专利名称：通过对薄切肿瘤组织中mRNA表达进行定量测试实体瘤中药物敏感性的方法
技术领域：
本发明涉及检验瘤组织对治疗药物敏感性的方法，特别地，涉及对在所述 方法中从薄切活体肿瘤组织获得的细胞中促细胞凋亡标记物mRNA的表达进
行定量。
相关技术的描述
针对患者"定制"、"个性化"或"个体化"的药物是最近提出的新理念用 于为每个患者鉴定适当的个体化治疗(参见Jain KK，分子治疗学研究进展 (CurrOpinMolTher) 4,548(2002)，这里并入作为参考)。对于癌症患者，这 是特别重要的，因为已知化学治疗药物会诱导严重的副作用。然而，目前的药 物选择依赖于通过使用大量患者的双盲临床试验所得到的统计上显著性结果。 在进行诊断时，患者经历了统计上证实的标准治疗而不考虑在药物敏感性方面 的个体差异。尽管已经进行了各种尝试来预测这些药物应答，当目前仍没有可 以利用的通用方法，主要是由于两个主要的原因l)一旦在体外从外科手术 移出的组织或活组织检查样品分离癌细胞，则癌细胞的特征可能不均一；和2) 通常培养条件不能模拟正常的生理环境。尽管基因组DNA中的单核苷酸多态 性(SNP)提供了某些线索用于鉴定对特定药物的敏感或不敏感的患者(参见 A. Di Paolo， R. Danesi, M. Del Tacca,药理学研究(Pharmacol. Res.) 49， 331 (2004)，这里并入作为参考)，但这些信息不能通用于所有药物。此外，即使已 经鉴定出影响对特定药物应答的SNP,但仍不知道是否还未被鉴定出的第二或 第三种SNP会补偿、抵消或加剧对药物应答的改变。
发明内容
在一个实施方式中，公开了一种确定治疗药物是否针对实体瘤可能有效的 方法，所述方法包括从所述实体瘤获得第一样品和第二样品，其中所述第一 样品和第二样品含有厚度为20微米至500微米基本均一的切片；在体外将第
5一样品与所述药物孵育；在体外将所述第二样品与对照刺激物孵育；在孵育之 后，检测所述第一样品和第二样品中与肿瘤细胞凋亡相关的mRNA的量；以 及将所述第一样品和第二样品中所述mRNA的量进行比较，其中如果所述量 有超过大约50%的差别，则所述治疗可能有效。在进一步的方面中，所述基本 均一的切片具有在大约50微米至200微米范围内的厚度。在进一步的方面中， 所述第一样品和第二样品各自含有至少三个均一的切片。在进一步的方面中， 所述对照刺激物选自由PBS和DMSO所组成的组中。在进一步的方面中，将 所述第一样品和第二样品孵育在C02孵育器中。在进一步的方面中，所述第 一样品和第二样品被孵育3小时至5小时。在进一步的方面中，所述第一样品 和第二样品被孵育大约4小时。在进一步的方面中，如果所述第一样品中所述 mRNA的量高于所述第二样品中所述mRNA的量，则所述治疗可能是有效的。 在进一步的方面中，将所述第一样品和第二样品中所述mRNA的量进行比较 包括确定所述第 一样品中该mRNA的量与所述第二样品中该mRNA的量的比 值，如果该比值是1.5或更高，则所述治疗可能是有效的。在进一步的方面中， 如果该比值为2.0或更高，则所述治疗可能是有效的。在进一步的方面中，所 述治疗药物包括选自由柔红霉素、阿霉素、阿糖胞苷、顺铂、依托泊苷和米托 蒽醌(mitoxantron)所组成组中的药物。
在进一步的方面中，所述与肺瘤细胞的凋亡相关的mRNA是通过包括下 列的方法鉴定的从所述实体瘤获得第三样品和第四样品；在体外，将所述第 三样品暴露于促细胞凋亡刺激；将所述第三样品和第四样品孵育足以在细胞样 品中产生凋亡变化的时间期间；；险测所述第三样品和第四样品中选自由p21、 GADD、 Apaf画l、 S画O、 Bfl誦l、 BCL-W、 BCL-2、 PUMA、 NOXA、 Hrk、 Bim、 BINP3、 Bik、 Bid、 Bad、 Bcl-XS、 Bok、 Bak、 Bax、 LRP和MRP所组 成组中的至少一种mRNA的量；以及确定所述第三样品中mRNA的量与所述 第四样品中mRNA的量的比值，其中表现出比值为1.5或更高的mRNA被鉴 定为凋亡标记物mRNA。在进一步的方面中，所述第三样品和第四样品含有 基本均一的实体瘤切片。在进一步的方面中，所述促细胞凋亡刺激是辐射。在 进一步的方面中，所述足以产生凋亡变化的时间期间是2小时至4小时。在进 一步的方面中，所述足以产生凋亡变化的时间期间是大约3小时。在进一步的方面中，表现出比值为2.0或更高的mRNA被鉴定为凋亡标记物mRNA。
在进一步的方面中，所述第一样品和第二样品是通过包括下列步骤的方法 获得的从实体瘤取出基本均一的部分病灶；将所述部分病灶包埋在与该部分 具有几乎相同硬度并且不会降低所述部分病灶内细胞生存能力的材料中；将所 包埋部分病灶的温度降低到大约4。C;并对所包埋的部分病灶进行切片。在进 一步的方面中，所述均一的部分病灶大致是立方体的。在进一步的方面中，所 述立方体均一的部分病灶检测为大约lmmx lmmx lmm。在进一步的方面中， 所述材料含有可以进入细胞的营养物和氧。在进一步的方面中，所述材料是凝 胶。在进一步的方面中，所述凝胶是通过施加刺激从液体中制备的。在进一步 的方面中，所述刺激选自由化学药物、紫外线和电流所组成的组中。在进一步 的方面中，所述包埋步骤包括将基本均一的部分病灶浸入到液体中；以及通 过施加刺激将所述液体转变为凝胶。 优选实施方式的详细描述
