施例11所述处理。在细胞移植之后14天，以及此后8 周每隔14天，分别通过EBST和Bederson试验评价各动物的运动和神 经功能。
在试-睑之后移植后的第56天将动物处死。
在运动功能方面结果显示出显著的剂量依赖性治疗作用。用 1,000,000存活的MAPCs输注的动物比之于用辐照的MAPCs治疗的相 应对照组显示出显著的改善。有和没有免疫抑制时均获得相同的结果。 用400,000存活的MAPCs输注的动物比之于用辐照的MAPCs治疗的相 应对照组没有显著的改善。有和没有免疫抑制时均获得相同的结果。
在神经功能方面结果也显示出显著的剂量依赖性治疗作用。用 400,000和1,000,000存活的MAPCs治疗的动物比之于用辐照的MAPCs 治疗的相应对照组均显示出显著的改善。在用400,000细胞治疗的动物 中历经56天的试验有恢复下降的倾向，但用1,000,000细胞治疗的动物 无此倾向。有和没有免疫抑制时均获得相同的结果。
总之，在运动和神经功能方面，在整个8周的试-睑过程中，用 1,000,000存活的MAPCs治疗的动物显示出统计学显著的、持续的改善。 此外，治疗作用不需要免疫抑制。有和没有CSA时结果相同。
结果图示性地描述于图7和8。
实施例13:时间对大鼠手术模型用异种(人)MAPCs经I.V.输注递送治疗 缺血性中风的影响
28只SD大鼠历受大脑中动月永MCA结4L手术以-漆导动物手术性中 风。将动物分成4组，每组7只动物。每组通过静脉内输注接受1,000,000异种(人)MAPCs,无免疫抑制。除了在诱导中风之后的不同时间施用 MAPCs之外，所有组别均相同处理。根据诱导之后的以下天数将MAPCs 施用于各组(1)1天，(2)2天，和(3)7天。此外，在诱导之后第7天， 第(4)组接受1,000,000辐照的、不可存活的MAPCs。 研究期间在接受MAPCs的动物中未观察到死亡。
实施例14:时间对大鼠手术才莫型用异种(人〗MAPCs经I.V.输注递送治疗 缺血性中风的影响 一运动和神经功能
将动物如实施例13所述处理。在细胞移植之后7天，以及此后8 周每隔7天，分别通过EBST和Bederson试验评价各动物的运动和神经 功能。
在运动和神经功能方面，与用辐照的MAPCs治疗的对照组(第4组) 相比，全部三组用存活的MAP C s治疗的动物的结果显示统计学显著的、 持续的改善。用存活的MAPCs治疗的三组所获得的运动功能的结果之 间无统计学差异。对于神经功能的三组的结果也同样。
结果证明，当在缺血性脑损伤之后第 一天至第七天通过IV施用时， 在运动和神经功能方面，MAPCs均提供了治疗益处。
结果图示性地描述于图9和10。
实施例15:时间对大鼠手术模型用异种〖人)MAPCs经I.V.输注递送治疗 缺血性中风的影响 一植入
将动物如实施例12所述处理。各组在第56天的最终行为试验之后 将动物处死。从处死的动物中采集脑。由脑制备蜡植入组织的半-薄切片。 将切片用DAPI染色以显现所有的细胞核，再用多克隆小鼠抗HuNu(人 细胞核)抗体、接着用FITC-结合羊抗鼠单克隆抗体以染色植入的人 MAPCs。对DAPI染色的细胞和FITC染色的细胞计数。根据FITC染色 的细胞数目确定植入细胞的总数目。注射的MAPCs植入物的百分数是 根据植入细胞总数比输注到各动物的细胞总数的比值计算的。
结果显示在损伤之后施用的早期植入的细胞稍少。损伤之后施用 MAPCs 1天的动物平均为0.75%植入。损伤之后施用MAPCs 2天的动 物平均为1.1%植入的细胞。损伤之后施用MAPCs 7天的动物平均为 1.27%存活的植入的细胞。此趋势无统计学显著性；但是，这表明，中风后即刻的缺血性损伤的炎症环境可能对MAPCs的植入和长期生存益 处较小，然后此环境在此后仅存在少数几天。
实施例16:时间对大鼠手术才莫型用异种(人〗MAPCs经I.V.输注递送治疗 缺血性中风的的影响——神经元保护作用
将动物如实施例12所述处理。如实施例14所述制备脑切片。将备 用的切片(针对实施例14使用的那些)用Nissl染色以确定内源性神经元 的存活。结果显示施用MAPC时统计学显著地减少内源性神经元的死 亡。MAPCs对内源性神经元的存活的保护作用随着中风诱导与MAPC 施用之间的时间的减少而增加。比之于中风诱导后第2天接受MAPCs 的动物，在中风诱导后第1天接受MAPCs的动物中有更多存活的神经 元，并且此差异是统计学显著的。类似地，比之于中风诱导后第7天接 受MAPCs的动物，在中风诱导后第2天接受MAPCs的动物中有更多存 活的神经元，并且此差异也是统计学显著的。结果表明，缺血性事件之 后施用MAPCs越早，对内源性神经元存活的保护作用越大。
结果图示性地描述于图11。
权利要求
