抗体纯化的制作方法

专利名称：：抗体纯化的制作方法抗体纯化相关申请本申请要求2006年4月5日提交的美国临时申请系列号60/789,725的优先权和2006年4月6日提交的美国临时申请系列号60/790,414的优先权，每个临时申请的内容通过引用整体结合到本文中。
背景技术：
：大规模且经济地纯化蛋白质对于生物技术产业来说是一个曰益重要的问题。通常，蛋白质是使用经工程改造能产生目的蛋白质的哺乳动物细胞系或细菌细胞系通过细胞培养产生的，所述工程改造是将包含编码该蛋白质的基因的重组质粒插入到该细胞系中。由于所用的细胞系是活的生物，必需给它们喂养包含糖类、氨基酸和生长因子的复杂生长培养基，这种培养基通常从动物血清的制品(preparation)供应。要将所需的蛋白质与喂养细胞的化合物混合物和与细胞本身的副产物进行分离，至足够作为人类治疗剂使用的纯度，这是一个极大的难题。发明概述对于改进的、用以获得宿主细胞蛋白质(包括组织蛋白酶L酶原(procathepsinL))含量P争低的抗体制品的方法，人们是有需求的。本发明提供用以纯化宿主细胞表达系统中所表达的抗体的方法，其中所得抗体制品包含的宿主细胞蛋白质(包括組织蛋白酶L酶原)的含量降低。本发明的改进方法还包括准确检测宿主细胞蛋白质的可再现方法的开发，以及动力学测定法。本发明提供用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，所述方法包括离子交换步骤，其中将该混合物施加到第一离子交换材料，由此获得HCP降低的抗体制品。在一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括使该混合物通过第一离子交换材料，由此获得HCP水平降低的第一洗脱物(eluate)。在一个实施方案中，本发明的该方法还包括第二离子交换分离步骤，其中将第一洗脱物施加到第二离子交换材料，由此获得HCP水平降低的第一流通物(flowthrough)。在另一个实施方案中，本发明的该方法还包括疏水相互作用分离步骤，其中将第一流通物施加到第一疏水相互作用材料，由此获得HCP水平降低的第二洗脱物。在本发明的一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括第一离子交换层析步骤，其中将该混合物荷载到包含第一离子交换材料的柱子上，由此获得HCP水平降低的第一洗脱物。在一个实施方案中，本发明还包括第二离子交换层析步骤，该步骤包括将第一洗脱物荷载到包含第二离子交换材料的柱子上，由此获得第一流通物。在一个实施方案中，本发明还包括疏水相互作用分离步骤，该步骤包括将第一流通物荷载到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此获得第二洗脱物。在一个实施方案中，疏水相互作用分离步骤包括疏水相互作用层析。在一个实施方案中，疏水相互作用层析是苯基琼脂糖凝胶层析。在又另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约20至约40克抗体/升疏水相互作用材料。在还另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约30至约36克抗体/升疏水相互作用材料。在一个实施方案中，离子交换层析步骤是阳离子交换层析。在另一个实施方案中，阳离子交换层析是与磺酸基连接的基于合成的甲基丙烯酸酯的聚合物树脂。在又另一个实施方案中，本发明还包括以多个洗涤步骤洗涤该离子交换材料。在一个实施方案中，该多个洗涤步骤包括电导率的增加。在一个实施方案中，该离子交换材料用包含约40-50%洗脱緩冲液和约50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗液进^f亍洗涤。在一个实施方案中，该洗脱緩冲液是20mMNa2P04,150mM氯化钠，pH7。在一个实施方案中，将第一洗脱物在进行第一离子交换层析步骤前先进行病毒灭活。在一个实施方案中，该病毒灭活是通过pH病毒灭活(例如降低第一洗脱物的pH，从而使病毒灭活)来实现。在本发明的一个实施方案中，第二离子交换层析步骤包括阴离子交换层析。在一个实施方案中，该阴离子交换层析是Q琼脂糖凝胶层析。本发明还提供用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，其中该HCP水平降4氐如下来实现改变第一洗脱物的pH和电导率，使得第一洗脱物的pH和电导率与第二离子交换材料的pH和电导率基本上相似。在一个实施方案中，第二离子交换材料的pH为约7.7至约8.3。在另一个实施方案中，将第一洗脱物的pH改变至约7.7至约8.3。在又另一个实施方案中，将第一洗脱物的pH改变至约8.0。在一个实施方案中，第二离子交换材料的电导率为约3.5mS/cm至约5.2mS/cm，或者约3.5mS/cm至约4.9mS/cm。在一个实施方案中，将第一洗脱物的电导率改变至约3.5mS/cm至约5.2mS/cm或者约3.5mS/cm至约4.9mS/cm。在本发明的一个实施方案中，经HCPELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比该混合物少约90至约100倍。在另一个实施方案中，经HCPELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。在还另一个实施方案中，经HCPELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。本发明提供用以从包含抗体和组织蛋白酶L酶原的混合物生产组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品的方法，所述方法包括离子交换分离步骤，其中将该混合物施加到第一离子交换材料，由此获得组织蛋白酶L酶原降4氐的抗体制品o在一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括使该混合物通过第一离子交换材料，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脱物。在一个实施方案中，该离子交换分离步骤包括第一离子交换层析步骤，其中将该混合物荷载到包含第一离子交换材料的柱子上，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第一洗脱物。在一个实施方案中，本发明还包括第二离子交换分离步骤，其中将第一洗脱物施加到第二离子交换材料，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第一流通物。在一个实施方案中，本发明还包括第二离子交换层析步骤，该步骤包括将第一洗脱物荷载到包含第二离子交换材料的柱子上，由此获得第一流通物。在一个实施方案中，本发明还包括疏水相互作用分离步骤，该步骤包括将第一流通物荷载到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此获得组织蛋白酶L酶原水平降低的第二洗脱物。在另一个实施方案中，本发明还包括疏水相互作用分离步骤，该步骤包括将第一流通物荷载到包含第一疏水相互作用材料的柱子上，由此获得第二洗脱物。在一个实施方案中，离子交换层析步骤是阳离子交换层析，包括但不限于与磺酸基连接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物树脂。在另一个实施方案中，离子交换层析步骤还包括以多个洗涤步骤洗涤该离子交换材料。在一个实施方案中，该多个洗涤步骤包括电导率的增加。在一个实施方案中，该离子交换材料用包含约40-50%洗脱緩冲液和约50-60%水(例如注射用水(WFI))的洗涤緩冲液进行洗涤。在又另一个实施方案中，该洗脱緩冲液是20mMNa2P04,150mM氯化钠，pH7。在本发明的一个实施方案中，将第一洗脱物在进行离子交换层析步骤前先进行病毒灭活。在一个实施方案中，该病毒灭活是通过pH病毒灭活(例如降低第一洗脱物的pH，从而使病毒灭活)来实现。在一个实施方案中，该离子交换层析步骤包括阴离子交换层析。在一个实施方案中，该阴离子交换层析是Q琼脂糖凝胶层析。本发明还描述了这样的方法，其中组织蛋白酶L酶原水平降低如下来实现改变第一洗脱物的pH和电导率，使得第一洗脱物的pH和电导率与第二离子交换材料的pH和电导率基本上相似。在一个实施方案中，第二离子交换材料的pH为约7.7至约8.3。在另一个实施方案中，将第一洗脱物的pH改变至约7.7至约8.3。在又另一个实施方案中，将第一洗脱物的pH改变至约8.0。在还另一个实施方案中，第二离子交换材料的电导率为约3.5mS/cm至约5.2mS/cm，或者约3.5mS/cm至约4.9mS/cm。在一个实施方案中，将第一洗脱物的电导率改变至约3.5mS/cm至约5.2mS/cm，或者约3.5mS/cm至约4.9mS/cm。在本发明的一个实施方案中，该疏水相互作用分离步骤包括疏水相互作用层析。在一个实施方案中，疏水相互作用层析是苯基琼脂糖凝胶层析。在又另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约20至约40克抗体/升疏水相互作用材料。在还另一个实施方案中，荷载到疏水相互作用材料上的抗体量为约30至约36克抗体/升疏水相互作用材料。在一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约25至约60RFU/s/mg抗体。在另一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性为约0.4至约4RFU/s/mg抗体。在又另一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体在本发明的一个实施方案中，组织蛋白酶L酶原的水平有重现性地低下(reproduciblylow)。在一个特别优选的方面，本发明提供这样的抗体纯化方法，其中可将高含量的抗体-HCP混合物荷载到离子交换树脂上，以实现混合物中HCP的降低。这个方法的优点是，它可用于这样的抗体-HCP混合物，该混合物在被施加到离子交换树脂前未曾被施以A蛋白捕捉。A蛋白捕捉通常被用作抗体纯化程序中的初始纯化步骤，作为除去HCP的手段，其中将抗体-HCP混合物施加到A蛋白柱，使得抗体与A蛋白结合，而HCP则流过。因此，本发明的方法可用来纯化大载量的抗体-HCP混合物，而无需执行A蛋白层析作为初始步骤。因此，在一个实施方案中，本发明提供用以>(人包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降4氐的抗体制品的方法，所述方法包括以下步骤(a)将该混合物施加到在平衡緩冲液中的第一离子交换树脂，其中施加量大于30克抗体/升树脂；(b)以多个洗涤步骤从该树脂洗涤HCP;和(c)用该洗脱緩冲液从该树脂洗脱该抗体形成第一洗脱物，由此获得该HCP降低的抗体制品。在另一个实施方案中，施加量约为35-70克抗体/升树脂。在还另一个实施方案中，施加量约为70克抗体/升树脂。在一个优选的实施方案中，包含抗体和至少一种HCP的该混合物，在被施加到第一离子交换树脂前，没有被施以A蛋白捕捉(例如没有净皮施加到A蛋白柱)。优选地，该多个洗涤步骤包括至少第一次洗涤和第二次洗涤，其中从第一次洗涤到第二次洗涤电导率有增加。更优选地，第一次洗涤是用平衡緩冲液进行，第二次洗涤是用洗脱緩冲液和水(例如WFT)的混合物进行。例如，洗脱緩冲液和水的混合物可包含约40-50%洗脱緩冲液和约50-60%水。更优选地，洗脱緩冲液和水的混合物可包含约45%洗脱緩沖液和约55%水。在一个优选的实施方案中，洗脱緩冲液包含20mM磷酸钠和150mM氯化钠。在这个情况中，其中含45%洗脱緩冲液和约55°/。水的洗脱緩冲液和水混合物，是9mM磷酸钠和68mM氯化钠。在一个优选的实施方案中，第一次洗涤是用包含20mM磷酸盐、25mM氯化钠的平衡緩冲液进行，第二次洗涤是用包含9mM磷酸盐、68mM氯化钠的緩冲液(45%洗脱緩沖液、55%水)进行，洗脱緩冲液包含20mM磷酸盐、150mM氯化钠。15在一个实施方案中，该使用第一离子交换树脂的方法在pH7下进行。在另一个实施方案中，该使用第一离子交换树脂的方法在pH5下进行。在还另一个实施方案中，该使用第一离子交换树脂的方法在约pH5至约pH7范围内或者pH5至pH7范围内的某pH下进行。如使用pH7，优选施加约35克抗体/升树脂。如使用pH5，优选施加约70克抗体/升树脂。如使用在约pH5至约pH7范围内(例如pH5至pH7)的某pH，优选施加的抗体量为约35至约70克抗体/升树脂(例如35-70克抗体/升树脂)。在一个优选的实施方案中，通过将较多的抗体荷载到树脂上(例如约70克抗体/升树脂)，来实现(例如在pH5下)更好地从抗体-HCP混合物清除HCP，这比将较少的抗体荷载到树脂上(例如约30克抗体/升树脂)所实现的清除更好。据认为这是由于当使用这样的条件时抗体将HCP从树脂上置换下来的结果，在该条件下抗体对树脂的结合亲和力显著大于HCP对树脂的结合亲和力。优选地，第一离子交换树脂是阳离子交换树脂。优选地，将该阳离子交换树脂形成柱子，将包含抗体和至少一种HCP的混合物施加到该柱子。优选地，该阳离子交换树脂包含与磺酸基连接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物树脂(例如FractogelS)。或者，该阳离子交换树脂可包含例如与磺酸基(如锍离子或磺乙基)连接的如下树脂基于曱基丙烯酸酯或聚苯乙烯的合成聚合物、二氧化硅、带葡聚糖表面延伸剂(dextransurfaceextender)的高度交联琼脂糖、烯丙基葡聚糖与N,N-亚甲基双丙烯酸树脂的交联共聚物。在本发明的另一个方面，在进行上述的使用第一离子交换树脂的方法后，该方法还包括将第一洗脱物进行病毒灭活步骤。例如，其中病毒灭活可通过pH病毒灭活来实现，以形成病毒灭活制品(例如，将第一洗脱物施以低pH条件，如pH约3.5，从而使病毒灭活)。优选地，将病毒灭活制品施加到第二离子交换树脂，其中在将病毒灭活制品施加到第二离子交换树脂前，将病毒灭活制品的pH和电导率调整到与第二离子交换树脂的pH和电导率基本相似。例如，第二离子交换树脂的pH可在约pH7.7至约pH8.3的范围，可将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.7至约pH8.3的范围。在另一个实施方案中，第二离子交换树脂的pH可在约pH7.8至约pH8.2的范围，可将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.8至约pH8.2的范围。更优选地，第二离子交换树脂的pH为约pH8.0,将病毒灭活制品的pH调整到约pH8.0。此外，第二离子交换树脂的电导率可在约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围，将病毒灭活制品的电导率调整到约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围。优选地，第二离子交换树脂的电导率为约5.0mS/cm，将病毒灭活制品的电导率调整到约5.0mS/cm。在一个优选的实施方案中，第二离子交换树脂是阴离子交换树脂。例如，阴离子交换树脂可以是Q琼脂糖凝胶树脂。优选地，将第二离子交换树脂形成柱子，将病毒灭活制品施加到该柱子上，由此获得第一流通物。在本发明的另一个方面，从第二离子交换树脂获得第一流通物后，可将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物。在一个优选的实施方案中，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。在一个实施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含约20至约40克抗体/升疏水相互作用柱材料。在另一个实施方案中，施加到疏水相互作用柱的第一流通物包含约30至约36克抗体/升疏水相互作用柱材料。由于纯化过程中的初始步骤的效率，已发现没有必要将从疏水相互作用柱获得的第二洗脱物进行产物峰分级分离。因此，在一个实施方案中，没有将第二洗脱物进行产物峰分级分离。在特别优选的一个实施方案中，本发明的用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，包括以下步骤(a)将该混合物施加到在平衡緩冲液中的阳离子交换树脂，其中该混合物在施加到该阳离子交换树脂前未曾被施以A蛋白捕捉，且其中施加量大于30克抗体/升树脂；(b)以多个洗涤步骤从该阳离子交换树脂洗涤HCP;(c)用该洗脱緩冲液从该阳离子交换树脂洗脱该抗体，以形成第一洗脱物；(d)将第一洗脱物进行病毒灭活步骤；(e)将所得病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，以获得第一流通物；和(f)将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；从而获得HCP降低的抗体制品。在一个实施方案中，该阳离子交换树脂为pH7,施加量约为35克抗体/升树脂。在另一个实施方案中，该阳离子交换树脂为pH5，施加量约为70克抗体/升树脂。在还另一个实施方案中，pH在约pH5至约pH7(例如pH5topH7)的范围，施加的抗体量为约35至约70克抗体/升树脂(例如35-70克抗体/升树脂)。优选地，该多个洗涤步骤包括用釆用平衡緩冲液的第一洗液和采用洗脱緩冲液和水混合物的第二洗液来洗涤该树脂。例如，该洗脱緩冲液和水混合物可包含约40-50%洗脱緩冲液和约50-60%水(例如WFI)，更优选约45%洗脱緩沖液和约55%水(例如WFI)。在一个优选的实施方案中，洗脱緩冲液包含20mM磷酸钠和150mM氯化钠。在这个情况中，其中含45%洗脱緩冲液和约55%水的洗脱緩沖液和水混合物，是9mM磷酸钠和68mM氯化钠。在一个优选的实施方案中，第一次洗涤是用包含20mM磷酸盐、25mM氯化钠的平衡緩冲液进行，第二次洗涤是用包含9mM磷酸盐、68mM氯化钠的緩冲液(450/0洗脱緩沖液、55%水)进行，洗脱緩冲液包含20mM磷酸盐、150mM氯化钠。优选地，在上述的包括步骤(a)到(f)的方法中，在将病毒灭活制品施加到该阴离子交换树脂前(即在步骤(d)和(e)之间)，将病毒灭活制品的pH和电导率调整到与该阴离子交换树脂的pH和电导率基本相似。例如，第二离子交换树脂的pH可在约pH7.7至约pH8.3的范围，将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.7至约pH8.3的范围。在另一个实施方案中，第二离子交换树脂的pH可在约pH7.8至约pH8.2的范围，将病毒灭活制品的pH调整到约pH7.8至约pH8.2的范围。更优选地，第二离子交换树脂的pH为约pH8.0，将病毒灭活制品的pH调整到约pH8.0。此外，第二离子交换树脂的电导率可在约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围，将病毒灭活制品的电导率调整到约3.5mS/cm至约5.2mS/cm的范围。优选地，第二离子交换树脂的电导率为约5.0mS/cm，将病毒灭活制品的电导率调整到约5.0mS/cm。在上述的包括步骤(a)到(f)的方法中，优选地该阳离子交换树脂是与磺酸基连接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物树脂(例如Fractogel),该阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶树脂，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。优选地，经HCPELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比该混合物少约90至约100倍。优选地，经HCPELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。优选地，经HCPELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。