为了克服与置于体外环境的癌细胞变化相关的问题，本发明将薄切片的活 癌组织在体外暴露于候选的化学治疗药物方案。能够从或动物脑样品制备薄切 片的组织切片机在神经科学领域已经被利用了几十年(参见Mayahara H， Fujimoto K, Noda T， Tamura I， Ogawa K. Acta组织化学细胞化学(Histochem Cytochem.) 14,211(1981),这里并入作为参考)。然而，它们从未应用在从 人实体瘤制备用于药物敏感性检验的样品。活体薄切片是这些检验的理想材 料，因为可以对癌样品进行分析而不扰乱细胞间的接触。尽管切面两侧的细胞 被杀死，但是完整的细胞层被保持在切片的中部。 一旦这些切片被悬浮在适当 的培养基中，则药物会渗透到完整的细胞内。可以从均一的癌块(cancer mass) 病灶制备多个同样的切片，接着这些切片可以用于在体外筛选不同的药物方 案。在此之前，还不知道是否能够从新鲜的未固定癌块切出同样的多个薄切片 (厚度为30至100pm),因为癌组织比脑组织要硬得多并且更不规则。而且， 在此之前，还不知道在体外处理的过程中，如何将这些取出的切片保持在生理 条件下。
分析切片组织中细胞的生存能力
将与实体瘤体(solid tumor mass )硬度相似的猪舌用于^N睑切片组织的物理性质。使用剃刀刀片(razor blade )切割大约10mm x 5mm x 5mm (高)的 这种肉片，并置于组织切片机上(DSK-1000，DosakaEM，京都,日本)。将该样 品置于冰冷的磷酸盐緩冲液中(PBS，英杰(Invitrogen))。根据该仪器的操作 说明书制备12份切片样品，其中30nm、50^im和100pm的厚度各有四份样品。 为了评估在四份样品之间的差异，测定每份切片的干重。在
图1中，显示了薄 切片材料的重量。将四份数据表示为平均值土标准偏差(s.d.)。如图l所示， 对应于30|im、 50拜和100pm的3个数据点与5至12%的偏差系数(CV)呈 线性关系。
为了鉴定凋亡变化，通常将样品孵育在37。C下过夜或更长。然而，长时 间的孵育时间产生了较少的生理条件，并可能会诱导某些人为假象。使用之前 已经鉴定的早期凋亡标记物，发现在孵育2至4小时的短时间之后可以鉴定到 促细胞凋亡mRNA表达中的提高(参见Mitsuhashi M, Tomozawa S， Endo K， Shinagawa A.临床化学(Clin Chem.) 52， 634 (2006);国际专利申请No. PCT/US2005/037925;和国际专利申请No. PCT/US2006/022427,这里全部并 入作为参考)。这一点的原因是mRNA表达是比蛋白质合成以及最终的生物学 变化更早的事件。
在一个实施方式中，成功地从2例外科手术取出的胃癌样品制备了 100pm 的切片。图2至4显示了这些样品中mRNA定量的结果。根据本发明发明人 的某些之前公开的方法对来自外科手术取出的胃癌样品(在37。C下孵育3小 时或未孵育的)p21 mRNA进行定量(参见Mitsuhashi M, Tomozawa S， Endo K, ShinagawaA.临床化学(ClinChem.) 52,634(2006),这里并入作为参考)。 简言之，使用组织切片机获得切片，并可选择地进行孵育。 一旦这些切片准备 好进行p21 mRNA定量，则向其加入裂解緩沖液。例如所述裂解緩沖液含有 0.5。/oN-月桂酰肌氨酸、4X标准枸椽酸盐水(SSC)、 10mMTrisHCl、 pH7.4、 1 mM乙二胺四乙酸(EDTA )、 0.1% IGEPAL CA-630以及1.791 M硫氰酸胍， 其被补加了 1%2-巯基乙醇(伯乐，赫拉克勒斯，加利福尼亚，美国(BioRad, Hercules, CA， USA) )、 0.5 mg/ml蛋白酶K (皮尔斯，罗克福德，伊利诺斯州， 美国(Pierce,Rockford,IL,USA))、 0.1mg/ml鲑鱼精子DNA (5普利马艾本德 /布林克曼，韦斯特伯里，纽约州，美国(5 Prime Eppendorf/Brinkmann, Westbury，NY， USA))、 0.1 mg/ml大肠杆菌(￡. co//) tRNA西格玛((Sigma))、各为 10 mM的多种特异性反向引物的混合物以及标准的RNA34寡聚核苷酸。接着 通过与裂解緩冲液剧烈混合溶解所述组织切片(用移液管上下吹吸10至20 次)。通过移液管将所得到的裂解溶液转移到固定寡聚(dT)的微量培养板 (GenePlate， RNAture )。在4。C下存储过夜之后，在4。C下，使用100^1单纯的 裂解緩沖液(plain lysis buffer)清洗3次，接着使用150jil清洗緩冲液(0.5M NaCl、 10 mM Tris、 pH 7.4和1 mM EDTA)清洗3次。