专利名称：具有雌激素活性的山茶黄酮苷a及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及对天然植物中具有药用活性的新成分的制备及应用。
技术背景本发明人对山茶属植物的研究始于2002年，在与日本太田油脂株社和广西 巴马万力山茶籽发展有限公司联合开发茶油的过程中，先后赴山茶属植物的主 产区广西、云南、四川、湖南进行了资源调査。山茶属(Cawe/"a丄/"".)植物属于山茶科，全世界有280种，主要分布于热 带及亚热带。我国有250种以上，主产于西南至东南部。岭南地区分布最多，近 百种。药用收载的有茶的果实(茶子)、芽叶(茶叶)和根(茶树根)，油茶的种 子(茶子心)、脂肪油(茶油)、油粕(茶麸)、花(茶子木花)和根皮(油茶根 皮)，山茶的花及普洱茶叶。茶油亦为中华人民共和国药典收载。但对山茶属植 物药用价值的现代研究甚少。在资源调査的基础上，我们以资源丰富的山茶属植物为重点，分花、种子、 果皮、茶麸和枝叶进行原料采集。继之，我们经历5年时间，对山茶属植物的药 用价值进行了系统地研究，取得了突破性进展和多项创新性发现。特别是对其 抗骨质疏松的研究。本发明的发明人在研究过程中曾以维甲酸引发的大鼠骨质疏松模型为指标 进行了活性筛选，发现南山茶(C.^m'wrrato 种子的乙醇提取物活性最强， 明显高于阳性对照药。经定性、定量分析确认其有效部位为黄酮类成分，此项 研究中标了国家自然科学基金项目《南山茶抗骨质疏松物质基础、作用机理及 构效关系的研究》(批准号30772714)。本发明的发明人认为有必要对此活性 的进行分子基础的研究，以期获得具体的具有确定活性化合物。发明内容本发明的目的在于寻找该植物中具有药用活性的新的天然产物成分。本发明所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A具有如下结构式:本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法，该方法包括如下步骤① 制备南山茶种子90 98%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物；② 以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿:甲醇12 18:1 (体积)混 合溶液等度洗脱，得混合物；③ 继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿:甲醇18 22:1 (体积)混合溶 液洗脱得山茶黄酮苷A。上述山茶黄酮苷A的制备方法中，步骤②柱色谱洗脱液优选氯仿:甲醇15:1 (体积)混合溶液。步骤③中柱色谱洗脱液优选氯仿:甲醇20:1 (体积)混合溶液。本发明所述的上述山茶黄酮苷A的制备方法中，所述的步骤①的具体操作方 法是以90 98%工业乙醇加热回流提取，料液比1:8 12 (g:ml)，温度90 IO(TC，提取3次，每次3小时；乙醇提取物浓縮成浸膏后以2 5倍蒸馏水混悬， 并按照体积比依次用3倍石油醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次，得乙酸乙酯萃取物。其中，优选以95%工业乙醇加热回流提取，优选料液比I:IO (g:ml)，优选 温度95'C;混悬蒸馏水优选3倍体积。具体来说，该山茶黄酮苷A的制备方法包括如下步骤①制备南山茶种子95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物以95%工业乙醇加 热回流提取，料液比I:IO (g:ml)，温度95'C，提取3次，每次3小时；乙醇提取 物浓縮成浸膏后以3倍蒸馏水混悬，并按照体积比依次用3倍石油醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次，得乙酸乙酯萃取物；② 以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿:甲醇15:1 (体积)混合溶 液等度洗脱，得混合物；③ 继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿:甲醇20:1 (体积)混合溶液洗 脱得山茶黄酮苷A。为了进一步纯化所得山茶黄酮苷A，还可以在最后加上用Sephadex LH20纯 化的步骤，可得黄色粉末状产品。通过结构式和系统命名在SciFinder Scholar数据库查询，证明所得的上述山 茶黄酮苷A具有新颖的结构，是新化合物。本发明继续对对上述山茶黄酮苷A的活性进行了检测利用重组人雌激素受 体基因酵母检测化合物的雌激素活性。重组人基因酵母法是使用比较广泛的一 种体外检测方法，具有灵敏、快速、廉价等特点。它是将2个基因片段引入到酵 母中， 一个为人雌激素受体基因(hER)，另一个为与雌激素受体响应元件(ERE) 相连的P-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因。当类雌激素物质加入培养基中与ER结 合，启动基因的转录，产生和分泌(3-半乳糖苷酶。p-半乳糖苷酶能与其底物反应生成明黄色物质，通过测定A420的吸光度可以测定(3-半乳糖苷酶的活性，从而可以得出被测物质的雌激素活性。经过考察，以DMSO(99.9。/。， Sigma， USA)为阴性对照，17p雌二醇(Sigma) 为阳性对照，上述山茶黄酮苷A对雌激素受体酶活性的诱导存在明显的剂量-效 应曲线关系，即山茶黄酮苷A具有明显的雌激素活性。本发明的另 一 目的即在于提供所述的山茶黄酮苷A在制备雌激素类药物上 的用途。具体的讲，就是将有效剂量的山茶黄酮苷A与药用载体混合并制成适当剂型 的药物。
本发明附图2幅，其中图1是实施例1所述的山茶黄酮苷A雌激素活性的剂量一效应曲线图，图中横 坐标是山茶黄酮苷B的样品浓度(g/L)，纵坐标是半乳糖苷酶酶活(U);图2是实施例l所述的作为阳性对照的17p雌二醇雌激素活性的剂量-效应曲线，图中横坐标是E2浓度(g/L)，纵坐标是半乳糖苷酶酶活(U)。
具体实施例方式
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。如无特殊说明，下述 实施例中综合使用质谱分析技术(ESI-MS)和核磁共振分析技术^H-NMR、 13C-NMR、 H-HCOSY、 HMBC、 HMQC)对物质结构进行分析。
一、 山茶黄酮苷A的制备