在特别优选的一个实施方案中，本发明的用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，包括以下步骤(a)将该混合物施加到在平衡緩冲液中的阳离子交换树脂，其中该阳离子交换树脂为pH7且施加量大于35克抗体/升树脂，或者该阳离子交换树脂的pH在pH5至pH7的范围且施加量约为35至约70克抗体/升树脂，或者该阳离子交换树脂为pH5且施加量大于70克抗体/升树脂；(b)以包括第一次洗涤和第二次洗涤的洗涤步骤>^人该阳离子交换树脂洗涤HCP,该第一次洗涤采用平衡緩冲液，该第二次洗涤采用洗脱緩冲液和水的混合物；(C)用该洗脱緩冲液从该阳离子交换树脂洗脱该抗体，以形成第一洗脱物；(d)将第一洗脱物进行病毒灭活步骤，其中病毒灭活是通过pH病毒灭活来实现，以形成病毒灭活制品；(e)将所得病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，其中在将该病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂前，将该病毒灭活制品的pH和电导率调整到与该阴离子交换树脂的pH和电导率基本相似，由此获得第一流通物；和(f)将第一流通物施加到疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；从而获得HCP降低的抗体制品。优选地，该抗体混合物在净皮施加到该阳离子交换树脂前未曾#皮施以A蛋白捕捉。优选地，洗脱緩冲液和水的混合物包含约40-50%洗脱緩冲液和约50-60°/。水，更优选约45%洗脱緩冲液和约55%水(例如WFI)。在一个优选的实施方案中，洗脱緩沖液包含20mM磷酸钠和150mM氯化钠。在这个情况中，其中含45%洗脱緩冲液和约55%水的洗脱緩冲液和水混合物，是9mM磷酸钠和68mM氯化钠。在一个优选的实施方案中，第一次洗涤是用包含20mM磷酸盐、25mM氯化钠的平衡緩冲液进行，第二次洗涤是用包含9mM磷酸盐、68mM氯化钠的緩冲液(45%洗脱緩冲液、55%水)进行，洗脱緩冲液包含20mM磷酸盐、150mM氯化钠。优选地，经HCPELISA测定，第一洗脱物包含的HCP比该混合物少约90至约100倍。优选地，经HCPELISA测定，第一流通物包含的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。优选地，经HCPELISA测定，第二洗脱物包含的HCP比第一流通物少约3至约5倍。在任何上述纯化方法的一个优选方面，HCP包含组织蛋白酶L酶原，由此获得组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品。优选地，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约25至约60RFU/s/mg抗体。优选地，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性为约0.4至约4RFU/s/mg抗体。优选地，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性为约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体。优选地，组织蛋白酶L酶原的水平有重现性地低下。在还另一方面，本发明涉及用以从包含抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，所述方法包括以下步骤(a)将该混合物施加到阳离子交换树脂，以获得第一洗脱物；(b)将第一洗脱物施加到阴离子交换树脂，以获得第一流通物；和(c)使第一流通物通过疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；从而获得HCP降低的抗体制品。优选地，包含抗体和至少一种HCP的该混合物在被施加到第一离子交换树脂前不被施以A蛋白捕捉。优选地，该方法还包括在将第一洗脱物施加到该阴离子交换树脂前，将第一洗脱物进行病毒灭活步骤。例如，病毒灭活可通过pH病毒灭活来实现。优选地，该阳离子交换树脂包含与磺酸基连接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物树脂(例如该阳离子交换树脂可以是FractogelS柱)。例如，FractogelS柱可用包含20mM磷酸钠、25mM氯化钠的平衡緩冲液平衡，可将该混合物施加到该柱，该柱可用平衡緩冲液至少洗涤一次，第一洗脱物可通过用包含20mM磷酸钠、150mM氯化钠的洗脱緩沖液洗脱来获得。优选地，阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶柱。例如，Q琼脂糖凝胶柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化钠(pH7.6)的平衡緩冲液平衡。优选地，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。例如，苯基琼脂糖凝胶柱可用包含20mM磷酸钠、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡緩冲液平衡，可将第一流通物施加到该柱，该柱可用平衡緩冲液至少洗涤一次，第二洗脱物可通过进行盐不连续梯度至11mM磷酸钠、0.62521M(NH4)2S04(pH7.0)来获得。优选地，pH病毒灭活是通过将第一洗脱物维持在pH3.5大约1小时来实现。在还另一方面，本发明涉及用以从包含阿达木单抗和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的混合物生产HCP降低的阿达木单抗制品的方法，所述方法包括以下步骤(a)将该混合物施加到阳离子交换树脂，其中该混合物在被施加到第一离子交换树脂前不被施以A蛋白捕捉，以获得第一洗脱物；，(b)将第一洗脱物施以pH病毒灭活，以获得病毒灭活制品；(c)将该病毒灭活制品施加到阴离子交换树脂，以获得第一流通物；和(d)使第一流通物通过疏水相互作用柱，由此获得第二洗脱物；从而获得HCP降低的阿达木单抗制品。优选地，该阳离子交换树脂是FractogelS柱，该阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶柱，该疏水相互作用柱是苯基琼脂糖凝胶柱。例如，FractogelS柱可用包含20mM磷酸钠、25mM氯化钠的平衡緩沖液平衡，可将该混合物施加到该柱，该柱可用平衡緩冲液至少洗涤一次，第一洗脱物可通过用包含20mM磷酸钠、150mM氯化钠的洗脱緩沖液洗脱来获得。还例如，Q琼脂糖凝胶柱可用包含25mM三乙醇胺、40mM氯化钠(pH7.6)的平衡緩冲液平衡。还例如，苯基琼脂糖凝胶柱可用包含20mM磷酸钠、1.1M(NH4)2S04(pH7)的平衡緩沖液平衡，可将第一流通物施加到该柱，该柱可用平衡緩冲液至少洗涤一次，第二洗脱物可通过进行盐不连续梯度至11mM磷酸钠、0.625M(NH4)2SO4(pH7.0)来获得。还例如，pH病毒灭活可通过将第一洗脱物维持在pH3.5大约1小时来实现。对于所有上述纯化方法，在本发明的一个优选实施方案中，该抗体是抗肿瘤坏死因子-a(TNFa)抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗TNPa抗体或其抗原结合部分是嵌合抗体、人源化抗体或多价抗体。在一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗(infliximab)或golimumab。在另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是人抗体。在一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它以1xl(T8M或以下的Kd和1xl(T3s"或以下的Koff速率常数(均用表面等离振子共振进行测定)乂AATNFa上解离下来，在标准的体外L929测定中以1x10_7M或以下的ICso中和人TNFa细胞毒性。在另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是具有以下特征的分离人抗体a)以1x1(^s"或以下的Koff速率常数从人TNFa上解离下来，该参数是由表面等离振子共振法测出；b)具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者从SEQIDNO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链CDR3结构域，该修饰是位置1、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换或者位置1、3、4、6、7、8和/或9处的一至五个保守氨基酸置换；c)具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者从SEQIDNO:4修饰而成的氨基酸序列的重链CDR3结构域，该修饰是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12处的一至五个保守氨基酸置换。在又另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它的轻链可变区(LCVR)包含SEQIDNO:1氨基酸序列，重链可变区(HCVR)包含SEQIDNO:2氨基酸序列。在还另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗。本发明提供用本发明的任何方法生产的、经HCPELISA测定基本上不含HCP的抗体制品。本发明还提供包含用本发明的任何方法生产的HCP降低的抗体制品和药物可接受载体的药物组合物。本发明包括包含HCP降低的抗体和药物可接受载体的药物组合物，其中经HCPELISA测定，HCP的水平不超过约70ngHCP/mg抗体。在一个实施方案中，经HCPELISA测定，HCP的水平不超过约13ngHCP/mg抗体。在另一个实施方案中，经HCPELISA测定，HCP的水平不超过约5ngHCP/mg抗体。本发明提供包含抗体的组合物，其中经HCPELISA测定，所述组合物没有可#全测水平的HCP。本发明还提供用本文描述的任何方法生产的、基本上不含组织蛋白酶L酶原的抗体制品。本发明还包括包含用本文描述的任何方法生产的组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品和药物可接受载体的药物组合物。本发明提供包含组织蛋白酶L酶原降低的抗体和药物可接受载体的药物组合物，其中组织蛋白酶L酶原的水平不超过约3.0RFU/s/mg抗体的组织蛋白酶活性。对于所有上述抗体制品和药物组合物，优选的该抗体是抗肿瘤坏死因子-a(TNFa)抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分选自人源化抗体、嵌合抗体或多价抗体的抗体。在一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是英夫利昔单抗或golimumab。在另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是人抗体。在一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它以1x10-8M或以下的Kd和1xl(T3s"或以下的K。ff速率常数(均用表面等离振子共振进行测定)从人TNFa上解离下来，在标准的体外L929测定中以1x10-7M或以下的IC5o中和人TNFa细胞毒性。在另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是具有以下特征的分离人抗体a)以lxl(T、"或以下的Koff速率常数从人TNFa上解离下来，这是由表面等离振子共振测出；b)具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者从SEQIDNO:3修饰24而成的氨基酸序列的轻链CDR3结构域，该修饰是位置1、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换或者位置1、3、4、6、7、8和/或9处的一至五个保守氨基酸置换；c)具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者从SEQIDNO:4修饰而成的氨基酸序列的重链CDR3结构域，该修饰是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12处的一至五个保守氨基酸置换。在又另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是这样的分离人抗体，它的轻链可变区(LCVR)包含SEQIDNO:1氨基酸序列，重链可变区(HCVR)包含SEQIDNO:2氨基酸序列。在还另一个实施方案中，抗TNFa抗体或其抗原结合部分是阿达木单抗。本发明包括治疗其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括将包含用本发明任何方法获得的抗体的药物组合物给予人受试者。在一个实施方案中，将该制剂长时间给予人受试者。在一个实施方案中，该长时间包括至少约3个月，至少约4个月或至少约5个月。在一个实施方案中，该其中TNFa活性有害的疾病选自自身免疫疾病、肠道疾病和皮肤疾病。在一个实施方案中，自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脊推炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化、牛皮癣关节炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素层炎、肾病综合征和青年期类风湿性关节炎。在另一个实施方案中，肠道疾病是节段性回肠炎。在又另一个实施方案中，皮肤疾病是牛皮癣。在一个实施方案中，将该药物组合物与另外的治疗剂进行组合给予。在一个实施方案中，该另外的治疗剂是曱氨喋呤。本发明包括治疗其中TNFa活性有害的疾病的方法，所述方法包括将包含用本发明任何方法获得的抗体的药物组合物给予人受试者。在一个实施方案中，将该制剂长时间给予人受试者。在一个实施方案中，该长时间包括至少约3个月，至少约4个月或至少约5个月。在一个实施方案中，该其中TNFa活性有害的疾病选自自身免疫疾病、肠道疾病和皮肤疾病。在一个实施方案中，自身免疫疾病选自类风湿性关节炎、类风湿性脊推炎、骨关节炎、痛风性关节炎、过敏症、多发性硬化、牛皮癣关节炎、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素层炎、肾病综合征和青年期类风湿性关节炎。在一个实施方案中，肠道疾病是节段性回肠炎。在一个实施方案中，皮肤疾病是牛皮癣。在一个实施方案中，将该药物组合物与另外的治疗剂进行组合给予。在一个实施方案中，该另外的治疗剂是曱氨喋呤。本发明提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品(articleofmanufacture),该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂(formulation)包含不超过约70ngHCP/mg阿达木单抗。在一个实施方案中，该约70ngHCP/mg阿达木单抗是通过HCPELISA来测量。本发明还提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品，该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂包含不超过约13ngHCP/mg阿达木单抗。在一个实施方案中，该约13ngHCP/mg阿达木单抗是通过HCPELISA来测量。本发明还提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品，该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂包含不超过约5ngHCP/mg阿达木单抗。在一个实施方案中，该约5ngHCP/mg阿达木单抗是通过HCPELISA来测量。本发明还提供包含包装材料、阿达木单抗和标签或包装插页的制造品，该标签或包装插页装在该包装材料当中，说明该阿达木单抗制剂包含的组织蛋白酶L酶原水平不超过约3.0RFU/s/mg阿达木单抗的组织蛋白酶L活性所指示的水平。在一个实施方案中，组织蛋白酶L活性是通过组织蛋白酶L动力学测定法来测量。本发明还提供用以测定衍自哺乳动物细胞表达系统的材料中组织蛋白酶L酶原的量的动力学测定法，该测定法包括使该衍自哺乳动物细胞表达系统的材料与酶接触，以将组织蛋白酶L酶原加工成活性组织蛋白酶L形式，由此获得组织蛋白酶L样品；将该组织蛋白酶L样品与组织蛋白酶L的底物接触；和测定该组织蛋白酶L样品中的组织蛋白酶L活性，作为该衍自哺乳动物细胞表达系统的材料中组织蛋白酶L酶原的量的指标。在一个实施方案中，该哺乳动物细胞表达系统是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在另一个实施方案中，该加工组织蛋白酶L酶原的酶是肽链内切酶。在又另一个实施方案中，该组织蛋白酶L的底物包含标记(label)。在又另一个实施方案中，该标记是荧光剂。在一个实施方案中，该荧光剂包含荧光7-氨基-4-曱基香豆素(AMC)基团。在一个实施方案中，该组织蛋白酶L的底物包含Z-亮氨酸-精氨酸。在又另一个实施方案中，该Z-亮氨酸-精氨酸包含AMC基团。附图简述图1A和1B显示了每个工艺的FractogelS层析步骤的典型洗脱曲线，包括本发明的工艺(图1A)和工艺A(图1B)。图2A和2B显示了Q琼脂糖凝胶FF层析步骤的流通物洗涤曲线的比较，包括本发明的工艺(图2A)和工艺A(图2B)。图3A和3B显示了苯基琼脂糖凝胶HP层析步骤的洗脱曲线的比较，包括工艺B(图3A)和工艺A(图3B)。图4图示了平均工艺B(菱形)和平均工艺A(正方形)的组织蛋白酶L酶原逐步降低。图5图示了平均工艺B(菱形)和工艺A(正方形)的HCP逐步降^f氐。图6显示出活化的工艺中(in-process)样品的动力学读数指示了反应时间与荧光信号的线性关系。发明详述I.定义为了更容易地理解本发明，首先对某些术语进行定义。本文所用的术语"混合物"指待进行纯化的有粘度材料，该材料中包含有待从可能也存在于其中的其他物质中纯化出来的至少一种目的抗体。材料可以是例如水溶液、有机溶剂体系或者水/有机溶剂混合物或溶液。混合物往往是包含许多生物分子(如蛋白质、抗体、激素和病毒)、小分子(如盐、糖、脂质等)甚至颗粒状物质的复杂混合物或溶液。虽然生物来源的典型混合物可能一开始是水溶液或水悬浮液，但它也可能含有在较早的分离步骤如溶剂沉淀、提取等中使用到的有机溶剂。可能含有易于通过本发明各个实施方案进行纯化的有价值生物物质的混合物的实例，包括但不限于生物反应器的培养物上清液、均化后的细胞悬浮液、血浆、血浆级^f分和奶。所谓从包含抗体和一种或多种物质的混合物中"纯化"该抗体，是指通过将至少一种物质从该混合物中(完全或部分)除去来增加该抗体在该混合物中的纯度。该物质可以是杂质或污染物，如但不限于宿主细胞蛋白质(HCP)。术语"宿主细胞蛋白质"或"HCP"指该混合物中的、与目的抗体不同但通常发源于抗体生产的蛋白质。宜将HCP排除出最终抗体制品。术语"降低(的)(reduced)"指减少或缩d、物质的数量。降低的制品包括与初始数量相比具有较少的某物质如HCP或组织蛋白酶L酶原的制品。在一个实施方案中，该物质是杂质或污染物。在一个实施方案中，术语"降低(的)"是指该物质显著少(substantiallyless)。在另一个实施方案中，术语"降低(的)"是指没有该物质。在一个实施方案中，没有某物质包括用本文描述的测定法得出"没有可检测的量"。术语"基本上没有"包括没有某物质，但也可包括有极微量的某物质。