通iii口入30pl含有lx RT-緩沖液、均为1.25 mM的各种dNTP、 4单位核酸酶抑制剂(rRNasin)和 80单位莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(普洛麦格(Promega))(无引 物)的緩沖液，并在37'C下孵育2小时在每孔中直接合成cDNA。特异性引物 引导的cDNA存在于溶液中，寡聚(dT)-引导的cDNA保持固定在微孔板中。 对于TaqMan PCR，将所得到的4 pi cDNA溶液直接转入到384孔PCR板中， 向其应用5 pi TaqMan通用主体混合物(master mix) (ABI)和1 |_d寡聚核苷酸 混合物(正向引物和反向引物各为15 pM,以及3至6 TaqMan探针)，在 PRISM 7900HT ( ABI)中进行PCR，在该PCR中首先进行1个循环的95。C10 分钟，接着45个循环的95°C30秒、55。C30秒和60°C1分钟。还可以采用SYBR Green PCR;为了进行SYBR Green PCR,可以将cDNA在水中稀释3至4倍， 并直接将4pl cDNA溶液直接转入到384孔PCR板中，向其应用5 pi主体混 合物(BioRad， Hercules, CA)和l^il寡聚核香酸混合物(正向引物和反向引物 各为15pM)，接着在PRISM 7900HT(ABI)中进行PCR，在该PCR中，首先 进行1个循环的95°C 10分钟，接着45个循环的95°C30秒和60°C 1分钟。每 个基因在单独的孔中得到扩增。通过分析软件(SDS,ABI)对Ct进行确定。
在一个实施方式中，还可以采用快速凝固的惰性凝胶用于在切片之前包埋 所述组织块(tissue mass )。例如，可以采用盛有通过应用化学试剂、紫外线或 电流能够在4'C下快速固化的液体凝胶的一次性小塑料盒。 一旦已经获得组 织，例如尺寸为每个边均为lmm的立方体样品，则将其置于盒内，接着使液 体凝胶固化。在一个实施方式中，凝胶可以是生物学上惰性的，以便不会破坏 所述组织细胞。同样，在某些实施方式中，凝胶的硬度可以与组织的硬度相似。 接着进行切割，优选在4。C下以防止细胞损伤。在进一步的实施方式中，凝胶为所包埋的组织提供了营养物和氧。
将包埋组织的凝胶固定到切割台上，并置于冷的培养基中。在该培养基溶 液中进行切割步骤。因此， 一旦每个组织切片被制成，则其会漂浮在培养基中。
可以使用镊子夹起每个切片，并置于组织培养板内(48孔或24孔板)。将需 要筛选的药物加入到所述培养板中。药物孵育之后，吸走溶液，并加入裂解緩 沖液；可以采用例如上面所述的裂解緩沖液。在37'C下将组织切片在裂解緩 冲液中孵育IO分钟。接着通过剧烈混合裂解緩冲液溶解该组织切片(用移液 管上下吹吸10至20次)。通过移液管将所得到的裂解溶液转移到基因板 (GenePlate )。
在进一步的实施方式中，可以采用利用培养基流的切割机，这样将每个切 片收集在96孔过滤板的每个孔中。接着，从切割机取出过滤板，并置于固定 器之上，固定器临时堵住过滤板在底部的开口 (hole)。接着将培养基和药物 加入到每个孔中，进行孵育1至4小时。因为所述开口被堵住，因此溶液保持 在每个孔中。优选过滤板材料是足够惰性的以不会损伤组织并且不会吸附药 物。从固定器取走过滤板，并置于收集板之上，并应用150pl5mM的Tris，pH 7.4。在4。C下120xg离心1分钟之后，将50nl细胞样品应用于每个孔，并立 即在4'C下120 x g离心2分钟，接着是用300nl PBS在4'C下2000 x g离心5 分钟对每个孔进行清洗一次。接着将60pl的上述储藏裂解緩冲液应用到所述 过滤板，接着在37。C下孵育10分钟。接着将所述过滤板置于固定了寡聚(dT) 的微孔板(GenePlate，RNAture)之上，并在4'C下2000xg离心5分钟。在4 'C下存储过夜之后，在4。C下使用100nl单纯的裂解緩沖液对所述微孔板进行 清洗3次，接着使用150pl清洗緩沖液(0.5 MNaCl、 10 mM Tris、 pH 7.4、 1 mM EDTA)清洗3次。通过加入30pl含有lx RT-緩沖液、均为1.25 mM的各种 dNTP、 4单位rRNasin和80单位MMLV反转录酶(Promega)(无引物)的緩 冲液，并在37'C下孵育2小时在每孔中直接合成cDNA。特异性引物引导的 cDNA存在于溶液中，寡聚(dT)-引导的cDNA保持固定在微孔板中。对于 TaqManPCR，将所得到的4 pl cDNA溶液直接转入到384孔PCR板中，向其 应用5 ^tl TaqMan通用主体混合物(ABI)和1 jil寡聚核苷酸混合物(正向引物 和反向引物各为15 pM，以及3至6 jiM TaqMan4笨针)，在PRISM 7卯0HT( ABI)
