Ang-2及其基因在制药中的应用的制作方法

专利名称：Ang-2及其基因在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及Ang-2的用途，尤其涉及在制药领域中的应用。
背景技术：
淋巴管的新生或再生是一种常见的病理改变，见于多种疾病，如慢性 淋巴水肿，组织创伤，器官移植及胂瘤生长和转移。由于淋巴管的再生机 理至今不明，目前对于病理性淋巴管生长相关的病症几乎没有治疗和控制 手段。因此，阐明淋巴管的生长机理是临床须待解决的难题。
血管生成素Angiopoietins (Ang-1和Ang-2)/Tie2是新近发现的生 长因子家族，它与VEGFs/VEGFRs家族共同调节血管的发育和再生。Tie2 受体分布在内皮细胞表面。Ang-l和Ang-2与Tie2受体酪氨酸激酶结合。 Ang-1是Tie2的激动剂， 一般情况下Ang-2是Tie2的阻抗剂，但是在某 些情况下(如VEGFs存在时)Ang2启动血管再生，也参与新生血管的再 塑形(remodel ing )。
过去IO年来有关炎性血管生长的研究有大量的报道，包括炎症诱导 血管生长的机理和可能的抑制手段。新近发现Ang-2在炎症的发生中起 关键的催生作用，Ang-2增加血管内细胞(Blood Endothelial Cells, BECs) 对炎性因子的敏感性。与血管相邻的淋巴管的生长与炎症的关系却没有受
3到应有的关注，Ang-2在其中的作用更是空白。实际上淋巴系统参与了炎 症发生发展的全过程，包括炎症的启动，水肺的消退，白细胞的游走等。 从这个意义上说，炎症需要淋巴管生长。那些有淋巴管新生或再生等病理 改变的疾病，如慢性淋巴水肿，组织创伤以及肿瘤等都伴有不同程度的炎 症。临床上淋巴管扩张型淋巴水肿肢体多伴有频发的组织感染，病程发展 快,致残类高。炎症通过何种机制诱导或激发淋巴管生长还不清楚。

发明内容
本发明的目的在于
(1) 提供Ang-2在制备治疗或预防体内外炎性淋巴管生长疾病药 物中的应用。
(2) 提供Ang-2基因在制备治疗或预防体内外炎性淋巴管生长疾 病药物中的应用。
(3) 提供Ang-2在制备治疗或预防机体淋巴管及周围组织炎症疾 病药物中的应用。
(4) 提供Ang-2基因在制备治疗或预防机体淋巴管及周围组织炎 症疾病药物中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的对慢性肢体淋巴水肺组 织作相关基因的检测，发现在淋巴管增生型病变组织中Ang-2的mRNA异 常增高，原位杂交显示Ang-2转录子在扩张淋巴管管腔表面大量表达。但 是Ang-l的表达则与正常组织无差异。Ang-2对病变组织中淋巴管的增生起作用，引发或促进了淋巴管的增生和扩张。
用人皮肤毛细淋巴管内皮细胞(LECs )和淋巴管缺损动物模型进行实 验,发现Ang-2单独作用时对LEC的增殖和体内淋巴管的生长并没有直接 促进作用。Ang-2对淋巴管生长的影响是间接的，或者还有其他因素介入。
淋巴管扩张性病变与Ang-2的表达增高和组织中的炎症之间可能存 在关联，并用实验进行验证。结果如下细胞增殖实验我们先单用炎性 因子处理人皮肤LECs和BECs，结果BECs的显著增殖，LECs的生长却受 到明显抑制。随之我们将Ang-2重组蛋白与炎性因子共同加入处理液，得 到结果LECs的增殖不仅未受抑制，反而显著提高，而BECs的增长却受 到抑制。以VEGF-C为对照的结果显示，VEGF-C单独使用时对LEC和BEC 的增殖均有明显的促进，但是VEGF-C与炎性因子联合使用则没有增殖作 用。细胞迁移试验Ang2单独作用时对LECs迁移其没有直接促进作用. 在炎性因子(TNFoc )介导下Ang2能够促进LECs的迁移，VEGF-C对LECs 和BECs有明显的促进迁移作用，而Ang2对其没有直接促进迁移作用。在 炎性因子(TNFa )介导下Ang2促进LECs毛细管的形成的数量和速度。 体内研究发现在炎性因子存在时，Ang2基因能促i^j部淋巴管生长，数 目增多并扩张。
关于Ang-2及其基因在制药中的应用技术方案如下 Ang-2在制备治疗或预防体内外炎性淋巴管生长疾病药物中的应 用。所述的疾病是淋巴水肿或肿瘤淋巴道转移或器官移植后的排斥性疾 病。Ang-2基因在制备治疗或预防体内外炎性淋巴管生长疾病药物中的应 用。所述的疾病是淋巴水肺或肺瘤淋巴道转移或器官移植后的排斥性疾病。Ang-2在制备治疗或预防机体淋巴管及周围组织炎症疾病药物中的应 用。所述的疾病是淋巴循环障碍相关的感染或细菌，霉菌和其它微生物引 发的淋巴系统及周围组织炎症疾病。Ang-2基因在制备治疗或预防机体淋 巴管及周围组织炎症疾病药物中的应用。所述的疾病是淋巴循环障碍相关 的感染或细菌，霉菌和其它微生物引发的淋巴系统及周围组织炎症疾病。 本发明所公开Ang-2及其基因在制药中的应用，其优点表现在