在一个实施方案中，没有某物质的数量包括用本文描述的测定法得出"没有可检测的量"。术语"宿主细胞蛋白质(HCP)降低的"指这样的组合物(包括^f旦不限于洗脱物、制品、流通物)，其在一个或多个纯化步骤后包含抗体和减少或缩小数量的HCP。在一个实施方案中，术语"HCP降低的"是指在包含抗体的组合物中HCP显著少。在另一个实施方案中，术语"HCP降低的，，是指在包含抗体的组合物中没有HCP。在一个实施方案中，术语"HCP降低的"是指经本文描述的测定法测定，在包含抗体的组合物中没有可检测量的HCP。术语"组织蛋白酶L酶原降低的"指这样的组合物(包括但不限于洗脱物、制品、流通物)，其在一个或多个纯化步骤后包含抗体和减少或缩小数量的组织蛋白酶L酶原。在一个实施方案中，术语"组织蛋白酶L酶原降低的"是指在包含抗体的组合物中HCP显著少。在另一个实施方案中，术语"组织蛋白酶L酶原降低的"是指在包含抗体的组合物中没有HCP。在一个实施方案中，术语"组织蛋白酶L酶原降低的"是指经本文描述的测定法测定，在包含抗体的组合物中没有可检测量的组织蛋白酶L酶原。术语"有重现性地低下"指一贯地实现减少或缩小的数量的能力，如至少80%的时间、更优选至少90°/。的时间、更优选至少95%的时间、甚至更优选至少98%的时间实现减少或缩小的数量的能力。术语"离子交换分离步骤"指这样的步骤，在该步骤中，根据目的抗体和不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)分别与带电材料的离子相互作用的差异，将该不需要的物质或杂质与该目的抗体分离开来。离子交换分离步骤的实例包括但不限于离子交换层析，包括阴离子交换层析和阳离子交换层析。"离子交换材料"指作为将该不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)与该抗体进行分离的基础来使用的离子材料。离子交换材料的实例包括阴离子树脂和阳离子树脂。"阳离子交换材料"指这样的离子交换材料，它具有共价结合的带负电的配体，并因此具有游离阳离子可供与它所接触到的溶液中的阳离子进行交换。有多种阳离子交换树脂为本领域所公知，例如其中共价结合基团是羧酸根或磺酸根的那些阳离子交换树脂。市售的阳离子交换树脂包括CMC-纤维素、SP-SephadexTM和FastS-SepharoseTM(后两者为Pharmacia市售)。"阴离子交换材料"指具有共价结合的带正电基团如季氨基基团的离子交换树脂。市售的阴离子交换树脂包括DEAE纤维素、TMAE、QAESephadexTM和FastQ球脂糖凝股tm(后两者为Pharmacia市售)。所谓将某分子"结合"到离子交换材料，是指将该分子在适当的条件(pH/电导率)下暴露于该离子交换材料，该适当的条件会使得该分子借助其与该离子交换材料的(一个或多个)带电基团之间的离子相互作用可逆地固定化在该离子交换材料之中或之上。术语"疏水相互作用步骤"指这样的步骤，在该步骤中，根据目的抗体和不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)分别与疏水材料的疏水相互作用的差异，将该不需要的物质或杂质与该目的抗体分离开来。"疏水相互作用材料"指作为将该不需要的物质或杂质(例如HCP或组织蛋白酶L酶原)与该抗体进行分离的基础来使用的疏水材料。疏水相互作用材料的实例包括疏水配体，如具有约2至约8个碳原子的烷基基团，或者芳基基团如苯基。术语"洗涤"或"洗涤步骤，，包括使适当的緩沖液从给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)之中或之上流过。术语"多个洗涤步骤"包括超过一个的接连洗涤步骤。接连的緩冲液可具有不同的特性如pH、电导率、溶剂浓度等，这些特性是设计来将各种类型的与给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)非特异性締合的杂质进行解离和除去。在一个实施方案中，该多个洗涤步骤包括中间洗涤，该中间洗涤还包含约40-50°/。洗脱緩冲液。所谓将某分子(例如抗体或污染物质)从某材料中"洗脱"下来，是指通过改变该材料周围的緩沖液从而降低该分子与该材料的相互作用，来将该分子从该材料除去。在一个实施方案中，将抗体从离子交换柱上洗脱下来，其中緩冲液与该抗体竟争该离子交换材料上的带电30位点。术语"洗脱物"指这样的包含分子(例如抗体或污染物质)的液体，它是在使目的抗体与层析材料结合并加入洗脱緩冲液来解离该抗体后获得的。洗脱物可针对纯化过程中的步骤来说明。例如，术语"第一洗脱物"指第一层析步骤的洗脱物，术语"第二洗脱物"指第二层^"步骤的洗脱物，依此类4偉。术语"流通物"指这样的包含分子(例如抗体或污染物质)的液体，它是通过使包含该分子的混合物通过层析材料以使该分子通过该材料而不发生结合来获得的。"緩冲液"指这样的物质，由于它在溶液中的存在，使得为引起单位pH变化所必需加入的酸或碱的数量要增加。緩冲溶液是通过其酸-碱共辄物成分的作用来抵抗pH变化的。用于生物试剂的緩冲溶液通常能够维持恒定浓度的氢离子，4吏得溶液的pH在生理范围内。传统的緩冲成分包括但不限于有机和无机的盐、酸和碱。示例性的用于纯化生物分子(例如抗体)的緩冲液，包括两性离子緩沖液或"Good"緩冲液，参见例如Goodetal.(1966)所oc/zew/s吵5:467和GoodandIzawa(1972)MeAoA五"^ywo/.24:62。示例性的緩冲液包括但不限于TES、MES、PIPES、HEPES、MOPS、MOPSO、TRIC腿和BIC躍。本文所用的"洗涤緩冲液"在本文中均指用以从结合有抗体的给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)带走杂质的物质。"洗脱緩冲液"指用以将抗体从经一种或多种洗涤物质洗涤过的给定材料(例如离子交换材料或疏水相互作用材料)解离下来的物质。洗脱緩冲液起到解离抗体的作用。典型的洗脱物质是本领域公知的，它们可具有较高浓度的盐、游离亲和配体或类似物或者其他能促进靶物质(例如抗体)从给定材料的解离的物质。洗脱緩冲液的电导率和/或pH使得该抗体从该离子交换材料或疏7K相互作用材料洗脱下来。术语"电导率"指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流是通过离子运输而流动。因此，水溶液中存在越多的离子，31溶液就会有越高的电导率。电导率的测量单位是mmhos(mS/cm)，可用例如Orion出售的电导率仪进行测量。溶液的电导率可通过改变其中的离子浓度来改变。例如，可改变溶液中的緩冲剂的浓度和/或盐(e.g.NaCl或KC1)的浓度，以达到所需的电导率。在一个实施方案中，对层析中所用的洗涤緩沖液或任何其他水溶液的盐浓度进行改变，以达到缩小的电导率。多肽如抗体的"pl"或"等电点"指该多肽的正电荷与其负电荷平衡时的pH，可从该多肽的氨基酸残基的净电荷来计算，或者可通过等电聚焦来测定。术语"病毒灭活，，包括使混合物中所含的病毒失去功能，或者将病毒从待纯化的混合物中除去。该病毒可发源于抗体生产、下游加工步骤或制造环境。使病毒失去功能或除去病毒的方法包括热灭活、pH灭活、化学灭活剂等。术语"pH病毒灭活，，包括使病毒经受某足以使它失去功能的pH。本文所用的术语"人TNFa"(本文缩写为hTNFa,或简称hTNF)，意指以17kD分泌形式和26kD膜締合形式存在的人细胞因子，其生物活性形式由非共价结合的17kD分子的三聚体构成。hTNFa的结构在例如Pennica，D.等，(1984)Nature312:724-729;Davis,J.M.等，(1987)Biochemisty26:1322-1326和Jones，E,Y.等，(1989)Nature338:225-228中有进一步的描述。术语人TNFa意在包括重组人TNFa(rhTNFa)，其能通过标准重组表达方法来制备或者能商业购得(R&DSystems,CatalogNo,210画TA，Minneapolis,MN)。TNFot也《尔作TNF。本文所用的术语"抗体"意指由四个多肽链即两个重链(H)和两个轻链(L)通过二硫键相互连接构成的免疫球蛋白分子。每条重链由重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由CH1、CH2和CH3三个结构域构成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域CL构成。VH区和VL区可以进一步细分为称作互补决定区(CDR)的高变区，这些高变区被称作构架区(FR)的更为保守的区所中断。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本发明的抗体在美国专利6,090,382、6,258,562和6,509,015中有进一步详细描述，每个专利通过引用整体结合到本文中。在一个实施方案中，本发明的抗体是能干扰TNFa活性的抗TNFa抗体。抗TNFa抗体的实例包括但不限于抗TNFa人抗体和本文描述的抗体部分，以及美国专利6,090,382、6,258,562和6,509,015和美国专利申请系列号09/801185和10/302356中描述的那些抗体和抗体部分，每个专利和专利申请通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，用于本发明的TNFa抑制剂是抗TNPa抗体或其片段，包括英夫利昔单抗(Remicade⑧，JohnsonandJohnson;在美国专利5,656,272中描述，该专利通过引用结合到本文中)、CDP571(人源化的单克隆抗TNFa抗体片段)、抗TNFdAb(Peptech)、CNTO148(golimumab;MedarexandCentocor)、WO02/12502中描述的抗体，和阿达木单抗(Humira⑧AbbottLaboratories,一种人抗TNFmAb,在US6,090,382中描述为D2E7)。可用于本发明的另外的抗体或其片段描述于美国专利6,593,458、6,498,237、6,451,983和6,448,380,每个专利通过引用结合到本文中。该术语包括"目的抗体"，是作为本发明方法的目标的抗体。本文所用的术语抗体的"抗原结合部分"(或简称"抗体部分")，指抗体的一个或几个保留与抗原(例如hTNPot)特异性结合的能力的片段。已经证明抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段来实现。抗体的"抗原结合部分"这个术语所涵盖的结合片段的例子包括(i)Fab片段，是由VL、VH、CL和CH1结构域构成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，是由两个Fab片段通过铰链区的二硫键连接而构成的二价片段；(iii)由VH和CHI结构域构成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature341:544-546)，由VH结构域构成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因所编码，但是可使用重组方法通过合成的接头将它们连接起来，所述接头使得它们变成为单一的蛋白质链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv);参见例如Bird等(1988)Science242:423-426和Huston等(1988)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这样的单链抗体也要被涵盖在抗体的"抗原-结合部分"这个术语中。其他形式的单链抗体如双抗体(diabody)也涵盖在内。双抗体是二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但是所使用的接头短得不能让同一链上的这两个结构域之间发生配对，从而迫使这两个结构域与另一条链的互补结构域发生配对，产生两个抗原结合位点(参见例如Holliger,P.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J.等，(1994)Structure2:1121-1123)。本发明的抗体部分在美国专利6,090,382、6,258,562和6,509,015中有进一步的详细描述，每个专利通过引用结合到本文中。结合片段是通过重组DNA技术来生产，或者通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fabc、Fv、单链和单链抗体。与"双特异性"或"双功能，，免疫球蛋白或抗体不同，免疫球蛋白或抗体祐Li人为其每个结合位点是相同的。"双特异性"或"双功能抗体"是人造杂合抗体，具有两个不同的重链/轻链对和两个不同的结合位点。双特异性抗体可通过多种方法来制备，包括杂交瘤的融合或Fab'片l殳的连4妄。参见例如Songsivilai&Lachmann,Clin.Exp.Immunol.79:315-321(1990);Kostelny等，J.Immunol.148，1547-1553(1992)。本文所用的"保守的氨基酸置换"是其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基所置换的置换作用。本领域已经确定了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性側链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，P-分支側链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。"嵌合抗体"指这样的抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与衍自特定物种或属于特定类别的抗体中的相应序列同源，而所述链的其余区段与另一物种的相应序列同源。在一个实施方案中，本发明涉及这样的嵌合抗体或抗原结合片段，其中轻链和重链的可变区都模拟衍自一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定区则与衍自另一种物种的抗体中的序列同源。在本发明的一个优选实施方案中，嵌合抗体是通过将小鼠抗体的CDR嫁接到人抗体的构架区上而制备的。"人源化抗体"指包含至少一条这样的链的抗体，该链包含基本上来自人抗体链(称为受体方免疫球蛋白或抗体)的可变区构架残基和至少一个基本上来自非人抗体(例如小鼠)的互补决定区(CDR)。除了CDR的嫁接外，人源化抗体通常进行进一步的改造以改进亲和力和/或免疫原性。术语"多价抗体"指包含超过一个抗原识别位点的抗体。例如，"二价，，抗体具有两个抗原识别位点，而"四价，，抗体具有四个抗原识别位点。术语"单特异性"、"双特异性"、"三特异性"、"四特异性，，等指多价抗体中存在的不同抗原识别位点特异性的数量(与抗原识别位点的数量相对)。例如，"单特异性"抗体的抗原识别位点都结合相同的表位。"双特异性"或"二元特异性，，抗体具有至少一个结合第一表位的抗原识别位点，和至少一个结合不同于第一表位的第二表位的抗原识别位点。"多价单特异性"抗体具有都结合相同的表位的多个抗原识别位点。"多价双特异性"抗体具有多个抗原识别位点，其中一些结合第一表位，另一些结合不同于第一表位的第二表位。本文所用的术语"人抗体，，意在包括具有衍自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变引入的突变或者通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本文所用的术语"人抗体"不意在包括其中衍自另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已被嫁接到人构架序列上的抗体。本文所用的术语"重组人抗体"意在包括所有通过重组方法制备、表达、产生或分离的人抗体，例如使用转染到宿主中的重组表达载体表达的抗体(下文进一步描述)，从重组、组合人抗体文库分离的抗体(下文进一步描述)，从转人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如Taylor,L.D.等，(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287),或者通过涉及到将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他方法来制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有衍自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。但是在某些实施方案中，将这种人抗体进行体外诱变(或者当使用转人Ig序列的转基因动物时，进行体内体细胞诱变)，因此重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，它们虽然衍自人种系VH和VL序列或与之有关，但可能不天然存在于体内人抗体种系库(antibodygermlinerepertoire)当中。这种嵌合的、人源化的、人的和二元特异性的抗体可通过本领域公知的重组DNA技术生产，例如使用以下专利和文献中描述的方法来生产PCT国际申请PCT/US86/02269;欧洲专利申请184,187;欧洲专利申请171,496;欧洲专利申请173,494;PCT国际公开WO86/01533;美国专利4,816,567;欧洲专利申请125,023;Betteretal(1988)Science240:1041-1043;Liuetal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sd.USA84:3439-3443;Liuetal.(1987)J.Immunol139:3521-3526;Sunetal.(1987)Proc.Natl.Acad.ScLUSA84:214-218;Nishimuraetal.(1987)CancerRes.47:999-1005;Woodetal.(1985)Nature314:446-449;Shawetal.(1988)J.Natl.CancerInst.80:1553-1559);Morrison(1985)Science36229:1202-1207;Oietal.(1986)BioTechniques4:214;美国专利5,225,539;Jonesetal.(1986)Nature321:552-525;Verhoeyanetal.(1988)Science239:1534;和Beidleretal.(1988)J.Immunol.141:4053-4060，Queenetal.，Proc.Natl.Acad.Sd.USA86:10029-10033(1989),US5,530,101、US5,585,089、US5,693,761、US5,693,762、Selicketal，WO90/07861和Winter,US5，225，539。本文所用的"分离抗体"意指基本上脱除了具有不同的抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合hTNFa的分离抗体基本上脱除了特异性结合hTNFa之外的抗原的抗体)。但是，特异性结合hTNFa的分离抗体可能与其他抗原有交叉反应性，例如与来自其他物种的TNFa分子(下面进一步详细讨论)。此外，分离抗体可以基本上脱除了其他细胞材料和/或化学品。本文所用的"中和抗体"(或者"中和hTNFa活性的抗体")意指其与hTNFa的结合导致hTNFa的生物活性被抑制的抗体。这一对hTNFa的生物活性的抑制，可通过测量hTNFa生物活性的一个或几个指标来评价，所述指标例如hTNFa诱导的细胞毒性(体外或体内)、hTNFa诸导的细胞激活和hTNFa与hTNFa受体的结合。这些hTNFa生物活性的指标可通过本领域公知的几个标准体外或体内测定中的一个或几个来评价(参见美国专利6,090,382)。优选地，通过对L929细胞的hTNFa诱导细胞毒性的抑制，来评价抗体中和hTNFa活性的能力。