10中进行PCR，在该PCR中首先进行1个循环的95。C1Q分钟，接着45个循环 的95°C30秒、55°C30秒和60°C1分钟。还可以采用SYBR Green PCR;为了 进行SYBR Green PCR，可以将cDNA在水中稀释3至4倍，并直接将4^1 cDNA 溶液直接转入到384孔PCR板中，向其应用5 pi主体混合物(BioRad， Hercules, CA)和1^1寡聚核苷酸混合物(正向引物和反向引物各为15 pM),接着在 PRISM 7900HT (ABI)中进行PCR,在该PCR中，首先进行1个循环的95°C 10 分钟，接着45个循环的95°C30秒和60°C1分钟。每个基因在单独的孔中得到 扩增。通过分析软件(SDS，ABI)对Ct进行确定。
下面表1中显示了在检测mRNA中所采用的探针和引物序列。
表l:探针和引物序列 mRNA 索取号 正向引物 反向引物
RNA34
p21 HS431A14
AGCCCCCTCA CTCCCAAA (SEQ ID NO:l) TTCTGCTGTC TCTCCTCAGA TTTCT (SEQ ID NO:3)
GGGTGCTGTG CTTCTGTGAA C
(SEQ ID NO:2) GGATTAGGGC TTCCTCTTGG A
(SEQ ID NO:4)
TaqMan探针FAM-CCACTCCAAA CGCCGGCTGA TC-TAMRA (FAM-SEQ ID NO:5-TAMRA)
GADD153 S40706
Apaf-l AF013263
SUMO-l BC006462
Bfl-l U27467
BCIi-W NM 004050
Bcl—2 BC027258
PUMA AF354654
AGAACCAGGA AACGGAAACA GA
(SEJQ ID NO: 6) TGCGCTGCTC TGCCTTCT
(SEQ ID NO:8) GGGTCAGAGA ATTGCTGATA ATCAT
(SEQ ID NO:IO) CACAGGAGAA TGGATAAGGC AAA
(SEQ ID NO:12) TCCGGCGCACCTTCTCT
(SEQ ID NO:14) CATGTGTGTG GAGAGCGTCA A
(SEQ ID NO:16) GGGCCCAGAC TGTGAATCCT
TCTCCTTCAT GCGCTGCTTT
(SEQ ID NO:7) CCATGGGTAG CAGCTCCTTC T
(SEQ ID NO:9)
CCCCGTTTGT TCCTGATAAA CT
(SEQ ID NO:ll) CATCCAGCCA GATTTAGGTT CAA
(SEQ ID NO:13) CCCAAAGACAAAGAAGGCTACAA
(SEQ ID NO:15) GCCGGTTCAG GTACTCAGTC A
(SEQ ID NO:17) ACGTGCTCTC TCTAAACCTA TGCA(SEQ ID NO:18) (SEQ ID NO
TaqMan探针FAM- CCCCGCCCCA TCAATCCCA
(FAM-SEQ ID NO:20) NOXA BC032 663 CTCAGGAGGT GCACGTTTCA
(SEQ ID NO:21) HRK HSU7637 6 GGGAGCCCAG AGCTTGAAA
(SEQ ID NO:23) BIM BC033694 TCCAGGACAG TTGGATATTG TCA
(SEQ ID NO:25) BNIP3 BC021989 AAATATTCCC CCCAAGGAGT TC
(SEQ ID NO:27) BIK U34584 TCCTATGGCT CTGCAATTGT CA
(SEQ ID NO:29) BID BC036364 CATACACTTT TTCTCTTTCC ATGACATC
(SEQ ID NO:31) BAD BC001901 CAGGCCTATG CAAAAAGAGG AT
(SEQ ID NO:33) Bcl-Xs 丽一001191GGCAGGCGAC GAGTTTGA
(SEQ ID NO:35) BOK NM一032515 TCACATGCTG GTTGCTTAAT CC
(SEQ ID NO:37) BAK NM—001188CACGGCAGAG AATGCCTATG A
(SEQ ID NO:39) BAX AY217036 TTTCTGACGG CAACTTCAAC TG
(SEQ ID NO:41> LRP CAGCTGGCCATCGAGATCA
(SEQ ID NO:43) MRP CAATGCTGTGATGGCGATG
(SEQ ID NO:45)
19)
TTCCAAGGGC (SEQ ID NO GCGCTGTCTT (SEQ ID NO TAAGGAGCAG (SEQ ID NO CGCTCGTGTT (SEQ ID NO GGCAGGAGTG (SEQ ID NO GGGCATCGCA (3EQ ID NO CGCACCGGAA (SEQ ID NO GTTCCCATAG (SEQ ID NO GCACAAGGAC (SEQ ID NO CCCAATTGAT (SEQ ID NO GGTGCACAGG (SEQ ID NO