(1) 本发明对Ang-2发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
(2) 本发明首次提出淋巴管生长不是单一因素决定，是多种因子综 合作用的结果，VEGF-C, Ang-l和Ang-2都参与其中，但作用不同。首次 证实Ang-2与其它的生长因子(特别是VEFD-C)不同，它不是淋巴管内 皮细胞增殖和淋巴管生长的直接作用因子，而是间接的作用因子。首次证 实Ang-2能"激发"或"扭转"LECs对炎性因子的反应，改变炎性因子 对LEC的抑制作用，转而促其增殖。提出和验证了 Ang-2是病理性炎性淋 巴管生长的关4定调节因子这一新论断。
(3) 本发明中淋巴管生长是常见的病理表现，与多种重大疑难疾病， 如淋巴水肿，肿瘤淋巴道转移，器官移植等密切相关，因此探明和调控淋 巴管的生长对于治疗淋巴循环障碍疾病，减少肺瘤死亡率，降低器官移植 的排斥等重大医学课题均有不可估量的影响。Ang-2作为病理性淋巴生长 的重要调控因子在淋巴管生长相关疾病的发生和发展中起关键的调节作 用。根据此理论，用任何手段(抗体，拮抗剂，短链RM，多肽制剂等) 降低或抑制Ang-2的表ii/人而达到减轻或控制由淋巴循环障碍相关的感
6染或细菌，霉菌和其它微生物引发的淋巴系统及周围组织炎症；控制和调 节与炎症相关的淋巴管生长，如淋巴水肿，肿瘤淋巴道转移，器官移植后 的排斥；治疗淋巴管缺损性病变，促进淋巴管生长，减轻或消除淋巴性水 肺。因此，其社会效益和经济效益是巨大的。


图1显示RT-PCR检测淋巴管扩张型肢体淋巴水胂皮肤病理组织和 正常人皮肤组织中Ang2和VEGF-C的表达。淋巴管扩张型肢体淋巴水胂 皮肤病理组织中Ang2和VEGF-C的表达较正常人皮肤组织明显增高，统计 学检验有显著差异(* p<0. 05 )。
图2显示Western Blot检测人皮肤组织中Ang2和VEGF-C蛋白的 表达。淋巴管扩张型病人的病变皮肤组织表达Ang2和VEGF-C较正常人下 肢皮肤组织明显增高。1, 2:淋巴管扩张型病人的病变皮肤组织；3, 4: 正常人下肢皮肤组织。
图3显示细胞增殖实验(MTT)显示不同的因子对LECs的增殖具 有不同的作用。其中FGF、 VEGFs和PDGFbb具有显著的促LECs增殖作用， 而缺氧条件和Ang2对LECs没有促增殖作用。
图4显示小鼠尾部慢性阻塞性淋巴水肺模型手术方法建立。
图5显示转基因治疗鼠尾淋巴水肿后质粒注射部位皮肤组织免疫 组化结果。各个实验小鼠尾部的质粒注射部位皮肤组织切片后进行免疫组 化染色，以淋巴管内皮细胞特异性标志LYVE-1来标记淋巴管。A， B， C, D, E (x100)分别4、表生理盐水组、转EGFP组、转VEGF-C组、转Ang2组和Ang2+VEGF-C共转组。转VEGF-C组和Ang2+VEGF-C共转组的切片中 淋巴管的数目较阴性对照组明显增加，而且还可以观察到为数不少的细小 新生淋巴管，有些新生的淋巴管在高倍显孩t镜-见野下呈现单细胞结构(F， x400 )。转Ang2组的组织切片中淋巴管的数目与阴性对照组无明显差别， 也观察不到新生的细小淋巴管。G显示了不同基因治疗对緩解尾部水肿效 果的差别。
图6显示转基因治疗鼠尾淋巴水肿后尾部皮肤组织切片中淋巴管 计数的结果。转Ang2组与阴性对照组无显著差别，转VEGF-C组和 Ang2+VEGF-C共转组的鼠尾皮肤组织切片中淋巴管的数目较阴性对照组 明显增多，统计学4企-睑有显著差别(n=3， *p<0. 05 )。
图7显示Ang-2对LEC和BEC的增殖均无促进作用；炎性因子抑制 LEC生长，促进BEC生长；Ang-2与炎性因子共同作用明显促进LECs增殖， 对BECs生g作用不明显。(n>6, *p<0. 05)。
图8显示Ang2能够在炎性因子(TNFct )介导下促进LECs的迁移， VEGF-C对LECs和BECs有明显的促进迁移作用，而Ang2对其没有直接促 进迁移作用。(n=5， **)。
图9显示棵鼠注射及电穿孔电极安置。
图10显示EGFP - pcDNA3. 1质粒注射2W。
图11显示淋巴管LYVE1 - DAB显色(2W取材)A为EGFP质粒对照 组；C为单纯Ang2质粒注射组；Ang2和炎性因子(TNFa )作用下淋巴管 数目和管径增大(B ); D为TNF a单纯注射组。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。 实施例1
对慢性肢体淋巴水肿组织作相关基因的检测 材料和方法
1.人慢性淋巴水肺组织中Ang-2mRNA和蛋白质的表达 (1) Ang-2mRNA提取和检测方法采取人慢性淋巴水肿下肢皮肤组织约 50毫克，加入Trizollml, 4。C下剪碎，匀浆机研磨，收集液体至1. 5ml 离心管中。加入氯仿400jul，充分混匀，离心；加入等体积的异丙醇， 离心后加入含O. Ol仰EPC的75。/。乙醇lml洗涤，离心，弃上清，滤纸吸干 管口，室温风干5分钟后，加入0. 01°/。DEPC水20ju 1溶解RNA;核酸分析 仪检测OD^/OD28。比值，确定浓度和纯度。 -逆转录反应(RT ):'