作为hTNFa活性的附加的或另选的参数，可评价抗体抑制ELAM-1在HUVEC上的hTNFa诱导表达的能力，作为hTNFa诱导细胞激活的一个量度。本文所用的术语"表面等离振子共振"指这样的光学现象，该现象4吏得可以例如寸吏用BIAcore系统(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,Sweden和Piscataway，NJ)对生物传感器矩阵当中的蛋白质浓度的变化进行检测，从而对实时生物特异性相互作用进行分析。更多的描述参见美国专利6,258,562的实施例1和Jonsson等(1993)Ann.Biol.Clin.3751:19;J&isson等,(1991)Biotechniques11:620-627;Johnsson等(1995)J.Mol.Recognit.8:125和Johnnson等(1991)Anal.Biochem.198:268。本文所用的术语"Koff"意指抗体从抗体/抗原复合体解离的离开(Off)速度常数。本文所用的术语"Kd"意指特定抗体-抗原相互作用的解离常数。本文所用的术语"IC50"意指抑制生物学目的终点(如中和细胞毒性活性)所需的抑制剂的浓度。本文所用的术语"核酸分子"意在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但是优选双链DNA。本文针对编码能结合hTNFoc的抗体或抗体部分(例如VH、VL、CDR3)的核酸所使用的术语"分离核酸分子"，意指这样的核酸分子，其中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列脱除了编码能结合hTNFot之外的抗原的抗体或抗体部分的其他核苷酸序列，该其他序列可天然地位于人基因组DNA中的核酸的侧翼。因此例如，本发明的编码抗hTNFa抗体的VH区的分离核酸，不含有编码能与hTNFa之外的抗原结合的其他VH区的其他序列。本文所用的术语"载体"意指能转运其所连接的另一个核酸的核酸分子。一种类型的载体是"质粒"，指的是其中可以连接上另外的区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以被连接到病毒基因组中。某些载体在其被引入的宿主细胞中能自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时能被整合到宿主细胞的基因组中，从而随宿主基因组被复制。此外，某些载体能指导其所操作性连接的基因的表达。这样的载体在本文称作"重组表达载体"(或者简称"表达载体")。一般情况下，适用于重组DNA技术的表达载体经常是质粒的形式。在本说明书中，"质粒"和"载体，，可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。但是，本发明意在包括能起着同等功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。本文所用的术语"重组宿主细胞"(或者简称"宿主细胞")，意指其中导入重组表达载体的细胞。应认识到，这些术语意在不仅指特定的受试者细胞，而且还指这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响而在后续世代中可能发生某些修饰，事实上这样的后代可能与亲代细胞不同，但是仍然包括在本文所用的术语"宿主细胞"的范围内。本文所用的术语"药盒"指包含各成分的包装产品或制造品。药盒优选包括盛有药盒的各成分的盒子或容器。盒子或容器中附加有标签或食品和药物管理部的批准方案。盒子或容器装有本发明的各成分，优选装在塑料、聚乙烯、聚丙烯、乙烯或丙烯容器中。容器可以是带盖子的管或瓶。药盒还可以包括施用本发明的TNFct抗体的说明书。在一个实施方案中，本发明的药盒包括包含有如PCT/IB03/04502和美国申请第10/222140号所述的人抗体D2E7的制剂。本文进一步描述本发明的各个方面。IL抗体生产本发明提供从包含抗体和一种或多者HCP的混合物中纯化该抗体的方法。初始混合物通常是由抗体的重组生产得到的混合物。或者，初始混合物可得自通过肽合成(或其他合成方法)进行的抗体生产，或者该抗体可从其天然来源纯化。为表达本发明的抗体或抗体部分，将编码部分或全长轻链或重链的DNA插入到表达载体中，使得基因被操作性连接到转录和翻译控制序列。在这个情形中，术语"操作性连接"指的是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列能发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择表达载体和表达控制序列使之与所用的表达宿主细胞相容。抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入单独的载体中，或者更典型的是两种基因都插入同一个表达载体中。抗体基因通过标准的方法插入到表达载体中(如将抗体基因片段上的互补限制性酶切位点与载体相连"l妄，或者如果没有限制性酶切位点，则进4亍钝末端连接)。在插入抗体或抗体相关轻链或重链序列之前，表达载体可能已经携带有抗体恒定区序列。例如，一种将阿达木单抗或阿达木单抗相关VH序列和VL序列转变成全长抗体基因的方法，就是将它们分别插入到已编码重链恒定区的表达载体和已编码轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段操作性连接到载体当中的CH区段，而VL区段操作性连接到载体当中的CL区段。另外，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞中分泌出来的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合读框地连接到(linkedin-frameto)抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽，也可以是异源信号肽(即非免疫球蛋白的信号肽)。除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带能调控抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语"调节序列"意指包括能控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子以及别的表达控制元件(如多聚腺苷酸信号)。这些调节序列在例如Goeddel;GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中有描述。本领域技术人员会认识到，表达载体的设计，包括调节序列的选择，要取决于诸如所选择转化的宿主细胞、所需蛋白的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列，包括能指导蛋白在哺乳动物细胞中的高水平表达的病毒元件，如衍自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤病毒的启动子和/或增强子。有关病毒调节元件及其序列的进一步介绍参看例如Stinski的美国专利5,168,062，Bell等的美国专利4,510,245以及Schaffiiet等的美国专利4,968,615。除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可携带别的序列，如能调节载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)以及选择性标记基因。选择性标记基因有助于挑选出其中已导入载体的宿主细胞(参看美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017,这三个专利都是Axel等人的)。例如，通常选择性标记基因能给其中已导入了载体的宿主赋予对药物如G418、潮霉素或氨曱蝶呤的抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于氨曱蝶呤选择/扩增)和neo基因(进行G418选择)。为了表达轻链和重链，用标准技术将编码重链和轻链的表达载体转入宿主细胞中。不同形式的术语"转染"意在涵盖多种常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管从理论上说，本发明的抗体可以在原核或真核宿主细胞中表达，但最优选的是在真核细胞、最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，真核细胞尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠并具有免疫活性的抗体。抗体基因在原核细胞中的表达据报道不能有效地高产率生产活性抗体(Boss,M.A和Wood,C.R(1985)，ImmunologyToday6:12-13)。适用于克隆和表达本文所述载体中的DNA的宿主细胞，是原核生物细胞、酵母细胞或上述的高等真核生物细胞。适用于此目的的原核生物包括真细菌如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌，例如肠杆菌科细菌如埃希氏菌属细菌(例如大肠杆菌)、肠杆菌属细菌、欧文氏菌属细菌、克雷伯氏菌属细菌、变形菌(Proteus)属细菌、沙门氏菌属细菌(例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium))、沙雷氏菌属细菌(例如Serratiamarcescans)和志贺氏菌属细菌以及芽孢杆菌属细菌(如B.subtilis和B.licheniformis(例如1989年4月12日公布的DD266,710中所公开的B.licheniformis41P)、假单胞杆菌属细菌(如P,aeruginosa),和链霉菌。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是E.coli294(ATCC31,446)，不过其他的菌抹E.coliB、E.coliXI776(ATCC31,537)和E.coliW3110(ATCC27,325)如也适合。这些实例是说明性的而非限制性的。除了原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适用于多肽编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)或者说普通面包酵母是低等真核宿主微生物当中最常用的。但是，有多种其他的属、种和抹是易于得到并可用于本发明的，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe);克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主,例如K.lactis、K.fragilis(ATCC12,424)、K.bulgaricus(ATCC16,045)、K.wickeramii(ATCC24,178)、K.waltii(ATCC56,500)、K.drosophilarum(ATCC36,906)、K.thermotolerans和K.marxianus;亚罗酵母属(yarrowia)(EP402,226);巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP183,070);假丝酵母属(Candida);Trichoderraareesia(EP244,234);Neurospomcrassa;许旺酵母属(Schwanniomyces)如Schwanniomycesoccidentalis,和丝状真菌如脉孢菌属(Neurospora)、青霉菌属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉属(Aspergillus)宿主如A.nidulans和A.niger。适用于表达糖基化抗体的宿主细胞衍自多细胞生物。无脊推动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。在诸如草地贪夜蛾(Spodopterafmgiperda)(毛虫)、》矣及J赶虫文(Aedesaegypti)(虫文子)、白纟丈j尹蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果绳(Drosophilamelanogaster)(果錄)和家蚕(Bombyxmori)的宿主中，已鉴定出多种杆状病毒毒林和变体及相应的允许(permissive)昆虫宿主细胞。有多种转染用病毒抹可公开获得，例如苜蓿银紋夜蛾(Autographacalifornica)NPV的L-I抹和家蚕(Bombyxmori)NPV的Bm-5株，这种病毒可用作本发明的病毒，特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、西红柿和烟草的植物细胞培养物也可用作宿主。■优选用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，在UrlaubandChasin，(1980)PNASUSA77:4216-4220中描述，与例如KaufmanandSharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中描述的DHFR选4奪性标记一起4吏用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被导入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一段时间来生产抗体，该段时间足以使抗体得以在宿主细胞中表达，或者更优选地使抗体得以分泌到宿主细胞生长的培养基中。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例有被SV40(COS-7，ATCCCRL1651)转化的猴肾CV1细胞系；人胚胎肾细胞系(被亚克隆以在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Grahametal"J,GenVirol.36:59(1977》;幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCCCCL10);中国仓鼠卵巢细胞ADHFR(CHO,Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠Sertoli细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CVlATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);布法罗大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138，ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8065);小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT060562，ATCCCCL51);TRI细胞(Matheretal"AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982));MRC5细胞；FS4细胞和人肝癌细胞系(HepG2)。用上述抗体生产用的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将宿主细胞在经适当改进而可诱导启动子、选择转化子或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中进行培养。用来生产抗体的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham'sFIO(Sigma)、极限必需培养基((MEM),(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改进分Eagle培养基((DMEM),Sigma)适用于培养宿主细胞。另外，在以下文献和专利中描述的任何培养基都可用作宿主系的培养基Hametal.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnesetal.,Anal.Biochem.102:255(1980),美国专利4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195或美国专利Re.30,985。任何这些培养基都可按需补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素药物)、痕量元素(定义为通常以毫摩尔级的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等价的能源。任何其他必需的补充物也可按本领域技术人员会知道的适当浓度加入。培养条件如温度、pH等是之前用于选定进行表达的宿主细胞的那些条件，它们是普通技术人员显而易见的。宿主细胞也可用来产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。应认识到，上述方法的修改方案也在本发明的范围之内。例如，可能宜用编码本发明抗体的轻链或重链(但不是同时编码两者)的DNA来转染宿主细胞。也可利用重组DNA技术，来去掉编码轻链或重链或两者的DNA中对结合hTNFa没有必要的一些部分或全部。从这种截短的DNA分子表达的分子也涵盖在本发明的抗体范围之内。此外，可通过标准的化学交联方法将本发明的抗体与另一抗体交联，来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链属本发明的抗体，而另外一条重链和轻链对hTNFa之外的抗原有特异性。在一个优选的进行本发明抗体或其抗原结合部分的重组表达的系统中，通过磷酸4丐介导转染将编码抗体重链和轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞中。在这个重组表达载体当中，抗体重链和轻链各自操作性连接到CMV增强子/AdMLP启动子调节元件，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带有DHFR基因，该基因使得可以采用氨甲蝶呤选择/扩增来选出转染了载体的CHO细胞。将选出的转化宿主细胞进行培养，以使抗体重链和轻链得以表达，而后从培养基中回收完整抗体。用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。本文公开的本发明重组人抗体，包括阿达木单抗或其抗原结合部分，或者阿达木单抗相关抗体，可以通过筛选用人VL和VHcDNA制备的重组组合抗体文库(优选scFv噬菌体展示文库)进行分离，该人VL和VHcDNA是从衍自人淋巴细胞的mRNA制备的。制备和筛选44这样的文库的方法是本领域众所周知的。除了市售的用以产生噬菌体展示文库的试剂盒(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01;和StratageneSw/^Z4尸TM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)外，特别适用于产生和篩选抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于例如Ladner"美国专利5,223,409;Kang"a/.PCT公开说明书WO92/18619;Dowerda/.PCT公开说明书WO91/17271;WinterdPCT公开说明书WO92/20791;Markland"a/.PCT公开说明书WO92/15679;Breitling"PCT公开说明书WO93/01288;McCaffertyWPCT公开说明书WO92/01047;GarrardWa/.PCT公开说明书WO92/09690;Fuchsda/.