ACCCATGA 22)
TACTCTCCAC TTC 24)
GCACAGAGAA AGA 26)
CCTCATGCT 28)
AATGGCTCTT C 30)
GTAGCTTCTG 32)
GGGAATCT 34)
AGTTCCACAA AAGTATC 36)
CCCATCACA 38)
GCCACTCTCA 40)
GCCTTGAG 42)
TCCAGTCTCTGAGCCTCATGC (SEQ ID NO"4) GATCCGATTGTCTTTGCTCTTCA (SEQ ID NO:46)
如图2所示，从胃癌的小切片(10mmx5mmx 100 pm)对p21 mRNA进行定量。四批数据表示为平均值士s.d.。 p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑 制剂，其抑制细胞周期蛋白-CDK2和细胞周期蛋白-CDK4复合物的活性，并 作为在G1期细胞周期进展的调节子。在某些肿瘤组织中，例如乳房肿瘤、神 经月交质瘤和卵巢癌，其还显示有助于细胞凋亡。
尽管p21 mRNA (39%至46%)的CV大于图1的CV，但该CV可以被接受 用于得出在3小时的孵育中p21诱导统计学上显著(p=0.02)的结论。这证实 了之前的关于在没有任何刺激体外孵育的过程中p21 mRNA提高的暗示(参 见Mitsuhashi M、 TomozawaS、 EndoK、 ShinagawaA.临床化学(Clin Chem.) 52,634(2006)),并且预示从胃部肿瘤取出的样品是活的，并且有功能。
还检测了肿瘤细胞中与凋亡相关的其他mRNA。在确定细胞经历凋亡时， 已知许多促细胞凋亡蛋白质会被激活。这些包括所谓的Bcl-2/BAX家族基因， 其除了其他的以外还包括BAX、 BAK、 BOKk和Bcl-XS等。BAX的截短形 式例如所谓的仅BH3成员也已知是促细胞凋亡的；该组由BID、 BAD、 BIK、 BIM、 NOXA、 PUMA (p53上调的凋亡调节子)等组成。
在一种或者多种胂瘤类型中，这些mRNA都与凋亡应答相关。GADD153 (生长停滞和DNA损伤诱导基因)已经显示介导骨髓瘤、肝细胞瘤和结肠癌 中的凋亡。Apaf-l蛋白质与线粒体释放的细胞色素C相互作用以和dATP形成 凋亡体复合物，其能够激活caspase (半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶)9并导 致凋亡。已经暗示在黑素瘤和成胶质细胞瘤中存在Apaf-l沉默或下调。尽管 SUMO-l (小泛素相关调节子)在结构上涉及泛素，但如果蛋白质被SUMO 修饰(SUMO化)，则似乎蛋白质被保护免于泛素介导的降解。此外，SUMO 控制对于基因组完整性的监控重要的途径，并调节PML/p53肿瘤抑制剂网络， 这是对DNA损伤的细胞应答中的关键决定因素。Bfl-l是Bcl-2家族的成员； Bfl-l抑制p53介导的凋亡并表现出细胞增殖和转化活性。在胃癌和结肠癌以 及乳癌中已经发现了水平提高的Bfl-l。 BCL-W是Bcl-2家族的另一个成员， 并且具有抗凋亡的作用。显示参与保护胃癌细胞。Bcl-2基因具有抗凋亡作用。 Bcl-2与caspase-9和Apaf-l形成复合物，该复合物防止这些蛋白质形成凋亡 体并启动导致凋亡的蛋白酶级联反应。其显示参与B细胞恶性肿瘤和慢性淋 巴细胞白血病。PUMA (p53上调的凋亡调节子，也被称作BBC3)在转录上被诱导以诱导通过线粒体凋亡途径的凋亡。其在转录上被p53所激活，并且在 内质网应激之后也独立于p53状态而被上调。其显示参与黑素瘤、结肠直肠癌、 头颈癌和胰腺癌等癌症。尽管这里没有提供数据，但NOXAmRNA也可以用 作标记物基因NOXA (也被称作PMAIP1或ARP)已经被发现在成人T细 胞白血病中是高度表达的，并且具有应答细胞损伤的促凋亡功能(proapoptotic function),其参与caspase-9的激活以及后续的凋亡。Hrk是与Bcl-2相互作用 的凋亡的激活剂。已经显示参与星形细胞肿瘤和中枢神经系统淋巴瘤。Bim与 大部分Bcl-2同族体共有短BH3基序；Bim促进凋亡。其已经显示参与外套细 胞淋巴瘤的发生。BINP3是已经与恶性神经胶质瘤相关的促细胞凋亡Bcl-2家 族蛋白质。Bik(与Bcl-2相互作用的杀死剂)蛋白质是另一种促细胞凋亡Bcl-2 家族成员；其已经显示参与B细胞淋巴细胞瘤和乳癌，并且在上皮和肺部细 胞中也已经观察到了 Bik的表达。Bid(与BH3结构域相互作用的死亡激动剂) 是促细胞凋亡蛋白质(proapoptotic protein),其参与骨肉瘤和胃癌。Bad是另 一种Bcl-2促细胞凋亡家族成员，其已经与B细胞淋巴瘤和结肠癌相关。Bcl-XS 是该家族的另一种促细胞凋亡成员，其已经与肝细胞癌、乳癌和卵巢癌相关。 Bok (Bcl-2相关的卵巢杀死剂)是另一种Bcl-2促细胞凋亡家族成员，其已经 与卵巢癌相关。另一种Bcl-2同族体Bak是细胞凋亡的强启动子，并且已经显 示参与胃癌和结肠直肠癌。Bax (Bcl-2相关的X蛋白质)是促细胞凋亡蛋白 质，其显示参与多种癌症，包括急性和慢性淋巴细胞白血病、胃癌和结肠直肠 癌、乳癌和胰腺癌。在人纤维肉瘤、肝细胞癌和急性髓细胞样白血病中已经发 现了 LRP(肺耐药蛋白)表达。已经显示在肝细胞癌和结肠直肠癌中表达MRP 基因。