配制20jdl反应体系25mM MgCh 4ju 1, 10 x逆转录緩沖液2 jn 1 ， lOmM dNTP 2 |i 1， 40U/ ju 1 RNase抑制剂0. 5 |a 1, 5U/ ja 1 AMV逆转录酶 lpl, 200ng/|i 1 01 igo dT-Adaptor Primer 1 ju 1，隨2jng，力口无RNase 水至20iul。反应条件为30°C 10分钟，42°C 60分钟，99°C 5分钟，5 °C 5分钟。反应产物cDNA置-2(TC保存。 -聚合絲式反应(PCR):
PCR反应体系为ddH20 12. 25 jlU, 25mM MgCl2 1. 6 ja 1， lOx逆转录 緩沖液2 1， lOmM dNTP 0. 5 |u 1， 5U/ ja 1 Taq酶0. 25 m 1，细胞RT反应产物2. 5 jli 1， 20pmol/|i 1人Ang2或人VEGF-C特异的上下游引物
Ang2: sence: 5' -GCCAGCAACACTACCACA-3 ' antisence: 5'
-ACATTCACAGGCACATTTT-3' (400bp);
VEGF-C: sence: 5' -TAAACATCCCAGTCCACC-3' antisence: 5'
-TCTTGCTTTGGTCCGTTA-3，(250bp).]各0. 3 y 1。 20pmol/jLil人p-actin
上下游引物各O. 15|a 1。反应条件为95°C 4min变性；95°C 30s、55。C(人
Ang2)或58°C (人VEGF-C ) 30s、 72°C 30s为一个循环，共35个循环；
72。C延伸lOmin。
-Western blot才企观'J (1 )样品制备
分别取肢体淋巴水肿病人皮肤组织2例和正常肢体皮肤组织2例各 lOOmg,剪碎置三去污剂裂解緩沖液，冰箱内澎润过夜，lO，OOOg匀浆1 分钟x2-5次，10, 000gx5分钟，4。C离心，取上清液，并加入等体积2 x SDS Loading buffer, P -石克基乙醇2ul (100 |a 1) ， 100。C沸水浴变性10 分钟，瞬时离心2秒钟，冷至室温。 (2)电泳和转膜
用8%分离胶,配方是30%: 0. 8% ( AA: Bis ) 2ml; 4xTris HC1 pH8. 8 1.9ml; ddH20 3.5ml; 10°Mp50|al; TEMED10jul，约20-30分钟凝固后 再轻轻洗上一层4°/。积存胶:30%: 0. 8%( AA: Bis )0. 7ml， 4xTris -HC1 pH6. 8 1.25ml; dd H20 3 ml; 10%Ap25|ul; TEMED 5ul。每孔加入样品液40 p 1 ， 空白孑L力口入1 x SDS Loading buffer。 10mA电流/块胶，电泳3-4小时 电泳结束，卸下凝胶，放在saram保险膜上，置转移緩沖液(25mM Tris碱，192mM甘氨酸和20y。曱醇)中。同步按尺寸大小剪好滤纸，硝酸纤维素 膜一并浸入转移緩冲液平衡15分钟。将转膜仪置转移槽内，槽内倒入转 移緩沖液，靠负极白色槽内加入冷却冰块、盖实，90V电压，4。C转移2 小时。
(3) 杂交
转移膜置10ml Blocking buffer 4。C封闭过夜。用Blocking buffer 稀释一抗(兔抗人Ang2 1:200,兔抗人VEGF-C 1: 500 )置冰浴中备用， 弃去Blocking封闭液，倒入一抗液37。C杂交2小时，用washing buffer 清洗三次，每次10ml， 37。C轻摇5分钟。用Bloking buffer稀释生物素 化二抗(1:10000 )， 一抗杂交洗涤完毕后加入二抗杂交液，37。C摇床，温 和4展荡1小时。二抗杂交结束，弃去杂交液，用washing buffer洗三次， 每次10ml， 37。C轻摇5分钟。用Blocking buffer稀释三抗(1:20000 ), 置冰浴中备用(三抗液为Avidx-Ap液)。二抗杂交洗涤后，加入Avidx-Ap 三抗液，37。C摇床，温和振荡40分钟，再用washing buffer洗涤3-5 次，每次20ml， 37。C摇床，温和振荡5-10分钟。
(4) 显色
NBT/BCIP显色液避光显色5min，充分水洗后扫描、采用天能凝胶处 理软件分析平均灰度比值。 结果
慢性肢体淋巴水肿淋巴管增生型病变组织中Ang-2的mRNA异常增高 (图l)。 VEGF-C ( vascular endothelial cell growth factor 口C) 的 表达也比正常组织高。但是Ang-1的表达则与正常组织无差异。Ang-2蛋