(1991)所o/Tec/wo/ogy2:1370-1372;Hay"a/.(1992)//wm^w"6od//j^Wcfowos2:81-85;Huseda/.(1989)5"c/e腳,:1275-1281;McCafferty""/.,淑騰(19卯)M§:552-554;Griffiths"a/.(1993)/1^:725-734;Hawkinsda/.(1992)/Afo/5/o/，:889-896;Clacksonda/.(1991)Atowre巡:624画628;Gram"a/.(1992)iWAS巡:3576画3580;Garrard"a/.(1991)所o/7W7"o/，2:1373-1377;Hoogenbooma/.(1991)爿cW12:4133-4137;和Barbas"a/.(1991)/WJS巡:7978-7982。当使用重组技术时，抗体可胞内产生，在周质间隙，或者可直4妄分泌到培养基中。如果抗体是胞内产生，作为第一个步骤，将颗粒碎片例如通过离心或超滤除去，该颗粒碎片可以是宿主细胞或裂解细胞(例如来自均化操作)。在抗体被分泌到培养基的情况中，通常首先用市售的蛋白质浓缩滤器如Amicon或MilliporePellicon超滤组件，将得自这种表达系统的上清液进行浓缩。在进行本发明方法之前，从细胞碎片纯化抗体的程序最初决定于抗体的表达位点。可以使一些抗体直接从细胞分泌到周围生长培养基中；其他抗体则是胞内产生。对于后一类抗体，纯化方法的第一个步骤涉及到裂解细胞，这可通过多种方法来进行，包括机械剪切、渗透冲击或酶法处理。这种破坏作用会使细胞的全部内容物释放到匀浆(homogenate)中，另外还会产生因尺寸小而难以除去的亚细胞碎片。这些通常是通过差速离心或通过过滤来除去。在抗体不分泌到培养基的情况中，通常首先用市售的蛋白质浓缩滤器如Amicon或MilliporePellicon超滤组件，将得自这种表达系统的上清液进行浓缩。在抗体被分泌到培养基的情况中，也可例如通过切向流过滤将重组宿主细胞从细胞培养基中分离出来。还可进一步使用本发明的抗体纯化方法，从培养基中回收抗体。在一个实施方案中，本发明的方法包括能以高亲和力和低离开速率(offrate)结合人TNFa、且具有高中和能力的人抗体或其抗原结合部分。优选地，人抗体是重组中和性人抗hTNFa抗体。最优选用于本发明方法的重组中和性抗体在本文中称为阿达木单抗、Humira⑧和D2E7(D2E7VL区的氨基断列如SEQIDNO:1所示；D2E7VH的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示)。D2E7(阿达木单抗；Humira③)的特性在Salfeld等的美国专利6，090，382、6,258,562和6，509，015中已有描述，这三个专利通过引用结合到本文中。抗TNFa抗体的其他实例包括已进行了有关类风湿性关节炎治疗的临床试验的嵌合和人源化的鼠抗hTNFa抗体(参见例如ElliottWa/.(1994)M4:l125-1127;Elliot"a/.(1994)2^4:1105-1110;Rankin"a/.(1995)/i//eMwato/.M:334-342)。在另一个实施方案中，用于本发明的抗TNFa抗体是英夫利昔单抗(Remicade,JohnsonandJohnson;描述于美国专利5,656,272(通过引用结合到本文中))、CDPWl(人源化单克隆抗TNF-alphaIgG4抗体)、CDP870(人源化单克隆抗TNF-alpha抗体片l殳)、抗TNFdAb(Peptech)和CNTO148(golimumab;MedarexandCentocor,另参见WO02/12502)。在一个实施方案中，本发明的方法包括阿达木单抗抗体和抗体部分、阿达木单抗相关抗体和抗体部分以及具有与阿达木单抗同等特性的其他人抗体和抗体部分，所述特性如以低解离动力学高亲和力结合hTNFa和高中和能力。在一个实施方案中，本发明提供用这样的分离人抗体或其抗原结合部分进行的治疗，该分离人抗体或其抗原结合部分以1x10-SM或更低的Kd和1x10-3s-l或更低的Koff速率常数从人TNFa解离下来(这两个参数均用表面等离振子共振法测定)，且在体外L929测定中能以1x10_7M或更低的IC50中和人TNFa细胞毒性。更优选地，该分离人抗体或其抗原结合部分以5x10-4s-l或更j氐的Koff、更优选1x10_4s-l或更低的K0ff从人TNFa解离下来。更优选地，该分离人抗体或其抗原结合部分在体外L929测定中，以lx10-8m或更低的ic50、甚至更优选以1x10-9m或更低的IC50、还更优选以1x10-10M或更低的IC50中和人TNFa细胞毒性。在一个优选的实施方案中，抗体是分离的人重组抗体或其抗原结合部分。本领域公知，抗体重链和轻链CDR3结构域在抗体对抗原的结合特异性/亲和力中起到重要的作用。因此，在另一个方面，本发明涉及其中该抗体与hTNFa締合的解离动力学緩慢，且他们所具有的轻链和阿达木单抗VLCDR3的位置9可被Ala或Thr占据而基本上不影响K。ff。因此，阿达木单抗VLCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列Q國R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A)(SEQIDNO:3)。另外，阿达木单抗VHCDR3的位置12可被Tyr或Asn占据而基本上不影响K0ff。因此，阿达木单抗VHCDR3的共有基序包含以下氨基酸序列V-S-Y-L-S-T-A-S曙S-L-D-(Y/N)(SEQIDNO:4)。此外，如美国专利6，090，382的实施例2所证明，阿达木单抗重链和轻链的CDR3结构域易于进行单一丙氨酸残基置换(在在VLCDR3当中的位置l、4、5、7或8或者在VHCDR3当中的位置2、3、4、5、6、8、9、lO或ll)而基本上不影响Koff。还进一步地，技术人员会认识到，鉴于阿达木单抗VL和VHCDR3结构域易于被丙氨酸置换，在CDR3结构域当中还可能进行其他氨基酸置换，同时还保持抗体的低离开(off)速率常数，所述其他氨基酸置换特別是保守氨基酸置换。优选地，在阿达木单抗VL和/或VHCDR3结构域当中进行的保守氨基酸置换不超过一个至五个。更优选地，在阿达木单抗VL和/或VHCDR3结构域当中进行的保守氨基酸置换不超过一个至三个。另外，不应在对于与hTNFa的结合而言关键的氨基酸位置进行保守氨基酸置换。阿达木单抗VLCDR3的位置2和5及阿达木单抗VHCDR3的位置1和7似乎对于与hTNFa的相互作用是关键的，因此优选不在这些位置进行保守氨基酸置换(尽管如上所述，在阿达木单抗VLCDR3的位置5进行丙氨酸置换是可接受的)(参见美国专利6，090，382)。因此，在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分优选具有以下特征a)以1x10-3s-l或更低的K0ff速率常数从人TNFa解离下来，该参数是用表面等离振子共振法测定；b)具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者从SEQIDNO:3修饰而成的氨基酸序列的轻链CDR3结构域，该修饰是位置1、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换或者位置1、3、4、6、7、8和/或9处的一至五个保守氨基酸置换；c)具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者从SEQIDNO:4修饰而成的M酸序列的重链CDR3结构域，该修饰是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换或者位置2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12处的一至五个保守氨基酸置换。更优选地，该抗体或其抗原结合部分以5x10-4s-l或更低的K。ff从人TNFa解离下来。甚至更优选地，该抗体或其抗原结合部分以lx10-4s-l或更低的Koff从人TNFa解离下来。在又一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分优选含有这样的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，该LCVR具有包含SEQIDNO:3氨基酸序列或者从SEQIDNO:3修饰而成的氨基酸序列的CDR3结构域，该修饰是位置l、4、5、7或8处的单一丙氨酸置换；该HCVR具有包含SEQIDNO:4氨基酸序列或者从SEQIDNO:4修饰而成的氨基酸序列的CDR3结构域，该修饰是位置2、3、4、5、6、8、9、10或11处的单一丙氨酸置换。优选地，LCVR还具有包含SEQIDNO:5氨基酸序列的CDR2结构域(即阿达木单抗VLCDR2),HCVR还具有包含SEQIDNO:6氨基酸序列的CDR2结构域(即阿达木单抗VHCDR2)。甚至更优选地，LCVR还具有包含SEQIDNO:7氨基酸序列的CDR1结构域(即阿达木单抗VLCDR1)，HCVR还具有包含SEQIDNO:8氨基酸序列的CDR1结构域(即阿达木单抗VHCDRl)。VL的构架区优选来自VkI人神系家族，更优选来自A20人种系Vk基因，最优选来自美国专利6,090,382的图IA和IB中所示的阿达木单抗VL构架序列。VH的构架区优选来自VH3人种系，更优选来自DP-31人种系VH基因，最优选来自美国专利6,090,382的图2A和2B中所示的阿达木单抗VH构架序列。因此，在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合部分优选含有这样的轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)，该LCVR包含SEQIDNO:1氨基酸序歹'J(即阿达木单抗VL)，该HCVR包含SEQIDNO:2氨基酸序列(即阿达木单抗VH)。在某些实施方案中，该抗体包含重链恒定区，如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgGl重链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，该抗体可包含轻链恒定区，其为kappa轻链恒定区或lambda轻链恒定区。优选地，该抗体包含kappa轻链恒定区。或者，该抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。在又一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分优选含有阿达木单抗相关VL和VHCDR3结构域，例如是具有这样的轻链可变区(LCVR)或具有这样的重链可变区(HCVR)的抗体或其抗原结合部分，该LCVR具有包含选自以下的氨基酸序列的CDR3结构域SEQIDNO:3、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25和SEQIDNO:26;该HCVR具有包含选自以下的氨基酸序列的CDR3结构域SEQIDNO:4、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34和SEQIDNO:35。用于本发明TNFa抗体可进行修饰。在一些实施方案中，TNFa抗体或者其抗原结合片段进行化学修饰，以提供期望的效果。例如，本发明抗体和抗体片^爻的PEG化可以通过本领域公知的任何PEG化反应来进行，所述反应描述于例如以下参考文献Focwo"OowA尸actow3:4-10(1992);EP0154316和EP0401384(每篇文献通过引用整体结合到本文中)。优选地，PEG化是通过与反应性聚乙二醇分二醇(PEG)。本文所用的"聚乙二醇，，意指涵盖任何形式的已被用来将其他蛋白质衍生化的PEG，例如单(Cl-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。制备本发明PEG化抗体和抗体片段的方法一般会包括以下步骤(a)在能使本发明抗体或抗体片段与一个或多个PEG基团发生连接的条件下，使所述抗体或抗体片段与聚乙二醇(如PEG的反应性酯或醛衍生物)进行反应，和(b)获得反应产物。根据已知的参数和期望的结果来选择最佳反应条件或酰化反应，这对于本领域技术人员是显而易见的。PEG化抗体和抗体片段一般可以用来治疗本发明TNFa相关疾病，做法是施用本文所述的TNFot抗体和抗体片段。一般地，与非PEG化抗体和抗体片段相比，PEG化抗体和抗体片段的半寿期延长。各个PEG化抗体和抗体片段可以单独使用，一起使用，或者与其他药物组合物联合施用。在本发明的又一个实施方案中，可对TNFa抗体或抗体片段加以50改变，其中对抗体的恒定区加以修饰，以相对于未修饰抗体减少至少一个恒定区介导的生物效应物功能。为修饰本发明抗体以使它显示出与Fc受体的结合降低，可将抗体的免疫球蛋白恒定区段在Fc受体(FcR)相互作用所必需的特定区域进行突变(参见例如CanfieldandMorrison(1991)/￡xp.MW.HI:1483-1491;和LundWa/.(1991)Jo//www朋/.JiZ:2657-2662)。抗体的FcR结合能力的降低也会降低依赖于FcR相互作用的其他效应子功能，例如调理作用和吞噬作用及抗原依赖性细胞毒性。本发明的抗体或抗体部分可进行衍生化或者与另一个功能分子(例如另一个肽或蛋白质)连接。因此，本发明的抗体或抗体部分意指包括本文所述人抗hTNFa抗体的衍生化形式和别的修饰形式，包括免疫粘附分子。例如，可将本发明的抗体或抗体部分功能性地连接(通过化学偶联、基因融合、非共价締合或者其他方式)到一个或多个其他分子实体，如另一个抗体(例如双特异性抗体或双抗体)、可才企测试剂、细胞毒性剂、药物物质和/或能介导抗体或抗体部分与另一个分子(例如链霉亲和素核心区或聚组氨酸标签)締合的蛋白质和/或肽。一种类型的衍生化抗体是通过使两个或多个抗体(相同或不同类型，例如以产生双特异性抗体)交联来制备的。合适的交联剂包括异双功能(heterobiflmctional)交联剂和同双功能(homobiflmctional)交联剂，前者具有两个被适当间隔区隔开的反应性不同的基团，例如是间-马来酰亚胺苯曱酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯，后者例如是二琥珀酰亚胺辛二酸酯。这种交联剂可从PierceChemicalCompany,Rockford,IL获得。括荧光化合物。示例性的荧光可4全测试剂包括荧光素、荧光素异石危氰酸酯、罗丹明、5-二曱胺-l-备璜酰氯、藻红蛋白等等。抗体还可以用可检测的酶衍生化，例如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶等等。当用可检测的酶将抗体衍生化时，该抗体是通过加入该酶用来产生可检测反应产物的另外试剂来进行检测。例如，当存在辣根过氧化物酶这种可^r测试剂时，过氧化氢和二氨基联苯胺的加入导致产生可检测的有色反应产物。抗体还可以用生物素衍生化，并通过间接测量亲和素或链霉亲和素结合来进行检测。本发明的抗体或抗体部分可通过在宿主细月包中重组表达免疫王求蛋白轻链和重链基因来制备。为重组表达抗体，用一个或多个携带编码抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA片段的重组表达载体转染宿主细胞，使得轻链和重链在宿主细胞中表达，并优选地被分泌到培养宿主细胞的培养基中，从培养基可回收抗体。应用标准的重组DNA方法来获得抗体重链和轻链基因，将这些基因并入到重组表达载体中，并将栽体导入宿主细胞，这些方法如以下文献所述Sambrook,FritschandManiatis(eds),M/ecw/arC7簡'"g;Z^orafc^Ma"wa/，5feco"(i五淑ow，ColdSpringHarbor,N.Y.,(1989),Ausubela/,(eds.)Cwrrewf/Votoco/s/"Afo/ecw/arBz.o/ogy,GreenePublishingAssociates,(1989)和Boss等的美国专利4，816，397。为表达阿达木单抗或阿达木单抗相关抗体，首先获得编码轻链和重链可变区的DNA片段。这些DNA可通过采用聚合酶链式反应(PCR)，对种系轻链和重链可变序列进行扩增和修饰来获得。人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列是本领域公知的(参见例如"Vbase，，人种系序列数据库；另参见Kabat"a/.(1991)5^we"ceso/尸TO/e/m1o/7w,"o/og/ca//她m^,F舜U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242;Tomlinsona(1992)"TheRepertoireofHumanGermlineVhSequencesRevealsaboutFiftyGroupsofVhSegmentswithDifferentHypervariableLoops"/Mo/.5fo/.22Z:776-798和Cox"a/.(1994)"ADirectoryofHumanGerm-line力gSegmentsRevealsaStrongBiasintheirUsage"J/mmw"o/.^:827-836;每个文献的内容通过引用明确结合到本文中)。为获得编码阿达木单抗或阿达木单抗相关抗体的重链可变区的DNA片段，通过标准PCR来扩增人种系VH基因VH3家族的成员。最优选地，扩增DP-31VH种系序列。为获得编码阿达木单抗或阿达木单抗相关抗体的轻链可变区的DNA片段，通过标准PCR来扩增人种系VL基因VKI家族的成员。最优选地，扩增A20VL种系序列。适用于扩增DP-31种系VH序列和A20种系VL序列的PCR引物，可根据以上参考文献中公开的核苷酸序列，用标准的方法来设计。一旦获得种系VH片段和VL片段，可将这些序列诱变成编码本文公开的阿达木单抗或阿达木单抗相关氨基酸序列。首先将种系VH和VLDNA序列编码的氨基酸序列与阿达木单抗或阿达木单抗相关VH和VL氨基酸序列进行比较，以鉴定阿达木单抗或阿达木单抗相关序列中与种系不同的氨基酸残基。然后，将种系DNA序列的适当核苷酸进行突变，使得突变的种系序列编码阿达木单抗或阿达木单抗相关的氨基酸序列，应作哪些核苷酸变化是用遗传密码来确定。种系序列的诱变是通过标准方法进行，例如PCR介导的诱变(其中诱变的核香酸被并入到PCR引物中，使得PCR产物包含突变)或定点诱变。一旦获得编码阿达木单抗或阿达木单抗相关VH和VL区段的DNA片段(如上所述通过扩增和诱变种系VH和VL基因来获得)，可通过标准的重组DNA技术对这些DNA片段进一步进行操作，以例如将可变区基因转变成全长抗体链基因、转变成Fab片段基因或转变成scFv基因。在这些操作中，将编码VL或VH的DNA片段操作性连接到编码另一蛋白质(例如抗体恒定区或柔性接头)的另一DNA片段。在这个情形中所用的术语"操作性连接"意思是将两个DNA片段连接，使得这两个DNA片段所编码的氨基酸序列保持符合读框(remainin-frame)。可通过将编码VH区的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子操作性连接，将编码VH区的分离DNA转变成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域公知的(参见例如Kabatef(1991)Se《we"ceso/iVofe/m1o/7mmw"o/og/ca/F辨/z五力Y/ow,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，且包含这些区域的DNA片段可通过标准的PCR扩增来获得。重链恒定区可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgGl或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可将编码VH的DNA与只编码重链CH1恒定区的另一DNA分子操作性连接。