① 制备南山茶子(Cawe〃/fl"附&wrataChi.)油粕的乙酸乙酯萃取物以 95%工业乙醇加热回流提取，料液比1:10 (g:ml)，温度95。C，提取3次，每次3 小时；乙醇提取物浓縮成浸膏后以3倍蒸馏水混悬，并按照体积比依次用3倍石 油醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次，得乙酸乙酯萃取物；
② 以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿:甲醇15:1 (体积)混合溶 液等度洗脱，得混合物；
③ 继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿:甲醇20:1 (体积)混合溶液洗 脱得山茶黄酮苷A;
SephadexLH20纯化所得产物，可得黄色粉末状产品。
二、 山茶黄酮苷A的结构鉴定
经过鉴定，所得山茶黄酮苷A为山柰酚-3-0-p-D-葡萄糖基-(6—1) -2"',4"'-0-二乙酰基-a-L-鼠李糖基-(3—1) -2"",3""，4""-0-三乙酰基-01丄-鼠李糖苷。
三、 山茶黄酮苷A的雌激素活性检测 利用重组人雌激素受体基因酵母检测化合物的雌激素活性。考察不同浓度山茶黄酮苷A对重组人雌激素受体基因双杂交酵母酶活性的诱导作用，以DMSO 为阴性对照，np雌二醇为阳性对照，山茶黄酮苷A其对雌激素受体酶活性的诱 导存在明显的剂量-效应曲线关系，该化合物具有明显的雌激素活性。
权利要求
1. 一种具有雌激素活性的山茶黄酮苷A，该化合物具有如下结构式id="icf0001" file="S2008100110966C00011.gif" wi="79" he="63" top= "52" left = "66" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>
2. 权利要求1所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A的制备方法，其特征在 于该方法包括如下步骤① 制备南山茶种子90 98%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物；② 以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿:甲醇12 18:1 (体积)混 合溶液等度洗脱，得混合物；③ 继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿:甲醇18 22:1 (体积)混合溶 液洗脱得山茶黄酮苷A。
3. 根据权利要求2所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A的制备方法，其特 征在于所述的步骤②中柱色谱洗脱液是氯仿:甲醇15:1 (体积)混合溶液。
4. 根据权利要求2所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A的制备方法，其特 征在于所述的步骤③中柱色谱洗脱液是氯仿:甲醇20:1 (体积)混合溶液。
5. 根据权利要求2、 3或4所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A的制备方 法，其特征在于所述的步骤①是以90 98。/。工业乙醇加热回流提取，料液比1:8 12 (g:ml)，温度90 10(TC，提取3次，每次3小时；乙醇提取物浓縮成浸膏后以 2 5倍蒸馏水混悬，并按照体积比依次用3倍石汕醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次， 得乙酸乙酯萃取物。
6. 根据权利要求2、 3或4所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A的制备方 法，其特征在于所述的步骤①是以95。/。工业乙醇加热回流提取，料液比I:IO(g:ml)，温度95'C，提取3次，每次3小时；乙醇提取物浓缩成浸膏后以3倍蒸馏 水混悬，并按照体积比依次用3倍石油醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次，得乙酸乙酯 萃取物。
7. 根据权利要求2所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A的制备方法，其特 征在于该方法包括如下步骤① 制备南山茶种子95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物以95%工业乙醇加 热回流提取，料液比1:10 (g:ml)，温度95。C,提取3次，每次3小时；乙醇提取 物浓縮成浸膏后以3倍蒸馏水混悬，并按照体积比依次用3倍石油醚和3倍乙酸乙 酯各萃取3次，得乙酸乙酯萃取物；② 以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿:甲醇15:1 (体积)混合溶 液等度洗脱，得混合物；③ 继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿:甲醇20:1 (体积)混合溶液洗 脱得山茶黄酮苷A。
8. 根据权利要求2或7所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A的制备方法， 其特征在于该方法还包括最后用Sephadex LH20纯化的步骤。
9. 权利要求1所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A在制备雌激素类药物 上的用途。
10. 根据权利要求9所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A在制备雌激素类 药物上的用途，其特征在于它是将有效剂量的该化合物与药用载体混合并制成 适当剂型的药物。
全文摘要
本发明提供一种具有雌激素活性的山茶黄酮苷A及其制备方法和用途，该化合物是从南山茶子油粕中制得的具有雌激素活性的新化合物，其系统命名为山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖基-(6→1)-2′″，4′″-O-二乙酰基-α-L-鼠李糖基-(3→1)-2″″，3″″，4″″-O-三乙酰基-α-L-鼠李糖苷。该化合物具有明显的雌激素活性。
文档编号A61K31/7042GK101270139SQ20081001109
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月17日 优先权日2008年4月17日
发明者冯宝民, 史丽颖, 玲 唐, 王永奇 申请人:大连大学