ii白质在淋巴管扩张性淋巴水肺组织中的表达也明显高于对照组(图2)。 Ang-2对病变组织中淋巴管的增生起作用，引发或促进了淋巴管的增生和 扩张。 实施例2
人皮肤毛细淋巴管内皮细月包(lymphatic endothelial cells LECs ) 和淋巴管缺损动物模型实验 材料和方法
1. 人皮肤毛细淋巴管内皮细胞(ly即hatic endothelial cells LECs ) 的分离培养
LECs取自幼儿包皮环切术的皮肤。具体方法将包皮环切术后的幼 儿包皮剪成2 x 10mm2长条状，以2. 4u/ml Dispase于4。C冷消化过夜，揭 去表皮。将真皮剪成1 x 2mi^大小后置50ml离心管中，加0. 1°/。胶原酶(用 无血清DMEM培养基配制)于37。C震荡消化2-3小时。消化结束后细胞悬 液以400目金属滤网过滤，1500rpm离心5分钟，弃去上清，收集细胞。 通过免疫磁珠CD34抗体阴性分选和CD31抗体的阳性分选得到LECs,接 种于用纤维粘连蛋白铺底的六孔板中，置37。C， 5%0)2条件下培养。LECs 原代细胞用含10ng/ml VEGF的完全内皮细胞培养基于5%C02、饱和湿度、 37。C恒温孵育，不加抗生素。细胞每5-6天换液一次。细胞生长到90%融 合后，0. 05%的胰蛋白酶消化，1: 2传代，传代后的细胞用不含VEGF的 完全内皮细胞培养基培养。
2. LECs细胞增殖实-险
LECs接种于细胞培养池中培养，接种数量5xl()4个，置37。C， 5%C02条件下培养48小时后MTT法测定细胞增殖情况。检测时，将细胞培养池 移至新的6孔板中，每孔加入含2%血清的EBM 2ml以及MTT溶液(5mg/ml ) 200 nl, 37。C继续孵育4小时后终止培养，吸去孔内培养上清液。每孔加 入1.5mlDMS0，振荡IO分钟，使结晶物充分溶解。每孔吸取200 jli 1液体 移至96孔板中，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收 值，记录结果。不同标本来源的细胞重复实验3次，每次每组重复3孔。
3. 淋巴管缺损动物模型的制备和实验 取5周龄的雌性Balb/c小鼠，称重后以速眠新肌肉注射麻醉，尾部
75%酒精消毒，测量距尾跟部2cm处尾巴直径。在距尾跟部lcm处环行切 除尾巴皮肤约3腿，同时将深筋膜去除。于尾尖皮内注射用生理盐水l: 5 稀释的亚曱基兰注射液0. lml，观察皮肤切除部位与两侧尾部血管伴行的 淋巴管显色。将显露的淋巴管切除，断端与创缘皮肤均进行烧灼以防止淋 巴管再通。手术创口凡士林纱布包扎，定期观察愈合情况以及尾部水肿情 况，待创口愈合后再次测量距尾跟部2cm处尾巴直径。
4. 质粒局部注射治疗小鼠尾^^巴水肿
(1)构建Ang2和VEGF-C以及绿色荧光蛋白目的基因 pCDNA3. 1 (+) -EGFP质粒的构建和制备 1目的基因的亚克隆
用Not I 、 HindIII双酶切带有人EGFP基因的pEC质粒(上海市组织 工程研究所提供)，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，获得2. 3kb大小的 EGFP目的基因片段。同样用Not I 、 HindlII双酶切pcDNA3. l质粒(购于 Invitrogen公司，美国)，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，收获约5. 4Kb
13大小的pcDNA3. 1质粒载体片段。在紫外灯下切取目的基因和pcDNA3. 1 栽体片段，将凝胶块置于2. Oml塑料离心管中，称重(每100mg胶约相当 于100 jli 1体积)，以DNA凝胶回收试剂盒进4于回收纯化加入3倍体积的 QG， 50。C水浴10min;待凝胶充分溶解后加入等体积异丙醇，混匀。将液 体倒入QIAquick吸附柱中，10000rpm室温离心lmin;弃去废液，加入 500jLilQG, 10000rpm离心lmin;弃去废液，加入750 y 1 PE,静置5 min， 再离心lmin。将吸附柱》文入清洁无菌的1.5ml离心管中，在柱中央加入 20jul EB;静置5 min后，10000rpm离心lmin;收集离心液，核酸分析 仪测OD26。/OD28。比值。按照载体与待扩增DNA片断的摩尔比为1: 4设计 10 |i 1连接体系4 ja 1目的DNA片断，1 M 1 pcDNA3. 1载体，1 ju 1 T4DNA 连接酶，liallOx緩沖液，3jLil无菌去离子水。混匀后，室温连接2hrs, -20。C保存备用 2感受态细菌的制备