可通过将编码VL的DNA与编码轻链恒定区CL的另一DNA分子操作性连接，将编码VL区的分离DNA转变成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域公知的(参见例如Kabat(1991)5fe《we"ceso/iVofez>w。/7附附wwo/og/ca//"ferey/'Fz^/z五淑ow，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，且包含这些区域的DNA片段可通过标准的PCR扩增来获得。轻链恒定区可以是K或人恒定区，但是最优选是K恒定区。为获得scFv基因，将编码VH和VL的DNA片段操作性连接到编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段，使得VH序列和VL序列能被表达为连续的单链蛋白质，其中VL区和VH区通过柔性接头连接(参见例如Bird"a/.(1988)5We"ce242:423-426;Hustonda/.(1988)Prac.iVw/.JcM.Sd.H:5879-5883;McCaffertyd,淑鮮(1，)348:552-554)。为表达本发明的抗体或抗体片段，将如上所述获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译调节序列操作性连接。在这个情形中，术语"操作性连接"指的是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列能发挥其调节抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择表达载体和表达控制序列使其与所用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入到不同的载体中，或者更通常是将两个基因插入到相同的表达载体中。抗体基因通过标准的方法插入到表达载体中(如将抗体基因片段上的互补限制性酶切位点与载体相连接，或者如果没有限制性酶切位点，则进行钝末端连接)。在插入阿达木单抗或阿达木单抗相关轻链或重链序列之前，表达载体可能已经携带抗体恒定区序列。例如，一种将阿达木单抗或阿达木单抗相关VH序列和VL序列转变成全长抗体基因的方法，就是将它们分别插入到已编码重链恒定区的表达载体和已编码轻链恒定区的表达载体中，使得VH区段操作性连接到载体当中的CH区段，而VL区段操作性连接到载体当中的CL区段。另外，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞中分泌出来的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽符合读框地连接到(linkedin-frameto)抗体链基因的氨基末端。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。除了抗体链基因外，本发明的重组表达载体还携带能调控抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语"调节序列"意指包括能控制抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子以及别的表达控制元件(如多聚腺苷酸信号)。这些调节序列在例如Goeddel;五;c/m^'owrec/zwo/ogy.'Me决cxis/"五，wo/ogv185,AcademicPress,SanDiego，CA(1990)中有描述。本领域技术人员会认识到，表达载体的设计，包括调节序列的选择，要取决于诸如所选择转化的宿主细胞、所需蛋白的表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调控序列，包括能指导蛋白在哺乳动物中的高水平表达的病毒元件，如衍自巨细胞病毒(CMV)(如CMV启动子/增强子)、猿病毒40(SV40)(如SV40启动子/增强子)、腺病毒(如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤病毒的启动子和/或增强子。有关病毒调节元件及其序列的进一步介绍参看例如Stinski的美国专利5,168,062，Bell等的美国专利4,510,245以及Schaffoet等的美国专利4,968,615。除了抗体链基因和调节序列外，本发明的重组表达载体还可携带别的序列，如能调节载体在宿主细胞中复制的序列(如复制起点)以及选择标记基因。选择性标记基因有助于挑选出其中已导入载体的宿主细胞(参看美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017,这三个专利都是Axel等人的)。例如，通常选择性标记基因能给其中已导入了载体55的宿主赋予对药物如G418、潮霉素或氨曱蝶呤的抗性。优选的选择性标记基因包括二氬叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于氨曱蝶呤选择/扩增)和neo基因(进行G418选择)。为了表达轻链和重链，用标准技术将编码重链和轻链的表达载体转入宿主细胞中。不同形式的术语"转染"意在涵盖多种常用于将外源DNA导入到原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管从理论上说，本发明的抗体可能在原核或真核宿主细胞中表达，但最优选的是在真核细胞、最优选哺乳动物宿主细胞中表达抗体，真核细胞尤其是哺乳动物细胞比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠并具有免疫活性的抗体。抗体基因在原核细胞中的表达据报道不能有效地高收率生产活性抗体(Boss,M.A和Wood,C.R(1985),ImmunologyToday12-13)。优选用于表达本发明重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，在UrlaubandChasin，(1980)PNASUSA77:4216-4220中描述，与例如KaufinanandSharp(1982)Mol.Biol.159:601-621中描述的DHFR选择性标记一起使用)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被导入到哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养一^:时间来生产抗体，该段时间足以使抗体得以在宿主细胞中表达，或者更优选地使抗体得以分泌到宿主细胞生长的培养基中。可用蛋白质纯化方法将抗体从培养基中回收。宿主细胞也可用来产生完整抗体的部分，如Fab片段或scFv分子。应认识到，上述方法的修改方案也在本发明的范围之内。例如，可能宜用编码本发明抗体的轻链或重链(但不是同时编码两者)的DNA来转染宿主细胞。也可利用重组DNA技术，来去掉编码轻链或重链或两者的DNA中对结合hTNFa没有必要的一些部分或全部。从这种截短的DNA分子表达的分子也涵盖在本发明的抗体范闺之内。此外，可通过标准的化学交联方法将本发明的抗体与另一抗体交联，来产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链属本发明的抗体，而另外一条重链和轻链对hTNFa之外的抗原有特异性。在一个优选的进行本发明抗体或其抗原结合部分的重组表达的系统中，通过磷酸钙介导转染将编码抗体重链和轻链的重组表达载体导入dhfr-CHO细胞中。在这个重组表达载体当中，抗体重链和轻链各自操作性连接到CMV增强子/AdMLP启动子调节元件，以驱动高水平的基因转录。重组表达载体还携带有DHFR基因，该基因使得可以采用氨曱蝶呤选择/扩增来选出转染了载体的CHO细胞。将选出的转化宿主细胞进行培养，以使抗体重链和轻链得以表达，而后从培养基中回收完整抗体。用标准的分子生物学技术来制备重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。本发明的重组人抗体，除了本文公开的阿达木单抗或其抗原结合部分或者阿达木单抗相关抗体外，也可以通过筛选用人VL和VHcDNA制备的重组组合抗体文库(优选scFv噬菌体展示文库)进行分离，该人VL和VHcDNA是从衍自人淋巴细胞的mRNA制备的。制备和篩选这样的文库的方法是本领域众所周知的。除了市售的用以产生噬菌体展示文库的试剂盒(例如Pharmacia重组噬菌体抗体系统，目录号27-9400-01;和StratageneSw^/Z4PTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)外，特别适用于产生和筛选抗体展示文库的方法和试剂的实例可见于例如Ladneretal.美国专利5,223,409;Kangetal.PCT公开说明书WO92/18619;Doweretal.PCT公开说明书WO91/17271;Winteretal.PCT公开说明书WO92/20791;Marklandetal.PCT公开说明书WO92/15679;Breitlingetal.PCT公开说明书WO93/01288;McCaffertyetal.PCT公开说明书WO92/01047;Garrardetal.PCT公开说明书WO92/09690;Fuchsetal.(1991)Bio/Technology9:1370-1372;Hayetal.(1992)HumAntibodHybridomas3:81-85;Huseetal.(1989)Science246:1275-1281;McCaffertyetal.，Nature(1990)348:552-554;Griffithsetal.(1993)EMBOJ12:725-734;Hawkinsetal.(1992)JMolBiol226:889-896;Clacksonetal.(1991)Nature352:624-628;Grametal.(1992)PNAS89:3576-3580;Garrardetal.(1991)Bio/Technology9:1373-1377;Hoogenboometal.(1991)NucAcidRes19:4133-4137;和Barbasetal.(1991)PNAS88:7978-7982。在一个优选的实施方案中，为分离对hTNFa有高亲和力和低离开(off)速率常数的人抗体，首先使用Hoogenboom等人的PCT公开说明书WO93/06213中描述的表位印记法，利用对hTNFa有高亲和力和低离开速率常数的鼠源抗hTNFa抗体(如MAK195杂交瘤，其寄存号是ECACC87050801),来选出有相似的hTNFa结合活性的人重链和述制备和筛选scFv文库McCafferty等人的PCT公开说明书WO92/01047;McCaffertyda/.iVaft^e(1990)巡:552画554;和Griffiths^a/.(1993)￡M50/12:725-734。scFv抗体文库优选的是用重组人TNFa为抗原来进行篩选。一旦选出初始人VL区段和VH区段，就进行"混合与匹配"实验来选择优选的VL/VH配对组合，在该实验中，将初选的VL区段和VH区段进行不同的配对后进行TNFa结合能力的筛选。另外，为进一步改善TNFa结合亲和力和/或降低TNFa结合离开速率常数，可将优选的VL/VH对中的VL区段和VH区段进行随机突变，优选的是在VH和/或VL的CDR3区当中进行突变，突变过程和在天然免疫反应中负责抗体亲和力成熟的体内体细胞突变过程类似。这个体外亲和力成熟可用分别与VHCDR3或VLCDR3互补的PCR引物扩增VH区和VL区来实现，所述引物在某些位置已被随机"掺入，，了四种核苷酸，使得所产生的PCR产物能编码在其CDR3区中已导入了随机突变的VH区段和VL区段。可对这些随机突变的VH区段和VL区段进行hTNFa结合能力的再筛选，并可选出显示高hTNFa结合亲和力和低hTNFa结合离开速率的序列。58从重组的免疫球蛋白展示文库筛选和分离本发明的抗hTNFa抗体后，可将编码选定抗体的核酸从展示包装(displaypackage)(例如从噬菌体基因组)中回收，并通过标准的重组DNA技术亚克隆到别的表达载体中。如果有需要，可以对核酸作进一步操作，以产生其他形式的本发明抗体(如连接到编码别的免疫球蛋白结构域如别的恒定区的核酸上)。为表达通过筛选组合文库分离到的重组人抗体，如上文所详述，将编码抗体的DNA克隆到重组表达载体中并导入哺乳动物宿主细胞。分离具有高hTNFa亲和力和低hTNFgt离开速率常数的人抗体的方法，在美国专利6,090,382、6，258，562和6，509，015中也有描述,每个专利都通过引用结合到本文中。III.抗体纯化本发明提供从包含抗体和至少一种HCP的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法。本发明还提供从包含抗体和至少一种组织蛋白酶L酶原的混合物生产组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品的方法。当用II章节中描述的方法和本领域的常规方法生产出了抗体时，本发明的纯化过程从分离步骤开始。通常在本领域，将抗体-HCP混合物施以A蛋白捕捉(例如A蛋白柱)作为初始分离步骤，因为抗体会结合A蛋白，而HCP则会流过。本发明的纯化方法其优点是，没有必要将包含抗体和至少一种HCP的混合物施以A蛋白捕捉步骤(例如A蛋白柱)作为初始步骤，或者作为纯化方法中的任何步骤。一旦获得了包含抗体的澄清溶液或混合物，用不同纯化技术的组合来进行抗体与细胞所产生的其他蛋白质的分离，这些技术包括离子交换分离步骤和疏水相互作用分离步骤。分离步骤是根据蛋白质的电荷、疏水程度和/或大小来分离蛋白质的混合物的。在本发明的一个实施方案中，用层析法进行分离，包括阳离子层析，阴离子层析和疏水层析。每种这些技术都有几种不同的层析树脂可供使用，这使得能使纯化方案准确地适合于所涉及的特定蛋白质。每种分离方法的实质在于，可使蛋白质以不同的速度沿长柱子向下移动，从而实现物理分离，分离的程度随着蛋白质向下通过柱子而增加，或者可使蛋白质选择性地吸附到分离介质，然后用不同的溶剂进行差分洗脱。在一些情况中，如果杂质特异性粘附于柱子上，而抗体不会粘附，即抗体存在于流通物中，则抗体得以与杂质分离。将抗体从不需要的蛋白质中纯化出来的方法在下文中冲是供，例如工艺A。在一个实施方案中，本发明包括下文工艺A中描述的步骤，这些步骤要么是单独的，要么组合在一起。工艺A提供了用离子交换分离(阳离子交换层析和阴离子交换层析)和疏水相互作用分离纯化包含抗体的混合物，从而获得适用于药物组合物的抗体制品的方法。工艺A的优点是，无需在抗体纯化中进行A蛋白捕捉作为初始步骤，就可执行它。在一个实施方案中，用工艺A纯化的抗体是阿达木单抗。工艺A—般包括以下将包含抗体和杂质(例如HCP)的混合物荷载到离子交换柱如阳离子交换柱上。该混合物可以以约530g抗体/升/循环的荷载量荷载。随后用洗涤緩冲液(平衡緩沖液)洗涤荷载到阳离子柱上的混合物。然后将抗体从柱子洗脱下来，获得第一洗脱物。第一洗脱物然后常常进行病毒灭活和pH调节，以准备进行阴离子交换层析。第一洗脱物是通过将pH调节到相对于洗脱緩冲液而言的低pH来进行病毒灭活的(在下文IIIC章节中进一步描述)。随后将病毒灭活洗脱物的pH在超过一个步骤中调节到约7.6的最终pH，这个pH是后面跟着的阴离子交换柱的pH。第一洗脱物进行了病毒灭活后，常常进行第二离子交换分离步骤，其中将第一洗脱物荷载到阴离子交换柱(例如Q琼脂糖凝胶柱)。用洗涤緩冲液洗涤该柱，获得包含抗体的笫一流通物。该流通物通过荷载到疏水相互作用柱(苯基琼脂糖凝胶)作进一步的纯化。将该柱洗涤，从该柱洗脱出抗体，由此获得第二洗脱物。下文描述工艺B，它提供了从包含抗体的混合物生产宿主细胞蛋白(HCP)降低的抗体制品的改进方法。词语"降低的"指HCP或组织蛋白酶L酶原时，包括对工艺A中可比较点(comparablepoint)处的HCP或組织蛋白酶L酶原水平(例如浓度或活性)的改进。在一个实施方案中，与工艺A的第一洗脱物相比，工艺B的第一洗脱物包含水平降低的HCP或组织蛋白酶L酶原。在一个实施方案中，与工艺A的第一流通物相比，工艺B的第一流通物包含水平降低的HCP或组织蛋白酶L酶原。在一个实施方案中，与工艺A的第二洗脱物相比，工艺B的第二洗脱物包含水平降低的HCP或组织蛋白酶L酶原。在另一个实施方案中，与工艺A获得的抗体制品相比，工艺B获得的抗体制品包含水平降低的HCP或组织蛋白酶L酶原。工艺B—^殳包括以下将包含抗体和杂质(例如HCP)的混合物荷载到离子交换柱如阳离子交换柱上。该混合物可以在pH7下以约535g抗体/升/循环的荷载量荷载，或者在pH5下以约570g抗体/升/循环的荷载量荷载。随后用洗涤緩沖液(平衡緩冲液)洗涤荷载到阳离子柱上的混合物。在平衡洗涤緩冲液之后，进行中间洗涤步骤，其中该柱子用电导率与洗脱緩冲液相似的中间緩沖液进行洗涤。这个中间洗涤步骤能改进工艺相关杂质(process-relatedimpurities)的清除。然后用洗脱緩沖液将抗体从柱子上洗脱下来，获得第一洗脱物。第一洗脱物然后常常进行病毒灭活和pH调节，以准备进行阴离子交换层析。第一洗脱物是通过将pH调节到相对于洗脱緩冲液而言的低pH来进行病毒灭活的。随后将病毒灭活洗脱物的pH和电导率在一个步骤中调节到约7.8-8.2的最终pH，这个pH是后面跟着的平衡阴离子交换柱的pH。第一洗脱物进行了病毒灭活后，进行第二离子交换分离步骤，其中将第一洗脱物荷载到阴离子交换柱(例如Q琼脂糖凝胶柱)。用洗涤緩冲液洗涤该柱，获得包含抗体的第一流通物。该流通物通过荷载到疏水相互作用柱(苯基琼脂糖凝胶)作进一步的纯化。将该柱洗涤，从该柱洗脱出抗体，由此获得第二洗脱物。工艺B的结果是HCP(包括组织蛋白酶L酶原)降^[氐的制品。工艺B的进一步结果包括通过将HCP清除操作移到工艺的前部分来消除工艺瓶颈(例如在细胞培养放大中得到更高的生产率)，并使抗体产率总体得到改进。关于本发明的改进工艺的另外细节在下文中提供。///.A庠子爻换为、岸本发明涉及从包含抗体和至少一种HCP的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，做法是将该混合物进行至少一个离子交换分离步骤，由此获得包含该抗体的第一洗脱物。离子交换分离包括任何据以根据两种物质各自的离子电荷的差异而将它们分离开的方法。在进行该分离中，可使用例如批式纯化技术或层析法，使抗体混合物与离子交换材料相接触。例如，对于批式纯化，将离子交换材料在所需的起始緩冲液中制备，或者使其与所需的起始緩冲液平衡。获得离子交换材料的浆液。使抗体溶液与该浆液接触，以将待分离抗体吸附到离子交换材料上。将包含不结合离子交换材料的HCP的溶液与该浆液分离开，例如通过让该浆液沉淀和除去上清液来分离。可对该浆液进行一个或多个洗涤步骤。如果需要，可将该浆液与更高电导率的溶液接触，以使已结合离子交换材料的HCP脱附。为洗脱出结合的多肽，可提高盐浓度。离子交换层析也可用作离子交换分离技术。离子交换层析是根据各分子总体电荷之间的差异来分离分子的。对于抗体的纯化，抗体所具有的电荷必需与连接到离子交换材料(例如树脂)的官能团的电荷相反才能发生结合。例如，在緩冲液pH下其总正电荷通常低于其pI的抗体，会很好地结合含有带负电官能团的阳离子交换材料。在离子交换层析中，倘若周围緩冲液的离子强度低，则溶质的表面上的带电部分(patch)被连接到层析基质的相反电荷所吸引。洗脱通常是通过增加緩冲液的离子强度(即电导率)以与溶质竟争离子交换基质的带电位点来实现的。改变PH从而改变溶质的电荷，是实现溶质的洗脱的另一种方法。电导率或pH的改变可以是渐进改变(梯度洗脱)或者是分步改变(分步洗脱)。可将阴离子或阳离子取代基连接到离子交换基质上，以形成阴离子或阳离子层析载体。阴离子交换取代基包括二乙基氨基乙基(DEAE)基团、季氨基乙基(QAE)基团和季胺(Q)基团。阳离子取代基包括羧甲基(CM)、磺基乙基(SE)、磺基丙基(SP)、硫酸根(P)和磺酸根(S)。纤维素离子交换树脂如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32和CM-52可获自WhatmanLtd.Maidstone,Kent,英国。