专利名称：：一种医用植物雌激素的制作方法
技术领域：
：一种医用植物雌激素。
背景技术：
：以往，葛根总黄酮(野生葛根的提取物，主要成分为葛根素)多用于解热，舒张血管，降压，改善微循环，等用途。从未用于作为医用雌激素类药用途。雌激素主要用于因卵巢功能下降导致雌激素水平下降的疾病，如妇女更年期综合征、骨质疏松、早衰等疾病，也用于与雌激素失衡的相关性疾病如男性雄激素依赖型前列腺增生症。但化学雌激素具有致癌等副作用。技术内容为了开拓葛根总黄酮的用途，本发明提供一种植物雌激素，其特征在于葛根总黄酮至少1mg/每公斤人体重。根据实验证明葛根总黄酮具有化学雌激素相近的生物活性。以正常人的体重为标准，低于1mg/每公斤人体重，则效果微小，高于1mg/每公斤人体重，则用量的增加不会对人体产生有害作用。葛根总黄酮1至3mg/每公斤人体重的用量为有效范围；高于上限则效果增加不显著。葛根作为中药应用在我国已有两千年的历史，长期实践表明葛根毒副作用极低。更未见有致癌的报道。本发明的目的之一是在于将葛根的提取物葛根总黄酮作为雌激素类药物，以治疗雌激素失衡的相关性疾病。葛根总黄酮是葛根(Gegen)RadixPuerariae的提取物，主要有效成分为葛根素Puerariae。从葛根或葛根总黄酮中抽提出葛根素Puerariae，作为植物雌激素，其效果与葛根总黄酮相当；葛根素至少0.5mg/每公斤人体重。低于0.5mg/每公斤人体重，则效果微小，高于0.5mg/每公斤人体重，则用量的增加不会对人体产生有害作用。葛根素0,5至3mg每公斤人体重。高于上限则效果增加不显著。上述植物雌激素，可以作为药品，也可以作保健品，还可以外用，例如喷射剂，用于生殖器或乳房的喷射；产生雌激素样效应。图1是本发明的葛根总黄酮的工艺流程图实施方案实施例一葛根总黄酮粉末，浓度为40％，内含葛根素20％，由广州中医药大学新药中心提供。50岁妇女患更年期综合征，体重为50公斤；用药每天葛根总黄酮粉末250mg，分早晚两次服用；连续服30天。实施例二葛根素由广东大日生化药业有限公司提供。60岁妇女患骨质疏松症，体重为55公斤，用药每天葛根素，粉末55mg，分早晚两次服用；连续服30天。实施例三60岁男性，雄性激素依赖形前列腺增生，体重为70公斤；；用药每天葛根总黄酮粉末350mg，分早晚两次服用；连续服30天。实验例一、葛根总黄酮及葛根素对生殖系统的影响1.材料与方法1.1药物葛根总黄酮粉末，浓度为40％，内含葛根素20％，由广州中医药大学新药中心提供。葛根素由广东大日生化药业有限公司提供。动物分组处理三月龄SD雌性二级大鼠，购自广东省医学实验动物中心，(合格证号2001A046)，体重210(±10g).按体重随机分7组、每组15只。葛根总黄酮分高中低三个喂药剂量组。150mg/kg/d；100mg/kg/d；50mg/kg/d；每日分两次灌胃。葛根素组按50mg/kg/d，每日分两次灌胃。雌激素对照组每日每只一次给予倍美力(化学雌激素)0.25mg空白对照组每日给予生理盐水两次，每只每次2ml各组动物在适应7天后进入实验。实验期间动物每日按上述方案灌药，自由进食普通的大鼠饲料，饮双蒸水。观察一般情况、食欲、精神状态、毛发等。每周称体重一次。第30天颈椎脱臼处死大鼠，腹主动脉采血5ml，1500r/min离心20min，取血清置-20℃冰箱。取卵巢、输卵管、子宫放入福尔马林固定液中供病理切片。1.2标本检测方法1.2.1血清雌激素检测在采血清一周内用放射免疫法检测雌二醇浓度1.2.2子宫内膜、卵巢、输卵管组织学观察取已经福尔马林液固定的组织，按常规制作，HE染色，在显微镜下观察子宫内膜、卵巢、输卵管的组织学改变。2.结果2.1各组大鼠血清中雌二醇浓度葛根总黄酮在中剂量(100mg/kg/d组)与高剂量(150mg/kg/d组)时，可使血清雌激素水平降低。而在低剂量组(50mg/kg/d)时可使血清雌激素水平升高。