目前还没有清楚地阐明在药物诱导的凋亡过程中在每种类型癌症样品中 在转录水平上表达何种mRNA。根据细胞、药物的类型或者刺激物的剂量和 程度，特异性的mRNA可能得到更主要地表达。也可能有个体差异。因此， 在一个实施方式中，可以为每种癌症(肺癌、肝癌、乳癌等)使用多种不同的 药物筛选所有的这些凋亡相关的mRNA。 一旦鉴定出针对个体肿瘤或特定的 癌症类型的特异性的mRNA标记物，则这些标记物mRNA可以用于药物筛选。
如图3所示，在3小时的孵育中，不仅p21，而且PUMA、 Hrk、 Bim、Bid和MRPmRNA都是显著提高的(p<0.05)。在图3中，四份数据显示为平 均值土标准偏差(s.d.)。阴影柱显示p<0.05。在mRNA制备的过程(参见 Mitsuhashi等人，Clin Chem. 52， 634 (2006)，这里并入作为参考)中掺入到裂解 緩沖液中对照RNA (RNA34)的水平不会显示任何显著的变化，这说明该检 验被正确地进行。
鉴定肿瘤特异性mRNA凋亡标记物
为了鉴定凋亡变化，使用15戈瑞(Gy)的辐射对如上获得的胃癌切片进 行刺激，并在37。C下进行孵育3小时。根据之前的研究，选择15Gy的辐射(参 见Mitsuhashi等人，Clin Chem. 52, 634 (2006))。接着是用上述的方法检验多种 凋亡相关mRNA的水平。
结果显示在图4中。在图4中，四份数据显示为平均值± s.d.。闭合柱(closed bar)显示p<0.05。如图4所示，Bik是促细胞凋亡l又BH3的mRNA之一净皮显 著地诱导，尽管在全血中发现的凋亡标记物mRNA (p21和PUMA)在该胃癌 样品中没有被诱导。在此情况下，Bik将是用于筛选针对该肿瘤药物方案的适 当标记物。类似地，可以针对每种癌中确定适当的标记物mRNA。由于数据 是从多种实体瘤类型的众多病例中得出的，因此期望出现的表ii^莫式将能够使 临床医生能够鉴定最适当的mRNA标记物以用于基于肿瘤的组织化学、遗传 学或其他分型的药物筛选分案中。 一旦针对个体的胂瘤鉴定或者基于肿瘤类型 选择了这类标记物mRNA，则可以将活体癌切片用于体外mRNA分析，其将 能够对多种癌症样品进行药物敏感性检验。
因此，在该方法的一个实施方式中，从个体肺瘤样品制备的切片可以进行 促细胞凋亡刺激例如辐射，并可以将经过刺激的切片和未经过刺激的切片孵育 足以在细胞样品中产生凋亡变化的时间期间。例如可以是大约3至4小时的时 间期间。在此之后，可以在上述经过刺激和未经过刺激的样品中检测肿瘤组织 中凋亡相关的各种可能标记物mRNA的水平。标记物mRNA可以是促细胞凋 亡的或者抗细胞凋亡的。在一个实施方式中，在经过刺激的样品中mRNA量 与在未经过刺激的样品中mRNA的量的比值表现为1.5或更高的促细胞凋亡 mRNA可以被选做为标记物mRNA用于药物筛选。在进一步的实施方式中， 可以选择表现出2.0或更高比值的mRNA。在进一步的实施方式中，在未经过
15刺激的样品中mRNA量与经过刺激的样品中mRNA的量的比值为1.5或更高 的抗细胞凋亡mRNA可以被选做标记物mRNA用于药物筛选。在进一步的实 施方式中，可以选择表现出2.0或更高比值的mRNA。
在进一步的实施方式中，不获得肿瘤组织的切片用于刺激以鉴定标记物 mRNA，而是使用胶原酶或胰蛋白酶对肿瘤组织进行匀浆，并将所分离的细胞 悬浮液进行刺激，接着检测所述mRNA。
药物筛选方案
从新分离的大鼠脾脏制备多个薄切片(200pim)，并将这些切片与多种药 物在C02孵育器中孵育4小时。采用脾脏作为肿瘤组织的代用品是因为其是 均一的、容易切片的并且可以获得大尺寸的。在孵育之后，通过上面所描述的 方法而无需使用过滤板来对P-肌动蛋白(3个不同的引物对)、PUMA(1个引 物对)和p21 (3个不同的引物对)进行定量。下面的表2显示了引物序列。
表2:探针和引物序列
mRNA正向引物反向引物
p-肌动蛋白TTCAACACCCCAGCCATGTGTGGTACGACCAGAGGCATACA
(引物对l)(SEQ ID NO:47)(SEQ ID NO"8)
p-肌动蛋白TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTACTGCTTGCTGATCCACATCTG
(引物对2)(SEQ ID NO:49)(SEQ ID NO:50)
P-肌动蛋白CCCTGGCTCCTAGCACCATGAGCCACCAATCCACACAGA
(引物对3)(SEQ ID NO:51)(SEQ ID NO:52)