平板上DH5oc新鲜菌落接种至5ml LB培养基中，37°C、 300rpm振荡 过夜。取过夜菌液20p 1至5ml LB培养基中，37°C、 300rpm振荡培养至 对数生长期(约3-4hrs)。取lml菌液，冰浴10min; 4。C、4000g离心10min， 弃上清；加入500jli1预冷10mM的CaCl2重悬细菌，冰浴20min; 4"C、 4000g离心10min，弃上清；100 ju 1预冷lOmM的CaCl2重悬细菌；4。C冰 箱中放置18 hrs后使用，或-20。C保存备用。 3连接产物的转化
连接产物3 p 1加入100 ju 1感受态细菌中，混匀，水浴30 min; 42 。C水浴热休克1. 5min,冰浴30min;加SOC培养基900jul， 37°C、 300rpm振荡lh;取lOOp 1菌液均匀涂于含氨千青霉素100Mg/ml的LB琼脂平 板上，稍干后，37。C正放lh，倒置培养12-16hrs。 4质粒的小量制备
从平板上挑取数个单菌落至3ml LB培养基(含氨苄青霉素100 n g/ml)中，37°C、 300rpm振荡培养过夜。取2ml菌液，4°C、 10000rpm离 心3min,弃上清；加入250 jli 1 Pl ，彻底振匀，重悬细菌沉淀，室温静置 10min;加入250 |i 1预温的P2,温和颠倒混匀5-IO次，室温静置4min; 加入350 jli 1预冷的P3,温和颠倒混匀5-10次，室温静置lmin; 12800rpm 离心10min，将上清液倒入另一清洁离心管中，12800rpm再离心10min; 将上清液倒入华舜吸附柱中，室温10000rpm离心15s;倒去离出液体； 在吸附柱中加入500jli 1 Bl,同条件离心15s,倒去离出液体；加入500 plWl，静置lmin后，离心15s，倒去离出液体；重复上一步骤一次后， 倒去离出液体，再以12000rpm室温离心lmin;将吸附柱》文入清洁无菌的 1.5ml离心管中，在柱中央加入50ju 1 Tl;静置5min后，10000rpm离心 lmin;收集离心液，核酸分析仪测0026。/0028。比值后，-20。C保存备用。 5酶切鉴定
取小量制备的pcDNA3. 1-EGFP重组质粒，用Not I 、 HindIII双酶切。 酶切产物1%琼脂糖电泳检测，天能皿分析仪观察。 6菌种保存
根据测序鉴定结果，将正确连4妄菌落的相应菌液850 ja 1与100%甘油 150jil彻底混勻，-80。C保存。
7 FuGENE6介导pCDNA3. 1 (+) -EGFP质粒DM转染COS7细月包按照FuGENE6与pCDNA3. 1 (+)-EGFP质粒DNA的体积与质量比为3: 1 i殳定转染体系。即在无血清的DMEM600 pl中加入FuGENE6 20 jul，质 粒DNA6iag。轻轻混匀，室温静置30分钟后均勻滴加至上述细胞中。转 染24小时后于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。 pcDNA3. 1-Ang2的制备方法
1 Ang2 ( Genbank NM_ 001147 )基因cDNA的获取>^皮肤成纤维细胞 提取总RNA,应用RT-PCR方法成功克隆Ang2基因cDNA。取第一代成纤维 细胞，Trizol法进行RNA抽提。25mM MgCl2 4 ju 1， 10 x逆转录緩冲液2 y 1, 10mM dNTP 2 jn 1， 40U/ /a 1 RNase 4中制剂0. 5 |a 1, 5U/ ju 1 AMV逆4争 录酶ljnl， 200ng/jal Oligo dT-Adaptor Primer RNA2jug,力口无
RNase水至20ju 1。反应条件为30°C IO分钟，42°C 60分钟，99°C 5分 钟，5°C 5分钟。聚合酶链式反应(PCR):人Ang2上游引物5， -GCCAGCAACACTACCACA-3'下游引物5， -ACATTCACAGGCACATTTT-3，；人 P-actin上游引物5， - ATCATGTTTGAGACCTTCAA-3，；下游引物5，-CATCTCTTG CTCGAAGTCCA-3， 。 PCR反应体系为:ddH20 13. 2pl， 25mMMgCl2 1.6 Ml, 10x逆转录緩沖液2p 1， lOmM dNTP 0.5 jul, 5U/p 1 Taq酶0. 5jal， cDNA1.0ial， 20pmol/pl目的基因上下游引物各0. 3 1.反应条件 为95。C变性5分钟；95。C30秒、55。C30秒、72°C30秒为一个循环，共 35个循环；72。C延伸10分钟。电泳、图象分析PCR产物10 p 1经1. 2% 琼脂糖，70V电压电泳1.5小时后，进4亍图象分析。 2克隆目的基因选用的pcDNA3.1 (+)质粒载体(购于Invitrogen 7> 司，美国)为一种真核高校表达载体。将目的基因应用EcoRl酶切，酶切产物经ly。琼脂糖凝皎电泳后，获得2. 3kb大小的Ang2目的基因片段。同 样用EcoR I酶切pcDNA3. 