葛根素组也可使血清雌激素水平降低。与空白对照组相比有非常显著统计学差异。表1各组大鼠血清雌激素浓度(X±S)组别n体重△雌激素浓度150mg/kg13267.77±24.6625.17±4.20*100mg/kg14265.71±20.7129.53±5.85*50mg/kg13255.77±19.8851.02±4.32**葛根素14261.23±23.8228.67±7.34*雌激素15277.67±20.0160.64±6.28*空白对照13276.77±26.2145.11±5.76*与空白对照组相比，P＜0.01；△组间比较经方差检验P＞0.05**与空白对照组相比，P＜0.052.2各组大鼠子宫内膜、卵巢、输卵管的组织学改变葛根总黄酮高、中剂量组、葛根素组与雌激素组卵巢的组织学改变较相似，特点是生长卵泡较多，血管较丰富。葛根总黄酮高、中剂量组和葛根素组与雌激素组的子宫内膜组织学改变较相似，特点是内膜增厚，与空白对照组相比，P＜0.01统计学差异非常显著。见表2，组织学显示，血管增多、增粗、腺体增多，颗粒细胞增多、分泌增加。表2各组大鼠子宫内膜厚度(X±S)组别n子宫内膜厚度mm体重**150mg/kg130.0752±0.0034*267.77±24.66100mg/kg140.0765±0.0041*△265.71±20.7150mg/kg130.0775±0.0025*255.77±19.88葛根素140.0759±0.0052*261.23±23.82雌激素150.0792±0.0030*△277.67±20.01空白对照130.0570±0.0026276.77±26.21*与空白对照组相比，P＜0.01，△与雌激素对照组相比P＞0.05**组间比较经方差检验P＞0.05二、葛根总黄酮及葛根素对去卵巢大鼠骨骼系统的影响(一)动物体内实验1.材料与方法1.1药物葛根总黄酮粉末，浓度为40％，内含葛根素20％。由广州中医药大学新药中心提供。葛根素由广东大日生化药业有限公司提供。动物分组及处理三月龄SD雌性二级大鼠，由广东省医学动物实验中心提供(合格证2001A046)，体重(200±20)g。按体重随机分5组，每组12只。雌激素对照组去卵巢，每日给予倍美力0.25mg，一次灌服葛根总黄酮实验组去卵巢，每日给葛根总黄酮100mg/kg/d，分两次灌服。葛根素组去卵巢，每日给葛根素50mg/kg/d，分两次灌服。假手术组假手术，即行卵巢切除相同的手术过程，但不摘除卵巢，每日给予生理盐水2ml，一次灌服。去卵巢模型空白对照组去卵巢，每日每只给予生理盐水2ml，一次灌服各组动物在适应7天后进入实验。实验期间，动物每日按上述方案灌药。自由进食普通大鼠饲料，饮双蒸水。观察一般情况、食欲、精神状态、毛发等。每周称重一次，第12周末，颈椎脱臼处死大鼠。腹主动脉采血5ml，制备血清置-20℃冰箱。取大鼠右股骨用于测量骨密度和骨钙。1.2检测指标和方法1.2.1骨密度(BMO)测定采用美国HOLOGIC公司双能X线骨矿含量测定仪(DEXA)小动物测量软件在高分辨率模式下对大鼠股骨扫描。仪器精密度CV％在0.36-1，准确度CV％为0.49-0.661.2.2统计学处理所有资料均输入微机，用spss7.0和windows软件包处理1.3结果雌激素对照组、葛根总黄酮组、葛根素组、假手术组的骨钙和骨密度(BMD)显著高于去卵巢对照组。差异有显著意义(P＜0.05，见表3)，而葛根总黄酮组、葛根素组与雌激素组比较差异无显著性。