PUMATGCACTGATGGAGATACGGACTTCCCCTCGGTCACCATGAGT
(SEQ ID NO:53)(SEQ ID NO:54)
p21GCGGGACCGGGACATCCGCTTGGAGTGATAGAAATCTGTTAG
(引物对1)(SEQ ID NO:55)(SEQ ID NO:56)
p21GATTGCGATGCGCTCATGCGTCTCAGTGGCGAAGTCAA
(引物对2)(SEQ ID NO:57)(SEQ ID NO:58)
p21ACCAGCCACAGGCACCATCGGCATACTTTGCTCCTGTGT
(引物对3)(SEQ ID NO:59)(SEQ ID NO:60)
简言之，在C02孵育器中37。C下，将3份切片暴露于各自为50mM的柔红霉素和阿霉素("DNR")、 1 mM的阿糖胞香(AraC)和50|iM的顺粕 ("AraC")，以及500nM依托泊苷和50,米托蒽醌("VP16")以及各自的 对照(DNR和AraC为PBS, VP16为DMSO) 4个小时。接着不使用过滤板 对P-肌动蛋白(3个不同的引物对)、PUMA (l个引物对)和p21 (3个不同 的引物对)mRNA进行定量。在水中将所得到的cDNA稀释4倍，并直接将4^1 cDNA溶液转移到384孔PCR板中，向其中应用5pl iTaq SYBR主体混合物 (BioRad, Hercules， CA )和1 pl寡聚核苷酸混合物(正向引物和反向引物各自 为15 pM)，并在PRISM 7900HT (ABI)中进行PCR，其中首先是一个循环的 95。C持续10分钟，接着是45个循环的95。C持续30秒和60。C持续1分钟。将 lxRT緩冲液用作阴性对照以确认在这些PCR条件下没有产生引物二聚体。而 且，分析在每一例中的熔解曲线，以确认PCR信号是从单个PCR产物产生的。 通过分析软件(SDS， ABI)确定Ct。通过取代适当对照样品的Ct值计算A Ct，并通过2 (-AQ)及通过假设每个PCR循环的效率是100%计算倍数增长。
结果显示在图5中。在图5中，数据表示为平均值土s.d.，承表示p0.03。 尽管存在切片间差异，但DNR诱导的p21和PUMA降低被鉴定为是统计学 上显著的，而对照的看家基因((3-肌动蛋白)没有变化。相反，VP-16和AraC 方案显示在组织的mRNA表达上没有统计上显著的影响。这显示该系统能有 效用于检验组织对特定药物方案的敏感性。
因此，在一个实施方式中，在暴露于药物的肿瘤组织显示与肿瘤组织中凋 亡相关的标记物mRNA表达水平的变化时，这是该治疗潜在有效性的预示。 特别地，如果暴露于药物的组织切片中标记物mRNA水平与暴露于对照试剂 的胂瘤切片中的标记物mRNA水平有超过大约50%的差异，则该治疗可能是 有效的。所述标记物mRNA可以是促细胞凋亡的或者是抗细胞凋亡的。在进 一步的实施方式中，在暴露于药物的切片中促细胞凋亡mRNA的量与暴露于 对照刺激物的切片中促细胞凋亡mRNA的量的比值为1.5或更高，则是有效 治疗的预示。在进一步的实施方式中，2.0或更大的比值是有效治疗的预示。 在暴露于对照刺激物的切片中抗细胞凋亡mRNA的量与暴露于药物的切片中 抗细胞凋亡mRNA的量比值为1.5或更高，则是有效治疗的预示。在进一步 的实施方式中，2.0或更大的比值是有效治疗的预示。
权利要求
1. 一种确定治疗药物是否针对实体瘤可能有效的方法，其包括从所述实体瘤获得第一样品和第二样品，其中所述第一样品和第二样品含有厚度为20微米至500微米基本均一的切片；在体外将所述第一样品与所述药物孵育；在体外将所述第二样品与对照刺激物孵育；在孵育之后，检测所述第一样品和第二样品中与肿瘤细胞凋亡相关的mRNA的量；以及将所述第一样品和第二样品中所述mRNA的量进行比较，其中如果所述量之间的差别超过大约50％，则所述治疗可能有效。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述基本均一的切片具有在大约 50微米至200微米范围内的厚度。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一样品和第二样品各自含 有至少三个均一的切片。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述与肿瘤细胞的凋亡相关的 mRNA是通过包括下列的方法鉴定的从所述实体瘤获得第三样品和第四样品； 在体外，将所述第三样品暴露于促细胞凋亡刺激； 将所述第三样品和第四样品孵育足以在细胞样品中产生凋亡变化的时间 期间；检测所述第三样品和第四样品中选自由p21、 GADD、 Apaf-l、 SUMO、 Bfl誦l、 BCL画W、 BCL画2、 PUMA、 NOXA、 Hrk、 Bim、 BINP3、 Bik、 Bid、 Bad、 Bcl-XS、 Bok、 Bak、 Bax、 LRP和MRP所组成组中的至少一种mRNA的量； 以及确定所述第三样品中mRNA的量与所述第四样品中mRNA的量的比值， 其中，表现出1.5或更高比值的mRNA被鉴定为凋亡标记物mRNA。