SEPHADEX⑧基和低交联离子交才吳剂(SEPHADEX-basedand画locross-linkedionexchangers)也是公知的。例如DEAE-、QAE-、CM-和SP-SEPHADEX⑧及DEAE-、Q-CM-和S-SEPHAROSE⑧及SEPHAROSEFastFlow均可获自PharmaciaAB。此外，DEAE和CM衍生的乙二醇曱基丙烯酸共聚物如TOYOPEARLDEAE-650S或M和TOYOPEARLCM-650S或M,可获自TosoHaasCo.，Philadelphia,Pa。在本发明的一个实施方案中，将包含抗体和至少一种HCP的混合物荷载到阳离子交换(CEX)层析柱上。该混合物是在荷载緩沖液中荷载到CEX柱上的，该荷载緩沖液可以是与用以平衡该柱的平衡緩沖液相同。随着包含HCP的混合物通过CEX柱，目标蛋白质被吸附到CEX树脂，而各种HCP(如宿主细胞蛋白，其中目标蛋白质是在重组宿主细胞中产生，或者其他工艺衍生杂质)则流过或者微弱或非特异性地结合CEX树脂。在各个实施方案中CEX树脂是与磺酸基连接的基于合成的曱基丙烯酸酯的聚合物树脂(FractogelS03_(FractogelS))。在一个实施方案中，平衡緩冲液包含20mMNa2P04,25mMNaCl,pH6.8。其他合适的平衡緩冲液包括例如BIS和HEPES，它们在生理浓度下，例如约0.5mM至约100mM范围内(例如10mM、20mM、50mM等)的浓度和生理盐浓度(例如约0.15mMNaCl)，和在5.0-9.0的pH下。在示例性的实施方案中，CEX层析是用FractogelS柱。在一个实施方案中，将约30克抗体/升树脂至约40克抗体/升树脂荷载到FractogelS柱上。在另一个实施方案中，在pH7下将约35克抗体/升树脂荷载到FractogelS柱上。已发现在pH7下约35克抗体/升树脂的荷载量能增加杂质(例如HCP和组织蛋白酶L酶原)的清除。下表1说明用于本发明方法的FractogelS柱的可接受操作范围。表1:pH7下FractogelS层析的可接受搡作范围操作錄AOR树脂容量S35g蛋白质/L树脂荷载样品pH6.5-7.5有效荷载稀释1:1-1:2洗涤2洗脱緩冲液浓缩1:3-1:4物与WFI之比线性速率75-300cm/hr还进一步发现，在pH5下进行层析可增加柱的荷载容量。具体的说，发现在pH5下约70克抗体/升树脂的荷载量能增加杂质(例如HCP和组织蛋白酶L酶原)的清除。因此，在约pH5至约pH7的pH范围内，可使用约35g至约70g抗体/升树脂的荷载量。在将该抗体混合物荷载到该柱上后，用洗涤緩沖液洗涤CEX树脂。具体的说，发现用不同的洗涤緩沖液进行多个洗涤步骤，能产生HCP进一步降低的抗体制品。更具体的说，发现通过采用分别用洗涤緩冲液和中间洗涤緩冲液进行的第一洗涤步骤和中间洗涤步骤，可使组织蛋白酶L酶原水平降低。在一个实施方案中，将CEX树脂首先用与平衡緩冲液相同的洗涤緩冲液进行洗涤。在某些实施方案中，洗涤緩冲液是20mMNa2P04,25mMNaCl,pH6.8。其他合适的洗涤緩冲液包括例如BIS和HEPES,它们在生理浓度下，例如约0.5mM至约100mM范围内(例如10mM、20mM、50mM等)的浓度和生理盐浓度(例如约0.15mMNaCl)，和在5.0-9.0的pH下。在本发明的一个优选实施方案中，进行中间洗涤步骤。已发现通过使用部分上包含与CEX洗涤緩冲液相同的緩冲液的中间洗涤緩沖液，可实现HCP(—般来说)和组织蛋白酶L酶原(具体来说)的水平降低。HCP(—般来说)和组织蛋白酶L酶原(具体来说)的降低的改进，部分上是由中间洗涤緩沖液的电导率增加所致。增加中间洗涤緩冲液的电导率，会造成HCP(其pl低于抗体的pl)的电荷置换，从而造成结合力弱的HCP被洗涤流过柱子。结合力弱的杂质(例如HCP,包括组织蛋白酶L酶原)的清除的增加，又给目标物质(例如抗体)提供更多的结合面积。在其他实施方案中，中间洗涤緩沖液含有约40%至约50%洗脱緩冲液和约50%至约60%注射用水。在更多的实施方案中，中间洗涤緩冲液含有45%洗涤緩冲液和55°/。注射用水。在一个实施方案中，用于中间洗涤的洗涤緩冲液是20mMNa2P04,150mM氯化钠，pH7。在进行多次洗涤后，将抗体从第一阳离子交换材料中洗脱下来，由此获得HCP水平降低的第一洗脱物。由于中间洗涤步骤，第一洗脱物的组织蛋白酶L酶原水平也降低。在一个实施方案中，相比于工艺A的对等步骤，用本发明方法获得的第一洗脱物其HCP水平降低约3至约5倍。在另一个实施方案中，相比于工艺A的对等步骤，用本发明方法获得的第一洗脱物其组织蛋白酶L活性降低约2至约3倍。在一个实施方案中，经HCPELISA测定，第一洗脱物所包含的HCP比混合物少约90至约100倍。在另一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一洗脱物包含的组织蛋白酶L活性在约25至约60RFU/s/mg抗体的范围。在一个优选的实施方案中，将包含抗体的初始洗脱物通过第二离子交换材料，获得HCP水平进一步降低的流通物。在一些实施方案中，第二离子交换步骤可以是下文所述的批式纯化。在其他实施方案中，第二离子交换步骤包括将第一洗脱物荷载到第二离子交换层析柱上，洗涤该柱和获得第一流通物。第二离子交换材料可以是阴离子交换(AEX)树脂，例如Q琼脂糖凝胶柱。在一些实施方案中，将约30g抗体/树脂至约40g抗体/树脂荷载到阴离子交换柱上。增加荷载量到约40g抗体/树脂至约50g抗体/树脂会造成杂质(例如HCP)的清除降低。随着含HCP的緩冲液通过AEX柱，各种HCP会与AEX树脂发生结合，而抗体流过或非特异性地结合AEX柱。在某些实施方案中，阴离子交换树脂是Q琼脂糖凝胶。待纯化的抗体混合物往往会存在于前面纯化步骤的緩冲液中。有许多緩沖液可用，可通过常规实验进行选4奪。例如，可使用25mM三乙醇胺，40mMNaCl，pH8的平衡緩冲液。在一个实施方案中，在将初始洗脱物通过第二离子交换材料之前，可用平衡緩沖液平衡第二离子交换材料。这可例如这样来进行改变第一洗脱物的pH和电导率，使得第一洗脱物的pH和电导率基本上类似于或相当于平衡的第二离子交换材料的pH和电导率，即改变第一洗脱物的pH和电导率，使得其相当于平衡的第二离子交换材料的pH和电导率。在一些实施方案中，用平衡緩沖液将AEX材料(例如Q琼脂糖凝胶)的pH调节到约7.7至约8.3的范围。在更多的实施方案中，将CEX洗脱物(例如初始洗脱物)的pH调节到约7.7至约8.3的范围。在某些实施方案中，AEX材料和初始洗脱物的pH均为8。在一些实施方案中，AEX材料的电导率在约3.5mS/cm至约4.9mS/cm的范围。在更多的实施方案中，初始洗脱物的电导率在约3.5mS/cm至约4.9mS/cm的范围。已发现将荷载物电导率和pH调节到第二离子交换材料的电导率和pH,能提高杂质的清除。对于工艺A,已发现第一洗脱物和/或平衡的第二离子交换材料的电导率总体下降和/或pH增加，会导致HCP的清除增加。在将抗体混合物荷载到柱上后，用洗涤緩冲液洗涤AEX树脂。洗涤緩冲液可以是与平衡緩沖液相同，例如25mM三乙醇胺，40mMNaCl,pH8。在一个实施方案中，可将洗涤物与流通物汇集(pooled),由此获得包含抗体且HCP水平降低的第一流通物。在更多的实施方案中，第一流通物的组织蛋白酶L酶原水平降低。在一个实施方案中，与工艺A的对等步骤相比，用本发明方法获得的第一流通物其HCP水平降低约7至约700倍。在另一个实施方案中，相比于工艺A的对等步骤，用本发明方法获得的第一流通物其组织蛋白酶L活性降低约6至约25倍。在其他实施方案中，由HCPELISA测出，第一流通物的HCP比第一洗脱物少约840至约850倍。在又一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性为约0.4至约4RFU/s/mg抗体之间。下表2说明用于本发明方法的Q琼脂糖凝胶层析的可接受操作范围。表2:0琼脂糖凝胶FF层析的可接受搡作范围<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>如上所述，是用阳离子交换材料还是用阴离子交换材料，取决于蛋白质的总体电荷。因此，在使用阳离子交换材料前先采用阴离子交换材料，这是落入本发明的范围内的。此外，只采用阳离子交换材料或只采用阴离子交换材料，也落入本发明的范围内。本发明的方法可任选包括更多的纯化步骤。可在进行离子交换层析方法之前、过程中或之后进行的另外的纯化程序的实例，包括在疏水相互作用层析上的分级分离(例如在苯基琼脂糖凝胶上)、乙醇沉淀、等电聚焦、反相HPLC、硅胶层析、肝素琼脂糖凝胶层析、进一步的阴离子交换层析和/或进一步的阳离子交换层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、羟磷灰石层析、凝力交电泳、透析和亲和层析(例如使用A蛋白、G蛋白、抗体、特异性底物、配体或抗原作为捕捉试剂)。本发明还涉及这样的从包含抗体和至少一种HCP的混合物生产HCP降低的抗体制品的方法，该方法还包括疏水相互作用分离步骤，其中将第一流通物施与第一疏水相互作用材料，由此获得HCP水平降低的第二洗脱物。在进行分离时，可将多肽混合物与HIC材料进行接触，例如使用批式纯化技术或使用柱子来进行。在进行HIC纯化前，可能宜于例如使该混合物通过前置柱(precolum)来除去任何离液剂或非常疏水的物质。例如，对于批式纯化，将HIC材料在所需的平衡緩冲液中制备，或者与所需的平衡緩冲液平衡。获得HIC材料的浆液。使抗体溶液与该浆液接触，以将待分离抗体吸附到HIC材料上。将包含不结合HIC材料的HCP的溶液与该浆液分离开，例如通过让该浆液沉淀和除去上清液来分离。可对该浆液进行一个或多个洗涤步骤。如果需要，可将该浆液与更低电导率的溶液接触，以使已结合HIC材料的抗体脱附。为洗脱出结合的多肽，可降低盐浓度。在其他实施方案中，疏7jc相互作用分离步骤包括将第一流通物荷载到包含第一疏水相互作用材料的柱子上和洗涤第一疏水相互作用材料，由此获得第二洗脱物。疏水相互作用分离步骤可包括疏水相互作用层析(HIC)步骤。而离子交换层析是依靠蛋白质(例如抗体)的电荷来分离它们，而疏水相互作用层析则是利用一些蛋白质(例如抗体)的疏水性质。抗体上的疏水基团能结合柱子上的亲水基团。蛋白质越疏水，它结合柱子就越强。HIC步骤能除去例如宿主细胞衍生杂质(例如DNA和其他高分子量和4氐分子量产物相关的物质)。疏水相互作用在高离子强度下最强，因此这种形式的分离可便利地在盐沉淀或离子交换程序后进行。高盐浓度能有助于抗体吸附到68fflC柱上，但是取决于抗体的性质和所选的具体HIC配体，实际浓度可在很广的范围内变动。根据各种离子是否促进疏水相互作用(盐析效应)或破坏水的结构(离液效应)和导致疏水相互作用的弱化，可将它们排列成所谓的溶疏系列(soluphobicseries)。阳离子按盐析效应递增顺序排列为Ba++<;Ca讨《；Mg++<;Li+<;Cs+<;Na+<;K+<;Rb+<;NH/,而阴离子按离液效应递增顺序排列为PO—<;S04—<;CH3COOCT<;Cr<;<;NCV<;Cl(V<;I_<;SCN-。一般来说，硫酸钠、硫酸钾或硫酸铵能有效促进HIC中的配体-蛋白质相互作用。可配制出能影响相互作用的强度的盐，顺序如下(NH4)2S04>;Na2S04>;NaCl"NH4CI>;NaBr>;NaSCN。一般来说，约0.75至约2M疏酸铵或约1-4MNaCl的盐浓度是适用的。HIC柱通常包含偶联有疏水配体(例如烷基或芳基基团)的基质(例如交联的琼脂糖或合成的共聚物材料)。优选的HIC柱包含有被苯基基团取代的琼脂糖树脂(例如苯基琼脂糖凝胶tm柱)。许多HIC柱可市售获得。实例包括但不限于低取代或高取代的苯基琼脂糖凝胶tm6FastFlow柱(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);苯基琼脂斗唐凝月交tmHighPerformance柱(PharmaciaLKBBiotechnology,AB,Sweden);OctylSepharoseTMHighPerformance柱(PharmaciaLKBBiotechnology,AB，Sweden);FractogelTMEMDPropyl或FractogelTMEMDPhenyl柱(E.Merck,Germany);Macro-PrepM勿l或Macro-Prept-ButylSupports(Bio-Rad，California);WPHI画Propyl(C.sub.3)tm柱(J.T.Baker，NewJersey)和Toyopear丄tm醚、苯基或丁基柱(TosoHaas，PA)。包含目的抗体和HCP的混合物在进行任何初步纯化步骤后，可进行HIC。待纯化的抗体组合物往往会存在于前面纯化步骤的緩沖液中。但是，在进行HIC步骤前可能有必要向抗体组合物加入緩冲液。有许多緩冲液可获得，可通过常规实验进行选择。在一个实施方案中，将在荷载緩冲液中的、包含待纯化抗体和至少一种HCP的混合物，用酸或石威(视起始pH而定)调节pH到约7,并调到约136至约158mS/cm的电导率。在一个实施方案中，用包含40mM磷酸钠，2.2M(NH4)2S04,pH7的緩冲液稀释抗体混合物。在荷载抗体混合物前，可用平衡緩沖液平衡柱子。在一些实施方案中，平衡緩冲液是20mM磷酸钠，1.1M(NH4)2S04,pH7。在一个实施方案中，将包含抗体的混合物例如第一流通物荷载到苯基琼脂糖凝胶HIC柱上。在某些实施方案中，此步骤的蛋白质荷载量为约20至约40克蛋白质/L树脂。在其他实施方案中，此步骤的蛋白质荷载量为约35克蛋白质/L树脂。在一些实施方案中，可能需要两个或三个层析循环来处理全部的可利用材料。蛋白质与疏水相互作用柱结合后，可用洗涤緩沖液洗涤该柱，该洗涤緩冲液可与平衡緩冲液相同，例如1.1M(NH4)2S04，pH7。用洗脱緩冲液将抗体>^人柱子上洗脱下来，由此获得第二洗脱物。洗脱緩冲液可用常规试验进行选择。洗脱緩沖液pH为约6至约8之间，且具有低硫酸铵浓度(即小于约1M(NH4)2S04)。洗脱緩冲液的电导率为约87至约101mS/cm之间。在一个实施方案中，洗脱緩冲液含有11mM磷酸钠，0.625M(NH4)2S04),pH7。已发现较低的盐浓度导致较少的阿达木单抗结合到树脂。将抗体从第二离子交换材料洗脱下来，由此获得HCP水平降低的第二洗脱物。第二洗脱物其组织蛋白酶L酶原水平也P争低。在一个实施方案中，与工艺A的对等步骤相比，用本发明方法获得的第二洗脱物其HCP水平降低约10至约96倍。在另一个实施方案中，与工艺A的对等步骤相比，用本发明方法获得的第二洗脱物其组织蛋白酶L活性降低约5至约15倍。在一个实施方案中，经HCPELISA测定，第二洗脱物所包含的HCP比第一流通物低约3至约5倍。在另一个实施方案中，经组织蛋白酶L动力学测定法测定，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性在约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体之间。下表3显示用于本发明方法的苯基琼脂糖凝胶层析柱的可接受操作范围。表3:苯基琼脂糖凝胶HP层析的可接受操作范围操作錄AOR柱荷载量20-40g/L荷载样品稀释0.9:1-1.1:1线性速度25-125cm/hr更多的纯化步骤可包括病毒除去步骤以及纳滤(nanofiltration)、超滤和/或渗滤步骤，这在本文中有描述。瓜C.为提供安全余地，在纯化过程中将潜在的未检测到的病毒灭活。病毒灭活的方法是本领域公知的，包括热灭活(巴氏灭菌)、pH灭活、溶剂/去污剂处理、紫外光和伽玛射线辐射及加入某些化学灭活剂如卩-丙内酯或者例如美国专利4,534,972等中所述的菲咯啉铜。在一些实施方案中，混合物的病毒灭活可包括pH病毒灭活。pH病毒灭活技术的方法也是本领域公知的。例如，典型的病毒灭活方法包括将混合物在低pH下温育一段时间，随后中和pH和过滤除去颗粒物。pH水平的选定主要取决于抗体产物的稳定性特征和緩冲液成分。已知在低pH病毒灭活过程中目标抗体的质量受pH和低pH温育时间的影响。病毒灭活除了取决于蛋白质浓度外还取决于上述这些参数，而蛋白质在高浓度下会降低灭活作用。因此，可通过常规实验选择正确的蛋白质浓度、pH和灭活时间参数。混合物的pH可通过任何合适的酸来降低，包括但不限于柠檬酸、乙酸、辛酸或其他合适的酸。在优选的实施方案中，用1M柠檬酸调节混合物的pH。在一些实施方案中，将混合物在约2.9至约3.9的pH下温育约15分钟至约180分钟。在更多的实施方案中，将混合物在约pH3.571下温育约60分钟至约120分钟。在还更多的实施方案中，将混合物在约pH3.5下温育约60分钟至约180分钟。在一个实施方案中，将包含抗体和HCP的混合物在进^f亍离子交换分离前先进行病毒灭活。在其他实施方案中，将初始洗脱物在进行离子交换分离前先进行病毒灭活。在某些实施方案中，将初始洗脱物在进行阴离子交换层析前先进行病毒灭活。在病毒灭活后，将混合物按需进行调整，以进行进一步的纯化步骤。例如，可将pH调节过的汇集物(pool)进行过滤。在一个实施方案中，在低pH病毒灭活和/或过滤后，通常将混合物的pH调节至更为中性的pH,例如约6.5至约8.5。例如，可用注射用水(WFI)冲洗混合物以获得所需的pH。下表4显示本发明方法中所用的低pH病毒灭活参数表4:低oH病毒灭活的可接受搡作参数操作参数AOR温育pH3.0-3.7温育时间60-180min蛋白质浓度23g/L本发明包括这样的方法，其中来自离子交换柱的第一洗脱物在进行第二离子交换层析步骤前先进行病毒灭活。在一个实施方案中，病毒灭活是通过pH病毒灭活来实现。IV.测定宿主细胞蛋白质(HCP)水平的方法
技术领域：
：本发明还提供测定纯化的抗体组合物中的宿主细胞蛋白质(HCP)浓度的残余水平的方法。如上所述，宜将HCP从最终目标物质产物(例如抗体)中除去。示例性的HCP包括发源于抗体生产的蛋白质。若不能从目标抗体中鉴定出并充分除去HCP，可能会导致出现功效降低和/或不利患者反应。本文所用的术语"HCPELISA"指这样的ELISA,在测定中使用的第二抗体对从用以产生抗体(例如阿达木单抗)的细胞(例如CHO细胞)所产生的HCP具有特异性。第二抗体可按照本领域技术人员公知的常规方法产生。例如，第二抗体可用通过假装的生产和纯化操作获得的HCP来产生，该假装的生产和纯化操作即是使用相同的用以产生目的抗体的细胞系，但该细胞系没有转染抗体DNA。在一个示例性的实施方案中，第二抗体用与在所选的细胞表达系统(即用以产生目标抗体的细胞表达系统)中表达的那些HCP类似的HCP来产生。一般来说，HCPELISA包括将包含HCP的液体样品夹在两层抗体(即第一抗体和第二抗体)之间。将样品进行温育，期间样品中的HCP被第一抗体(例如亲和纯化的山羊抗CHO抗体(Cygnus))捕捉。加入对从用以产生该抗体的细胞所产生的HCP有特异性的标记第二抗体(例如生物素酰化的抗CHOHCP抗体)，该第二抗体会结合样品当中的HCP。使用适当的基于第二抗体的标记的试验，就测定出样品中所含的HCP的量。HCPELISA可用以测定抗体组合物(如用上文III章节中描述的方法获得的洗脱物或流通物)中的HCP水平。本发明还提供包含抗体的组合物，其中经HCP酶联免疫吸附测定法("ELISA")测定，该组合物没有可^r测水平的HCP。在一个实施方案中，第一洗脱物包含约12,000至约19,500ng/mg的HCP。在一个实施方案中，第二洗脱物包含约1.0和约0.0ng/mg的HCP。V.测定组织蛋白酶L酶原水平的方法
技术领域：