1质粒(受体)，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳 后，收获约5.4Kb大小的pcDNA3. l质粒栽体片段。在紫外灯下切取目的 基因和pcDNA3. 1载体片段，将凝胶块置于2. Oml塑料离心管中，称重(每 100mg胶约相当于100 m 1体积)，以dna凝月交回收试剂盒进行回收纯化 加入3倍体积的QG， 50。C水浴10min;待凝胶充分溶解后加入等体积异丙 醇，混匀。将液体倒入QIAquick吸附柱中，10000rpm室温离心lmin;弃 去废液，加入500ju 1 QG, 10000rpm离心lmin;弃去废液，加入750 jli 1 PE， 静置5min，再离心lmin。将吸附柱》t7v清洁无菌的1. 5ml离心管中，在 柱中央加入20ja 1 EB;静置5min后，10000rpm离心lmin;收集离心液， 核酸分析仪测OD26。/OD28。比值。按照栽体与待扩增DNA片断的摩尔比为1: 4 i殳计10 m 1连4妄体系4 )i 1目的DNA片断，1 ja 1 pcDNA3. 1载体，1 m 1 T4DNA连接酶，ljLil 10x緩沖液，3jlU无菌去离子水。混匀后，室温连 接2hrs, -2(TC保存备用 3感受态细菌的制备
平板上DH5ot新鲜菌落接种至5ml LB培养基中，37°C、 300rpm振荡 过夜。取过夜菌液20ia 1至5ml LB培养基中，37°C、 300rpm振荡培养至 对凄t生长期(约3-4hrs)。取lml菌液，冰浴10min; 4。C、4000g离心10min， 弃上清；加入500jnl预冷10mM的CaCl2重悬细菌，水浴20min; 4°C、 4000g离心10min，弃上清；100 ju 1预冷lOmM的CaCl2重悬细菌；4。C冰 箱中放置18 hrs后使用，或-20。C保存备用。 4连接产物的转化
17连接产物3m 1加入100m 1感受态细菌中，混匀，冰浴30 min; 42 。C水浴热休克1. 5min，冰浴30min;加SOC培养基9Q0|li1, 37°C、 300rpm 振荡lh;取100 jil菌液均匀涂于含氨爷青霉素lOOjjg/ml的LB琼脂平 板上，稍干后，37。C正放lh，倒置培养12-16hrs。 5质粒的小量制备
从平板上挑取数个单菌落至3ml LB培养基(含氨苄青霉素100 ju g/ml)中，37°C、 300rpm振荡培养过夜。取2ml菌液，4°C、 10000rpm离 心3min,弃上清；加入250julPl，彻底振匀，重悬细菌沉淀，室温静置 10min;加入250 p 1预温的P2,温和颠倒混匀5-10次，室温静置4min; 加入350 ia 1预冷的P3,温和颠倒混匀5-10次，室温静置lmin; 12800rpm 离心10min,将上清液倒入另一清洁离心管中，12800rpm再离心10min; 将上清液倒入华舜吸附柱中，室温10000rpm离心15s;倒去离出液体； 在吸附柱中加入500 m1 Bl，同条件离心15s，倒去离出液体；加入500 julWl，静置lmin后，离心15s,倒去离出液体；重复上一步骤一次后， 倒去离出液体，再以12000rpm室温离心lmin;将吸附柱》文入清洁无菌的 1.5ml离心管中，在柱中央加入50|u 1 Tl;静置5min后，10000rpm离心 lmin;收集离心液，核酸分析仪测OD26。/OD28。比值后，-20。C保存备用。 6酶切和测序鉴定
取小量制备的pcDNA3. l-Ang2重组质粒，用HindIII单酶切。酶切产 物1%琼脂糖电泳4企测，天能凝胶分析仪观察。将酶切鉴定正确的质粒送 上海生工生物工程7>司测序。 7菌种保存根据测序鉴定结果，将正确连接菌落的相应菌液850ju 1与100%甘油 150 y 1彻底混匀，-8(TCM呆存。
8 FuGENE6介导质粒DNA转染C0S7细胞和人皮肤成纤维细胞
质粒DNA转染按照FuGENE6与质粒DNA的体积与质量比为3: 1设 定转染体系。即在无血清的DMEM600 ial中加入FuGENE6 20 jul，质粒 DNA 6pg。轻轻混匀，室温静置30分钟后均匀滴加至上述细胞中。其中 实-验组加入pcDNA3. l-Ang2,对照组加入空白载体pcDNA3. 1质粒。