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述第三样品和第四样品含有基 本均一的实体瘤切片。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一样品和第二样品是通过 包括下列步骤的方法获得的从实体瘤取出基本均一的部分病灶；将所述部分病灶包埋在与所述部分病灶具有几乎相同硬度并且不会降低所述部分病灶内细胞生存能力的材料中；将所包埋部分病灶的温度降低到大约4。C;以及 对所包埋的部分病灶进行切片。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述均一的部分病灶大致是立方 体的。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，所述立方体均一的部分病灶被检 观寸为大约lmmx lmmx lmm。
9. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述材料含有可进入细胞的营养 物和氧。
10. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述材料是凝胶。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述凝胶是通过施加刺激从液 体制备的。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述刺激选自由化学药物、紫 外线和电流所组成的组中。
13. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述包埋步骤包括 将基本均一的部分病灶浸入到液体中；以及 通过施加刺激将所述液体转变为凝胶。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述对照刺激物选自由PBS和 DMSO所组成的组中。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一样品和第二样品被孵育在C02孵育器中。
16. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一样品和第二样品被孵育 3小时至5小时。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一样品和第二样品被孵 育大约4小时。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中，如果所述第一样品中所述mRNA 的量高于所述第二样品中所述mRNA的量，则所述治疗可能是有效的。
19. 根据权利要求1所述的方法，其中，将所述第一样品和第二样品中 mRNA的量进行比较包括确定所述第一样品中mRNA的量与所述第二样品中 mRNA的量的比值，如果所述比值为1.5或更高，则所述治疗可能是有效的。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中，如果所述比值为2.0或更高，则 所述治疗可能是有效的。
21. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述促细胞凋亡刺激是辐射。
22. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述足以产生凋亡变化的时间期 间是2至4小时之间。
23. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述足以产生凋亡变化的时间期 间是大约3小时。
24. 根据权利要求4所述的方法，其中，表现出2.0或更高比值的mRNA :故鉴定为凋亡标记物mRNA。
25. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述治疗药物包括选自由柔红霉 素、阿霉素、阿糖胞苷、顺铂、依托泊苷和米托蒽醌所组成组中的药物。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测瘤组织对治疗药物敏感性的方法，特别地，其用于对在所述方法中从薄切活体肿瘤组织获得的细胞中促细胞凋亡标记物mRNA的表达进行定量。该方法可以包括确定个体的肿瘤或肿瘤类型的特定凋亡标记物mRNA，以及将来自个体的肿瘤或肿瘤类型的薄切活体癌组织在体外暴露于候选的化学治疗药物方案中，接着确定所述组织中标记物mRNA的水平。
文档编号A61K49/00GK101437549SQ200780016331
公开日2009年5月20日 申请日期2007年5月8日 优先权日2006年5月8日
发明者三桥将人, 小原和彦 申请人:日立化成工业株式会社;日立化成研究中心公司