：本发明提供用测定样品中的组织蛋白酶L酶原的量的动力学测定(或组织蛋白酶L动力学测定)。组织蛋白酶L酶原是衍自某些表达系统的宿主细胞蛋白质，已知它在被激活成组织蛋白酶L时能造成包括抗体(如阿达木单抗)在内的蛋白质的分裂。研究已证明，组织蛋白酶L酶原是作为无活性的酶原而被合成，后来被加工成活性的组织蛋白酶L形式。通过其他蛋白酶如组织蛋白酶D，或者通过在溶酶体的酸性条件中的自身催化激活，来对N末端前肽(pro-peptide)区域进行蛋白水解去除，就发生组织蛋白酶L酶原的激活(Turk"a/.(1999)JB/ocAem259:929)。jt匕夕卜，MasonWa/,(seeMason"a/.(1992)Bz'oc/zem所o//^/ca/Comw189:1659)报道说，在较低的pH条件下加入带负电荷的分子如硫酸葡聚糖，可在pH5.5下实现更高程度的组织蛋白酶L激活。之前的检测组织蛋白酶L酶原(或其活性形式组织蛋白酶L)的水平的方法，包括分析方法如弱阳离子交换层析。但是，若是测试工艺中样品，即由以上III章节描述的工艺获得的样品，由于緩冲体系干扰和基质影响，这种方法是有限的。因此，本发明提供高通量的荧光酶促方法，来例如为了工艺监测目的对组织蛋白酶L酶原进行更好的监测。发明的动力学测定提供了测定组织蛋白酶L酶原的方法，这种方法测定到的组织蛋白酶L酶原水平是标准的终点测定所不容易检测到的。该动力学测定还提供了确定组织蛋白酶L酶原的水平是否是有重现性地低下的手段。在一个实施方案中，可从III章节中描述的工艺的任何时间点获得样品，以证实或确定在整个工艺中组织蛋白酶L酶原的水平得到降低。组织蛋白酶L酶原是通过从蛋白质中除去tt末端来激活的。在一个实施方案中，激活是用肽酶如但不限于组织蛋白酶D实现的。组织蛋白酶L一旦激活，就可选择性地水解底物。将底物与样品接触，并根据底物的变化监测组织蛋白酶L活性。在一个优选的实施方案中，组织蛋白酶L的底物包含标记。标记可包括任何能让组织蛋白酶活性得以测定的物质。组织蛋白酶L能选择性水解的标记底物的实例包括合成底物如Z-亮氨酸-精氨酸-AMC(R&DSystems)。肽底物可含有荧光7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)基团，该基团会被AMC的氨基和精氨酸的羧基之间的酰胺键所猝灭。组织蛋白酶L切割酰胺键时，释放出的AMC基团是发荧光的，可通过分别为380nm和460nm的激发波长和发射波长来测量。这一激发可进行测量并用以测定組织蛋白酶L活性水平。底物的周转速率与样品中存在的组织蛋白酶L的量成正比。这个测量是结合具有已知的組织蛋白酶L活性和已知的组织蛋白酶L数量的参比样品来使用的。然后将样品中的组织蛋白酶L活性与样品中存在的抗体数量建立关联。在一个实施方案中，第一洗脱物包含的组织蛋白酶L活性在约25至约60RFU/s/mg抗体之间。在另一个实施方案中，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性在约0.4至约4RFU/s/mg抗体之间。在一个实施方案中，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性在约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体之间。在一个实施方案中，动力学测定法包括测定书f自哺乳动物细胞表达系统的材料中的组织蛋白酶L酶原的数量，而这个测定是通过使该材料与能将组织蛋白酶L酶原加工成活性组织蛋白酶L形式的酶相接触来进行，由此获得组织蛋白酶L样品。组织蛋白酶L一旦激活，就能选择性地水解底物，包括合成底物如Z-亮氨酸-精氨酸-AMC。然后将底物加到样品，包括例如含有荧光7-氨基-4-曱基香豆素(AMC)基团的Z-亮氨酸-精氨酸-AMC，该基团会被AMC的氨基和精氨酸的羧基之间的酰胺键所猝灭。组织蛋白酶L切割酰胺键时，释放出的AMC基团是发荧光的，可通过分别为380nm和460nm的激发波长和发射波长来测量。测出的组织蛋白酶L活性浮皮用作衍自哺乳动物细胞表达系统(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)的材料中的组织蛋白酶L酶原含量的指标。在一个实施方案中，第一洗脱物包含的组织蛋白酶L活性在约25至约60RFU/s/mg抗体之间。在另一个实施方案中，第一流通物包含的组织蛋白酶L活性在约0.4至约4RFU/s/mg抗体之间。在一个实施方案中，第二洗脱物包含的组织蛋白酶L活性在约0.5至约1.5RFU/s/mg抗体之间。本发明还涵盖介于上述数量之间范围，即这些范围也是本发明的一部分。例如，用作为上限和/或下限的任何上述数值的组合得到的凄t值范围，以及所述范围间的任何数量，都要被包括在本发明中。本发明包括任何上述的修改，无论是单独的还是互相组合在一起。VI.药物组合物可将用本发明方法获得的抗体掺入到适合给予受试者的药物组合物中。通常，所述药物组合物包含抗体或其抗原结合部分和药物可接受载体。本文所用的术语"药物可接受载体"包括任何和所有的生理学上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。药物可接受载体的实例包括下面的一种或几种水、盐水、磷酸盐緩沖盐水、右旋糖、甘油、乙醇等以及它们的组合。在很多情况下，组合物中优选含有等渗剂，例如糖，多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠。药物可接受载体可以进一步包含少量的能提高抗体或其抗原结合部分的贮存期或有效性的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或緩冲剂。包含用本发明方法纯化的抗体或其抗原结合部分的药物组合物，可以是各种各样的形式。这些包括例如液体、半固体和固体剂型，如液体溶液剂(例如可注射和可灌注溶液剂)、分散剂或混悬剂、片剂、丸剂、粉末剂、脂质体和栓剂。优选形式取决于想要的给药方式和治疗应用。典型的优选的组合物是可注射或可灌注溶液剂形式，例如与用来以其他抗体或其他TNFa抑制剂对人进行被动免疫的那些组合物类似的组合物。优选的给药方式是肠胃夕卜(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在一个优选的实施方案中，通过静脉内灌注或注射施用抗体。在另一个优选的实施方案中，通过肌内或皮下注射施用抗体。治疗组合物通常在制备和贮存条件下必须是无菌且稳定的。组合物可配制成溶液剂、微乳液剂、分散体、脂质体或者适合高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液剂可以这样制备将所需量的活性化合物(即抗体或其抗原结合部分)与以上所列的一种或多种成分(按需)掺入到适当的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散体是通过将活性化合物掺入到含有^5出分散介质和以上所列的其他所需成分的无菌介质来制备。在供制备无菌可注射溶液剂的无菌粉末剂的情况中，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从之前过滤过的活性成分与任何其他所需成分的、溶液产生出这些成分的粉末。溶液的合适流动性，可例如通过使用包衣如卵磷脂，通过保持必需的颗粒度(在M体情况中)和通过使用表面活性剂来保持。可注射组合物的长时间吸收，可通过在组合物中包含能延迟吸收的物质(例如单硬脂酸盐和明胶)来造成。组合物中还可以掺入补充的活性化合物。在某些实施方案中，将用于本发明方法的抗体或其抗原结合部分与一种或多种另外的治疗药物共同配制和/或共同给药。例如，可将本发明的抗hTNFoc抗体或抗体部分与一种或多种下面的物质共同配制和/或共同给药一种或多种DMARD或者一种或多种NSAID或者一种或多种能结合其他靶物的另外的抗体(例如能结合其他细胞因子或者能结合细胞表面分子的抗体)，一种或多种细胞因子、可溶性TNFa受体(参见例如PCT公开号WO94/06476)和/或一种或多种能抑制hTNFa产生或活性的化学物质(例如PCT公开号WO93/19751中描述的环己烷-亚基(cyclohexane-ylidene)衍生物)或者它们的任何组合。此外，可将本发明的一种或多种抗体与两种或多种上述治疗物质联合使用。这种联合治疗可以有利地采用较低剂量的所施用治疗药物，从而避免与各种单一治疗有关的可能副作用、并发症或者低水平患者反应。在一个实施方案中，本发明包括包含有效量的TNFot抗体或其抗原结合部分和药物可接受载体的药物组合物，其中该有效量的TNFa抗体可以有效治疗TNFa-相关病症，包括例如克罗恩氏病。在一个实施方案中，将抗体或抗体部分如PCT/IB03/04502和美国申请号10/222140所述掺入到药物制剂中，这两个专利通过引用结合到本文中。这个制剂包含浓度50mg/ml的抗体阿达木单抗，其中一个预填充注射器含有40mg的抗体供皮下注射。用本发明方法获得的抗体或抗体部分可通过多种本领域公知的方法给药，但是对于很多治疗性应用来说，优选的给药途径/方式是皮下注射。在另一个实施方案中，给药是通过静脉内注射或灌注。技术人员会认识到，给药途径/方式要根据期望的结果的不同而异。在某些实施方案中，活性化合物可与能使化合物免于快速释;^文的载体一起制备成例如控释制剂，包括植入物、透皮贴和微胶嚢送递系统。可4吏用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚肝类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。很多制备这种制剂的方法已申请了专利或者是本领域技术人员7^知的。参见例如5Wto/"edam/Co"fra〃e(iie/easeZ)n/gZ)e//ve^yS少他ms,J.R.Robinson,ed.,MarcelDekker，Inc.,NewYork,1978。制剂的形式给药，这种制剂包括几种蛋白质晶体包嚢在聚合物载体当中形成包衣颗粒。蛋白质晶体制剂的包衣颗粒可以具有球形形状，是直径最大500微米的微球体，或者它们可以具有一些其他形状，是微颗粒。提高的蛋白质晶体浓度使得本发明的抗体可进行皮下递送。在一个实施方案中，本发明的抗体通过蛋白质送递系统进行送递，其中将一种或多种蛋白质晶体制剂或组合物给予患有TNFa相关病症的患者。WO02/072636中还描述了完整抗体晶体或抗体片段晶体的稳定化制剂組合物及制备方法，该专利通过引用结合到本文中。在一个实施方案中，采用本发明的多可变剂量(multiple-variabledose)方法，使用PCT/IB03/04502和美国申请号10/222140(这两个专利通过引用结合到本文中)中描述的包含结晶化抗体片段的制剂，来治疗TNFot相关病症。在某些实施方案中，用本发明方法获得的抗体或其抗原结合部分可以例如用惰性稀释剂或可同化可食用载体进行口服给药。化合物(如需要的话，还有其他的成分)还可以密封在硬壳或软壳明胶胶嚢中压成片剂，或者直接掺入到患者饮食中。对于口服治疗给药，可将化合物与赋形剂一起掺入，以可摄取的片剂、口腔片剂、糖锭(troche)、胶嚢剂、酏剂、悬浮剂、糖浆剂、糯米纸嚢剂等形式使用。为了通过肠胃外给药之外的途径施用本发明的化合物，可能有必要将化合物用能防止其失活的材料包衣，或者将化合物与该材料共同施用。本发明的药物组合物可以包括"治疗有效量"或"预防有效量"的本发明抗体或其抗原结合部分。"治疗有效量，，指在必需的剂量下和时间内能有效实现期望的治疗结果的量。抗体或其抗原结合部分的治疗有效量可因各种因素而异，所述因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体、抗体部分、其他TNFa抑制剂在个体中引起期望的反应的能力。治疗有效量还是这样的量，在该量下治疗有益效果超过抗体或其抗原结合部分的任何毒性或有害效果。"预防有效量，，指在必需的剂量下和时间内能有效实现期望的预防结果的量。通常，由于预防剂量是在疾病之前或早期对受试者使用，预防有效量要小于治疗有效量。可以对剂量方案进行调整，以提供最优的期望反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以施用单一推注剂(bolus),可以将几个分开的剂量随时间推移而施用，或者可根据治疗情况的紧急程度的指示而按比例减少或增加剂量。特别有利的是将肠胃外用组合物配制成单位剂量形式，使容易给药并且剂量均匀。本文所用的单位剂量形式是指适合作为单元剂量用于待治疗哺乳动物受试者的物理上分立单位；每个单位包含经计算能产生期望的治疗作用的预定量活性化合物和必需的药学载体。本发明的单位剂量形式的规格受支配于和直接取决于(a)活性化合物的独特特性和所要实现的特定治疗或预防效果，和(b)将这种活抗体或其抗原结合部分的治疗或预防有效量的示例性非限制性范围是10-200mg，更优选20-160mg,更优选40-80mg,最优选大约80mg。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分的治疗有效量是约20mg。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分的治疗有效量是约40mg。在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分的治疗有效量是约80mg。在一个实施方案中，用于本发明方法的抗体或其抗原结合部分的治疗有效量是约120mg。在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分的治疗有效量是约160mg。上述剂量范围的中间范围，例如约78.5至约81.5;约15至约25;约30至约50;约60至约100;约90至约150;约120至约200，也认为是本发明的一部分。例如，用作为上限和/或下限的任何上述数值的组合得到的数值范围，也认为被包括在本发明中。要指出的是，剂量值可随所要减轻的病症的类型和严重程度的不同而异。还要知道，对于任何特定患者，具体剂量方案应该根据个体的需要和进行给药或进行组合物给药管理的人员的专业判断而随时间调节，本文提出的剂量范围只是示例性的，并不意在限制所要求保护的组合物的范围或实施。用本发明方法获得的抗体或其抗原结合部分，可以如wo02/100330所述以双周给药方案来施用，如WO04/037205所述以低剂量方案来施用，和如WO05/110452所述以多变给药方案来施用，每个专利都通过引用结合到本文中。的经包装药物组合物、制造品或药盒。制造品可包含用本发明方法获得的抗体或其抗原结合部分和包装材料。制造品还可包含标签或包装插页，该标签或包装插页说明包含抗体或其抗原结合部分的制剂或組合物具有降低的HCP和/或组织蛋白酶L酶原水平。制造品可包含装在包装材料当中的标签或包装插页，该标签或包装插页说明阿达木单抗制剂包含不超过约70ng/mg的HCP，或者制造品可包含装在包装材料当中的标签或包装插页，该标签或包装插页说明阿达木单抗制剂包含不超过约13ng/mg的HCP。制造品可包含装在包装材料当中的标签或包装插页，该标签或包装插页说明阿达木单抗制剂包含不超过约5ng/mg的HCP。制造品还可包含这样的包装材料，它说明阿达木单抗制剂所包含的组织蛋白酶L酶原的水平不超过约3.0RFU/s/mg阿达木单抗的組织蛋白酶L活性所指示的水平。VII.治疗方法
技术领域：
：本发明提供了用于生产HCP或组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品的方法，该抗体制品可用于抑制患有其中TNFa活性有害的病症的受试者中的TNFoc活性。TNFa被指涉及众多病症的病理生理(参见例如Moeller，A.,&(1990)Cy。h,"e2:162-169;Moeller"a/.的美国专利5，231，024;Moeller，A.的欧洲专利公开号260610Bl)。TNFa被指涉及众多TNFa相关病症的病理生理，包括脓毒症、感染、自身免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主病(参见例如Moeller,A.，Wa/.(1990)Cy。h"e2:162-169;Moellerda/.的美国专利5,231,024;Moeller，A.^a/,的欧洲专利公开号260610Bl;Vasilli，P.(1992)j朋w.Wev./附m朋o/.辺:411-452;Tracey，K丄andCerami，A.(1994)iev.Med.4i:491-503)。本发明提供了用于生产HCP或组织蛋白酶L酶原降低的抗体制品的方法，该抗体制品有利于抑制患有TNFoc相关病症的受试者中的TNFa活性，所述方法包括对受试者给予起始诱导剂量的抗体或其抗原结合片段，随后给予治疗剂量的抗体或其抗原结合片段，使得TNFoc活性被抑制。优选低，TNFot为人TNFa，受试者为人受试者。在一个实施方案中，TNFa抑制剂为阿达木单抗，也称111^11^@(D2E7)。本文所用的术语"其中TNFa活性有害的病症"用以包括这样的疾病或其他病症，其中TNFa在患有该病症的受试者中的存在已被证明或正被怀疑是造成该病症的病理生理的原因或者是促使该病症恶化的因素。因此，其中TNFa活性有害的病症是这样的病症，对其中TNFa活性的抑制预期能緩解其症状和/或进展。这种病症可例如由患有它的受试者的生物流体中TNFa浓度的增力口(例如受试者血清、血浆、滑膜液等中TNFa浓度的增力口)来证实，所述增加可例如用上文所述的抗TNFoc抗体来检测。其中TNFa活性有害的病症的实例有很多。以下进一步讨论用本发明方法获得的TNFot抗体和抗体部分用于治疗具体病症的用途。A.,#症肿瘤坏死因子在脓毒症的病理生理中具有确立的作用，其生物作用包括低血压、心肌抑制、血管渗漏综合征、器官坏死、毒性二次介导物释放的刺激和凝血级联的激活(参见例如Moeller，A.，&(19卯)Cj油."e2:162-169;Moeller"a/.的美国专利5,231,024;Moeller,A.的欧洲专利7>开号260610Bl;Tracey,K丄andCerami,A.(1994)Wev.M^/.M:491-503;Russell，DandThompson,R.C.(1993)Cwr.qp/w.4:714-721)。本发明的多变剂量方法可以用于治疗任意临床情形的脓毒症，包括脓毒性休克、内毒素性休克、革兰氏阴性脓毒症和中毒性休克综合征。此外，为了治疗脓毒症，可将用本发明方法获得的抗hTNFa抗体或抗体部分，与一种或多种可进一步緩解脓毒症的另外的治疗剂联合给药，所述另外的治疗剂例如白细胞介素-1抑制剂(如PCT公开号WO92/16221和WO92/17583中所述的)、细胞因子白细胞介素-6(参见例如PCT公开号WO93/11793)或血小板活化因子拮抗剂(参见例如欧洲专利申请公开号EP374510)。在一个优选的实施方案中，将抗TNFa抗体或抗体部分给予这样的人受试者，他属于在治疗时血清或血浆IL-6浓度高于500pg/ml、更优选1000pg/ml的脓毒症患者亚群(参见PCT公开号WO95/20978byDaum,L.,"a/.)。B.肿瘤坏死因子被指涉及在多种自身免疫性疾病的病理生理中起作用。例如，TNFa被指涉及在类风湿性关节炎中激活组织炎症和造成关节破坏(参见例如Moeller,A.，"a/.(1990)Cy。hVze2:162-169;MoellerWa/.的美国专利5，231,024;Moeller,A.的欧洲专利公开号260610Bl;TraceyandCerami,出处同上；Arend,W.P.andDayer，J画M.(1995)JW/z.^:151-160;Fava,R.A.，"a/.(1993)C//"./mm柳o/.24:261-266)。TNFot还被指涉及在糖尿病中促进胰岛细胞死亡和介导胰岛素抗性(参见例如TraceyandCerami，出处同上；PCT公开号WO94/08609)。TNFa还被指涉及在多发性硬化中介导对少突胶质细胞的细胞毒性和诱导炎性斑块(参见例如TraceyandCerami,出处同上)。TNF(还被指涉及在多发性硬化中介导对少突胶质细胞的细胞毒性和诸导炎性斑块(参见例如TraceyandCerami,出处同上)。已对嵌合和人源化的鼠抗hTNFoc抗体进行了治疗类风湿性关节炎方面的临床测试(参见例如Elliott,M丄，Wa/.(1994)344:1125-1127;Elliot,M丄，da/.(1994)星:l105-1110;Rankin,E.C.，"a/.(1995)/i^ewmato/.M:334國342)。TNFoc抗体如阿达木单抗可用来治疗自身免疫性疾病，特别是那些与炎症相关的自身免疫性疾病。这类自身免疫性疾病的实例包括类风湿性关节炎、类风湿性脊推炎、骨关节炎和痛风性关节炎、变态反应、多发性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎和肾病综合征。自身免疫性疾病的其它实例包括多系统自身免疫性疾病和自身免疫性听觉缺失。通常是经全身给予抗体或抗体部分，不过就某些病症而言，在炎症部位局部给予抗体或抗体部分可能是有益的(例如单独或与如PCT发明者G·扎比斯-帕帕斯托伊特西斯,G·阿夫格尼诺斯,M·W·万申请人:艾博特生物技术有限公司