专利名称：油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途的制作方法
专利说明油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途 本发明涉及一种油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途。肿瘤细胞多药抗药性是目前悬而未决的问题，直接影响肿瘤病人的治疗效果和预后。目前临床仍没有哪一个药物能真正克服多药抗药性。
油菜素内酯Brassinolide(以下简称BL)是迄今最新型、最具生物活性的植物生长调节剂，化学名称为(22R，23R，24R)-2α，3α，22，23-四羟基-β-均相-7-氧杂-5α-麦角甾烷-6-酮。最初于上世纪70年代由美国科学家Mitchell从油菜花粉中提出，是一种甾体物质，其生物活性较其他植物生长调节剂强1000倍，在0.02-0.03PPM的极低浓度下即有明显效力。它来自植物花粉，仿生合成过程可靠，故无毒。作为植物刺激素具有高效、广谱、抗逆性强、低毒、安全等优点，很快引起各国科学家注意，被誉为植物第六激素。八十年代先是日本，随后中国完成了仿生合成。油菜素内酯含多种生长调节剂、微量元素、氨基酸、内源性植物激素等。目前用于农业生产。
多药抗药性是指肿瘤细胞不仅对一个抗癌药物产生抗药性，而且对其他结构不同，作用机理各异的抗癌药同时产生抗药性。多药抗药性是肿瘤化学治疗失败的主要原因，严重影响肿瘤病人的治疗和预后。国内外有关克服肿瘤细胞多药抗药性的研究已有20多年，但迄今为止，还没有一个药物能真正有效逆转肿瘤的多药抗药性。本发明的特征为一种油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途。油菜素内酯具有很强的生物活性，安全，无毒，油菜素内酯在本身没有抑瘤作用的很低浓度下，有效地逆转高度耐药的肿瘤细胞耐药性。
本发明能发展一个有效的多药抗药性逆转剂，从而达到化疗增敏作用、造福病人，并产生经济和社会效益。
图1为天丰素对罗丹明累积的影响。
图2为天丰素对拓朴异构酶-II(TOPO-II)催化活性的影响。
图3为天丰素对敏感株和耐药株细胞P53，P21蛋白表达的影响。实验方法细胞株CCRF-VCR1000是用长春新碱(VCR)诱导MDR的人T淋巴母细胞样白血病细胞株，其相应的敏感株为CCRF-CEM。采用MTT法测定CCRF-VCR1000细胞的耐药因子及BL作用后对耐药性的逆转倍数。采用流式细胞仪测定敏感株、耐药株细胞对经P-170糖蛋白转运的荧光染料罗丹明123(Rhodamine123)的积累，及经BL处理后，耐药株细胞内染料积累的改变。根据Sulliven方法，测定细胞拓扑异构酶II(TOPO-II)催化活性，了解BL作用后对TOPO-II催化活性的影响。用Western blot方法检测敏感细胞与耐药细胞P53，P21蛋白表达以及BL的影响。
结果CCRF-VCR1000细胞的耐药性测定CCRF-VCR1000细胞对阿霉素的IC50值为8942ng/ml，其前体敏感株CCRF-CEM细胞对阿霉素的IC50值为58.4ng/ml，CCRF-VCR1000细胞对阿霉素的耐药倍数为153.1倍。
CCRF-VCR1000细胞对VP-16的IC50值为11408ng/ml，其前体敏感株CCRF-CEM细胞对VP-16的IC50值为204.1ng/ml，CCRF-VCR1000细胞对VP-16的耐药倍数为55.9倍。
CCRF-VCR1000细胞对VCR的IC50值为36554ng/ml，其前体敏感株CCRF-CEM细胞对VCR的IC50值为4.5ng/ml，CCRF-VCR1000细胞对VCR的耐药倍数为8123.1倍。
BL对CCRF-CEM细胞、CCRF-VCR1000细胞的细胞毒作用BL在0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1.0μg/ml和10.0μg/ml浓度下对CCRF-VCR1000细胞均无细胞毒作用。在100μg/ml浓度时对敏感株细胞抑制率58.9％，对耐药株抑制率为40.4％。
BL对CCRF-VCR1000细胞耐药性的逆转作用BL在0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml，1.0μg/ml和10.0μg/ml浓度下使CCRF-VCR1000细胞对VCR的耐药性逆转，逆转倍数分别为4.0、4.6、7.2、7.5、和11.6倍。
BL对CCRF-VCR1000细胞Rhodamine123积累的影响在无BL的情况下，敏感株CCRF-CEM细胞在两小时内Rhodamine123积累随时间而逐渐增加，耐药株CCRF-VCR1000细胞的Rhodamine123积累明显减慢，差别显著，耐药株CCRF-VCR1000细胞经10μg/ml BL处理24小时后，流式细胞仪测定结果表明，Rhodamine123在细胞内的积累增加，向敏感株CCRF-CEM的图形靠拢(图1)。
BL对敏感株和耐药株细胞拓扑异构酶II(TOPO II)催化活性的影响TOPO-II催化活性测定结果表明，耐药株、敏感株以及经BL处理后的耐药株，三者的TOPO-II催化活性均无明显差别(图2)。
BL对敏感株和耐药株细胞P53，P21蛋白表达的影响耐药株P53表达明显增强，经10.0μg/ml的BL处理24小时的耐药株细胞的P53蛋白表达水平恢复到敏感株水平。在本实验条件下未测到P21蛋白的表达(图3)。
结论油菜素内酯仅在高浓度显示一定程度细胞毒作用，但在无细胞毒浓度作用下，能有效逆转CCRF-VCR1000对VCR的耐药性。
油菜素内酯抑制耐药株CCRF-VCR1000细胞膜的P糖蛋白对药物的外排，同时使CCRF-VCR1000细胞异常的P53蛋白表达水平恢复到接近敏感细胞水平。对异常表达的P53的下调可能是油菜素内酯逆转多药抗药性机制之一。
权利要求
1.一种油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途，其特征为油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途。
全文摘要
本发明涉及一种油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途。其特征为油菜素内酯逆转肿瘤细胞多药抗药性的新用途。油菜素内酯具有很强的生物活性，安全，无毒，油菜素内酯在本身没有抑瘤作用的很低浓度下，有效地逆转高度耐药的肿瘤细胞耐药性。
文档编号A61K31/58GK1491653SQ03140318
公开日2004年4月28日 申请日期2003年8月28日 优先权日2003年8月28日
发明者冼励坚, 曹弃元, 李永强, 孙健, 刘然义 申请人:中山大学肿瘤防治中心