RT-PCR反应配制20 jn 1逆转录反应体系25mM MgCl2 4 jn 1 ， 10 x 逆转录緩沖液2 ju 1, 10mM dNTP 2 ju 1, 40U/ ju 1 RNase抑制剂0. 5 ju 1, 5U/ ju 1 AMV逆转录酶1 ju 1, 200ng/ m 1 Oligo dT-Adaptor Primer 1 ju 1, RNA2iig,加无RNase水至20 |a 1。反应条件为30°C 10min， 42°C 60min， 99°C 5min, 5°C 5min。反应产物cDNA置-20。C保存。PCR反应体系为 ddH20 12. 25 p 1， 25mMMgCl2 1. 6 ji 1， 10 x逆转录緩沖液2 |a 1 ， lOmM證P 0. 5 jLi 1 ， 5U/ |a 1 Taq酶0. 25 |i 1 ， RT反应产物2. 5 p 1 ， 20pmo1/ ja 1人Ang2 0. 3jal。 20pmol/jul人P -act in上下游引物(序列同上)各O. 15jul。 反应条件为95°C 4min变性；95°C 30s、 55。C30s、 72°C 30s为一个循环， 共35个循环；72°C延伸10min。电泳图象分析PCR产物10 |i 1经1%琼 脂糖，70V电压电泳lh后，用天能凝胶系统拍照、进行图象分析。计算 目的电泳带灰度平均密度与内参照P-actin灰度平均密度的比值，作为 相对灰度值。
Western blot检测分别取基因转染组和对照组COS7细胞各2 x 106， 用4 °C的PBS洗涤2次，加入4 °C的细胞裂解液(15 OmM NaCL， l%Tr i ton-X，
1920rnM HEPES, 10%甘油，1. 5mM MgCL2， lmM EDTA, lmM PMSF， lpg/ml的 le叩印tin及ljug/ml的aprotinin)以裂解细胞，细胞裂解物置冰中 20min, 12000rpm4。C离心20min,取上清，Bradford法测定蛋白浓度，备用。 配制12%分离胶加积存胶至满，插入1. 5mm梳聚合20分钟后，拔梳、清 洗，滤纸吸干加样孔。上样，电泳每孔加入40jn 1蛋白样品。空白孑L内 加入1 x SDS loading buffer。 15mA，电泳3hrs。转膜电泳结束后，卸 下凝胶置于转膜緩冲液中平衡。在转膜仪上由负到正依次平铺海绵、滤纸、 凝胶、硝酸纤维素膜、滤纸、海绵。在转膜仪内4。C、 90V转膜2hrs。封 闭转膜结束后，取出转移膜，置15ml封闭液中封闭1小时。杂交一 抗(兔抗人Ang2 , 1: 200;鼠抗人P-actin 1: 1000 ) 4。C杂交过夜， Washing buffer 10ml 37。C摇洗5min x 3次；HRP二抗(1: 10000 ) 37 。C振摇杂交lh, Washing buffer 10ml 37。C摇洗5min x 3次。 ECL发光，照相。
基因转染细胞上清液中目的蛋白的检测Ang2基因转染后6小时将 细胞培养液更换为含0. 2%BSA的无血清DMEM。每10cm培^m加5ml上述 培养液培养36小时后，收集培养液。设立未转基因组、转pCDNA3. 1空载 体组和阴性对照组。将各组细胞培养上清液分别加入96孔板，每孔各加 入样品100ial，每组重复三孔，实-验组及对照组共四组12孑L, 4。C》文置 过夜。倾去细胞培养上清液，用含0. 5%吐温的PBS洗涤4-6次。每孔加 0. 5%BSA于37。C封闭1小时；倾去封闭液后每孔分别加入一抗(Ang2 1: 200; )50 m1, 37。c反应l小时，洗涤(同前)；加入酶标二抗工作液ioo jal， 37。C反应l小时，洗涤(同前)；加入l: 50DAB100jlU,反应5-10分钟；加入1N硫酸终止反应，混匀。490nm处测吸光值。 pcDNA3. l-VEGF-C的制备方法
1 VEGF-C (Genbank NM— 005429 )基因c舰的获取:
^MvA皮肤成纤维细胞提取总RNA,应用RT-PCR方法成功克隆Ang2基 因cDNA。取第一代成纤维细胞，Trizol法进行RNA抽提。25mM MgCl2 4 ju 1， 10 x逆转录緩冲液2 jli 1， 10mM dNTP 2 u 1， 40U/ jli 1 RNase抑制剂0. 5 5U/m 1 AMV逆專争录酶1 ju 1 ， 200ng/ju 1 01 igo dT—Adaptor Primer 1 jn 1， RNA2 iag，加无RNase水至20 m 1。反应条件为30°C IO分钟，42°C 60 分钟，99。C 5分钟，5。C 5分钟。聚合酶链式反应(PCR ): VEGF-C引物sence: 5， -TAAACATCCCAGTCCACC-3' antisence: 5， -TCTTGCTTTGGTCCGTTA-3'. 各O. 3jul。反应条件为95°C 4min变性；95°C 30s、 58。C30s、 72°C 30s 为一个循环，共35个循环；72°c延伸10min。 pcr产物10 m 1经1. 2%琼 脂糖，70V电压电泳1. 5小时后，用天能凝胶系统拍照、进行图象分析。 将目的基因VEGF-C和载体pcDNA3. 1用EcoRl和Xhol双酶切。酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳后，获得1053bp大小的VEGF-C目的基因片段和5. 4Kb 大小的pcDNA3. 1质粒载体片段。