(p＞0.05)表3各组大鼠骨钙和骨密度(x±s)组别n骨钙(mmol)BMD(g/cm2)体重d雌激素126.63±0.801a0.330±0.019a353.70±14.75葛根总黄酮116.12±0.607abc0.315±0.012acb343.70±35.70葛根素116.23±0.764abc0.319±0.029acb329.90±29.63假手术126.49±0.672ab0.321±0.021ab353.00±37.51模型空白105.01±0.4820.258±0.016320.80±41.97a与模型空白组比较p＜0.01b与雌激素组比较p＞0.05c与假手术组比较p＞0.05d各组间比较经方差检验p＞0.05(二)体外实验1.材料与方法1.1材料人成骨样细胞系MG-63细胞购自美国培养物保存中心(ATTCC，CRL-1427)；葛根总黄酮由广州中医药大学新药中心提供；葛根素由中国生物制品检定所提供。ProteinAssayDye(Bio-RadLaboratories，Richmond，CA)；3-4，5dimethylthioazol-2yl-2，5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)，ρ-nitro-phenylphosphatesubstratetablet，BSA雌二醇(B-estradiol)以及二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma(St.Louis，MO)；组织培养基，抗生素以及牛血清均购自Invitrogenlifetechnology(GrandIsland，NY)1.2实验分组实验分为空白对照组；雌二醇对照组；葛根总黄酮组；葛根素组。加药浓度分别是雌二醇10-8mol/L，葛根总黄酮、葛根素同样是5×10-6mol/L。1.3方法1.3.1细胞培养条件MG-63细胞培养在MEM培养基，含10％热失活牛血清、青霉素50U/ml、庆大霉素50UG/ML、0.1mM丙酮酸钠，培养箱温度37℃，含5％CO2and95％空气。1.3.2MTT测定细胞种在96孔板(Falcon，BectonDiknsonLabware，NJ，USA)，每孔细胞密度约1×103cells，过夜让细胞贴壁，从第二天开始，连续加药6天，加药之前更换培养液。每加药24小时后取样，样品进行MTT测定。要测定的样品在无牛血清的培养液再培养24小时后，每孔加0.1mgMTT，37℃培养4小时，每孔加150ulDMSO，在570nm用OpsysMicroplateReader(ThermoLabsystems，MA，USA)测定光密度。实验数据以3次实验的平均值，每次平行做两个孔。1.3.3碱性磷酸酶活性测定细胞种在24孔板(Falcon，BectonDiknsonLabware，NJ，USA)，每孔细胞密度约3×103cells，过夜让细胞贴壁，从第二天开始，连续加药6天，加药之前更换培养液。每加药24小时后取样，所有样品用PBS洗二次，并保存在-80℃冰箱。每孔在室温加200ul细胞裂解缓冲液(0.1％TritonX-100inPBS)，收集细胞裂解液，14000rpm离心5min，上清液用来测定蛋白浓度以及进行碱性磷酸酶活性测定。每100ul样品加100ulρ-nitro-phenylphosphate底物溶液，37℃孵育30min，加100ul2NNaOH终止反应。在405nm用OpsysMicroplateReader(ThermoLabsystems，MA，USA)测定光密度。1.3.4蛋白含量测定以BSA做标准曲线，蛋白浓度用Proteinassaydye测定。碱性磷酸酶活力以Mu/毫克蛋白。实验数据以3次实验的平均值，每次平行做两个孔。1.3.5统计学处理用SPSS9.0软件进行统计学分析，数据以X±S表示。组间比较用方差分析。2.结果在雌二醇、葛根总黄酮、葛根素分别作用下，成骨样细胞的MTT值升高，与空白对照组相比有非常显著差异p＜0.01。而雌二醇、葛根总黄酮、葛根素组间相比无差异p＞0.05。