1.在受试者中治疗脑损伤的方法，其包括给可能罹患、正在罹患或已经罹患脑损伤的受试者，通过有效途径并以有效治疗所述脑损伤的量施用细胞，该细胞不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞，并且可以分化成内胚层的、外胚层的和中胚层的胚细胞系中的至少两种中每种胚细胞系的至少一种细胞类型。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述的用细胞治疗的受试者没有附加性地用免疫抑制疗法治疗。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述的脑损伤是因缺氧引起的。
4. 根据权利要求3的方法，其中所述的脑损伤是缺氧性缺血性脑损伤。
5. 根据权利要求2的方法，其中所述的脑损伤是因血液供应的闭塞 或阻塞引起的。
6. 根据权利要求2的方法，其中所述的脑损伤是皮层梗死。
7. 根据权利要求2的方法，其中所述的脑损伤是中风。
8. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞可以分化成内胚层的、 外胚层的和中胚层的胚细胞系中每种胚细胞系的至少 一种细胞类型。
9. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞表达端粒酶。
10. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞对oct-3/4呈阳性。
11. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞在它们施用于所述受 试者之前在培养物中经历至少10至40细胞倍增。
12. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
13. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞是人细胞。
14. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞得自从以下任一项分 离的细胞胎盘组织、脐带组织、脐带血、骨髓、血液、脾组织、胸腺 组织、脊髓组织、脂肪组织和肝脏组织。
15. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞对于所述受试者是同 种异体的。
16. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞对于所述受试者是异 种的。
17. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞于所述受试者是自体的。
18. 根据权利要求2的方法，其中所述的受试者是人。
19. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞以一种或多种剂量施 用于所述受试者，所述剂量包括105至108所述细胞/千克所述受试者质量。
20. 根据权利要求19的方法，其中所述的细胞以一种或多种剂量施 用于所述受试者，所述剂量包括106至5 x 107所述细胞/千克所述受试者质量。
21. 根据权利要求2的方法，其中除所述细胞之外， 一种或多种生 长因子、分化因子、信号因子和/或增加归巢的因子被施用于所述受试者。
22. 根据权利要求2的方法，其中进一步地将以下一种或多种的任 意组合施用于所述受试者抗生素剂、抗真菌剂和/或抗病毒剂。
23. 根据权利要求2的方法，其中所述细胞在制剂中被施用，该制 剂包含一种或多种其它的药物活性剂。
24. 根据权利要求23的方法，其中所述的制剂进一步包含以下一种 或多种的任意组合抗生素剂、抗真菌剂和/或抗病毒剂。
25. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞通过肠胃外途径施用 于所述受试者。
26. 根据权利要求25的方法，其中所述的细胞通过静脉内输注施用。
27. 根据权利要求2的方法，其中所述的细胞通过立体定位注射施 用于所述受试者。
28. 根据权利要求1的方法，其中除了用所述细胞治疗外，所述受 试者已经、将会、或正在用一种或多种免疫抑制剂治疗。
29. 根据权利要求l的方法，其中除了用所述细胞治疗外，所述受 试者已经、将会、或正在用以下的一种或多种治疗皮质类固醇、环孢 菌素A、环孢菌素类免疫抑制剂、环磷酰胺、抗胸腺细胞球蛋白、 >琉唑 嘌呤、雷帕霉素、FK-506和除FK-506以外的大环内酯类免疫抑制剂、 以及免疫抑制单克隆抗体剂。
全文摘要
本发明涉及用MAPCs治疗脑的各种损伤、障碍、功能异常、疾病等，特别是在一些方面，涉及由缺氧所致的，包括由全身性缺氧引起以及由血液供应不足引起的损伤、障碍、功能异常、疾病等的治疗。在一些进一步的细节中，本发明涉及，例如，在例如儿童中用MAPCs治疗缺氧性缺血性脑损伤，以及在例如成人中用MAPCs治疗皮层梗死和中风。
文档编号A61K35/50GK101410125SQ200780010390
公开日2009年4月15日 申请日期2007年1月23日 优先权日2006年1月23日
发明者C·V·博尔伦根, D·C·赫斯, J·E·卡罗尔, R·J·迪恩斯, R·W·迈斯 申请人:阿特西斯公司;乔治亚州医学院研究所有限公司