碱性磷酸酶在雌激素、葛根素作用下活性升高，与空白对照组相比差异有显著性p＜0.01；P＜0.05，如表4所示表4雌激素、葛根总黄酮、葛根素对成骨细胞MTT、ALP的影响组别nMTTALP雌激素60.828±0.054*31.5±5.6*葛根总黄酮60.804±0.096*20.07±8.2葛根素60.836±0.079*23.85±6.3△空白对照组60.649±0.08412.56±7.2*与空白对照组相比，P＜0.01；△与空白对照组相比P＜0.05三、实验结果分析与结论葛根总黄酮(Puerarialobataisoflavones，plis)是从野葛根(Puerarialobata(wild)ohwi)中提取的有效成分，主要有效成分为葛根黄素，以往的研究表明有舒张血管、降压、抗心率失常、抗血小板凝集、改善微循环、降血脂、血糖等作用。但其具有雌激素样效应则未见报道。本实验结果提示1.葛根总黄酮在口服给予150mg/kg.d-1与100mg/kg.d-1的剂量时，葛根素在口服给予50mg/kg.d-1时可使血清雌激素水平降低。与空白对照组相比有统计学差异(P＜0.01).推测与反馈性抑制体内雌激素分泌有关。与文献报道的植物雌激素效应相似。2.葛根总黄酮及葛根素在降低血清雌激素水平的同时，却使雌激素作用靶器官之一子宫内膜发生了与雌激素作用相似的组织学改变，即子宫内膜增厚。实验组(低、中与高剂量)与空白对照组相比有统计学差异(P＜0.05)，而高剂量组与雌激素对照组相比无统计学差异(P＞0.05)2.雌性大鼠的卵巢被切除后能较准确地模拟妇女绝经后高转换型骨质疏松的骨丢失以及对各种干预因素的反应。雌激素的降低是骨质疏松的主要原因，补充雌激素可改善去卵巢大鼠的骨质疏松状态。本实验提示葛根总黄酮及葛根素可使去卵巢大鼠的骨钙含量和骨密度增加，体外实验显示可使成骨细胞的MTT值及碱性磷酸酶的活性增加。其作用与雌激素相似。改善骨质疏松的机理与促进成骨细胞的增殖有关。图1是本发明的葛根总黄酮的工艺流程图。制备工艺操作过程1.1.药材的提取、过滤取葛根100Kg，置多功能提取罐中，加药材量6倍的80％乙醇浸泡约30min，加热回流提取3次，每次各1h，过滤(滤材为80目尼纶布)，收集滤液，于室温放置24h后，取上清液用板框压滤机过滤(滤材为滤纸)，收集滤液，置洁净容器中保存，容器外贴标签，注明品名、批号、件数、重量、日期等。1.2.真空浓缩取上述滤液，置真空浓缩器中回收乙醇并浓缩至相对密度为1.05～1.10(60℃热测)，，浓缩液置洁净容器中保存，容器外贴标签，注明品名、批号、件数、重量、日期等。真空浓缩工艺参数真空度为0.04Mpa，温度＜80℃；1.3.提取物的干燥取上述稠膏按比例，用真空干燥箱加热至80℃干燥，得干浸膏，干浸膏用万能磨粉机粉碎成100目粉，置洁净密闭容器中保存，容器外贴标签，注明品名、批号、件数、重量、日期等。真空干燥工艺参数干燥温度为＜80℃，真空度0.04Mpa。1.4提取物的标化取上述稠膏粉，用紫外分光光度法测定含量，用淀粉调整总黄酮含量在40％，混匀，置洁净密闭容器中保存，容器外贴标签，注明品名、批号、件数、重量、日期等。权利要求1.一种植物雌激素，其特征在于葛根总黄酮至少1mg/每公斤人体重。2.根据权利要求1所述的植物雌激素，其特征在于葛根总黄酮1至3mg/每公斤人体重。3.一种权利要求1所述的植物雌激素，其特征在于葛根素至少0.5mg/每公斤人体重。4.根据权利要求3所述的植物雌激素，其特征在于葛根素0.5至3mg每公斤人体重。全文摘要本发明涉及一种医用植物雌激素。其主要特征在于葛根总黄酮至少1mg/每公斤人体重。其作为化学雌激素的替代物，既安全又有效。可以作为药品也可以作为保健品。文档编号A61P15/08GK1593443SQ0314046公开日2005年3月16日申请日期2003年9月9日优先权日2003年9月9日发明者黄少华,姚红,苏子仁,温娜申请人:黄少华,姚红,苏子仁