克隆目的基因、感受态细菌的制备、连接产物的转化、阳性克隆的挑选、 质粒的小量制备、基因测序及鉴定、菌种保存、质粒的大量制备和纯化等 方法均同pcDNA3. l-Ang2的制备方法。
(2 )质粒的大量制备和纯化分别将pcDNA3. 1-Ang2和pcDNA3. l-VEGF-C 菌液500jii 1至1000ml LB培养基中，37°C、 300rpm振荡12-16hrs。菌液 4°C、 6000g离心15min,弃上清；加入10mlPl，彻底振匀，重悬细菌沉淀；加入10ml P2，温和颠倒混匀4-6次，室温静置5min;力口入10ml 预冷的P3，温和混勻，冰浴20min; 4°C、 20000g离心30min,将上清液 倒入另一清洁离心管中，再离心15min;用10ml QBT湿化平衡QIAGEN-tip 500吸附柱；将上清液倒入QIAGEN吸附柱中，待其自然过柱，加入30ml QC， 清洗吸附柱2次；将吸附柱》文入一清洁无菌的离心管中，在柱中央加入 15ml QF,洗脱质粒DNA;收集滴出液体，加入0. 7倍体积的异丙醇，温 和混匀，水浴20min; 4°C、 15000g离心30min;见淡黄色透明斑块，弃 上清，加入5ml室温的70。/。乙醇洗涤DNA， 15000g离心10min;小心弃上 清，室温风干5-10min，加入200jal灭菌生理盐水溶解DNA;核酸分析 仪测OD^/OD28。比值后，-2(TC保存备用，可取适量质粒DNA再次酶切鉴定。 (3 )小鼠尾部慢性阻塞性淋巴水肿模型可以通过手术方法建立(图4 )。 手术中将小鼠尾跟部皮肤环行切除。在亚曱基兰淋巴管显色的帮助下，将 与尾部血管平行走行并显蓝色的淋巴管破坏(A，黄色箭头指示淋巴管)。 小鼠手术后第二天即出现明显的尾部肿胀(C),尾部直径较术前(B)增 大。在成功制作出淋巴水肺模型的小鼠，尾部一直保持明显的水肿，即使 术后一个月左右手术创口已经愈合(D)。将正常鼠尾皮肤切片(E, x40) 与淋巴水肺鼠尾皮肤切片(F， x40)进行比较可以看到后者较前者明显 增厚。将20个已经造成尾部慢性阻塞性淋巴水肺的小鼠随机分为五组， 即生理盐水组、EGFP组、VEGF-C组、Ang2组和Ang2+VEGF-C组，每组4 个，测量并统计各组间鼠尾直径无显著差异。以上各组分别于鼠尾原手术 部位及手术部位远侧端皮内注射0. lml生理盐水、pCDNA3. l-EGFP 100pg、 pcDNA3. 1- VEGF-C 100pg、 pcDNA3. 1- Ang2 100pg和pcDNA3. l-Ang2
22100|ig+pcDNA3. 1-VEGF-C 100卩g。注射时以上质粒均溶解于0. 1ml生理盐 水中。注射进行三次，每次间隔五天，于第一次注射后两周进行各种检观'J。 结果
1. Ang2质粒对LECs体外增殖没有直接的促进作用 我们用多种与内皮细胞增殖相关的细胞因子和低氧条件对LECs进行刺 激，然后以MTT法测定细胞的增殖情况。对照组的吸光度值为1.063 ±
0. 024,与预期结果一致，FGF ( 1.765 ±0.102), VEGF ( 1. 637 ± 0. 058 ) 和特异作用于^^巴管内皮细; 包的VEGF-C ( 1. 573 ± 0. 093 )对细胞的促增 殖作用十分明显(p<0. 01), PDGF-bb (1. 185 ± 0. 079 )也具有促进增殖的 作用(p<0. 05)。但是，虽然Ang2与淋巴管发育和新生相关，但是在体外 Ang2 (1. 067 ± 0. 060)未显示对该细胞有促进增殖的作用(图3 )。
2. Ang2质粒对实验性淋巴水肿没有明显的治疗作用
Ang2质粒注射对实验性淋巴水肺的水肿消除和淋巴管的生长没有明 显的促进作用(图5， 6)。
总之，Ang-2单独作用时对LEC的增殖和体内淋巴管的生长并没有直 接促进作用。Ang-2对淋巴管生长的影响是间接的，或者还有其他因素介 入。
实施例3
淋巴管扩张性病变与Ang-2的表达增高和组织中的炎症之间关联实验
1. LECs细胞增殖实一验LECs和BECs的分离和培养方法同前述。应用同 一批次包皮分离或冻存的同代LECs和BECs，传至3代可用于细胞增殖及 迁移实-睑。我们先单用炎性因子(IL-1 ct, IL-P ， IL-6, TNFoc， LPS(Cytolab)与细胞共培养，观察各自对细胞增殖的作用，然后加入Ang2 (R&D)或VEGF-C (R&D),再检测细胞的变化。具体方法氮标记细 胞增殖实验-胞消化，96孔板，细胞量2000个/孔，接种4小时(贴壁) 后，换含1。/。BSA的EGM2培养液同时加细胞因子，剂量Ang2 ( 200ng/ml), VEGF - C ( 100ng/ml ), IL-1 cc (lng/ml) ， IL- P (lng/ml) ， IL - 6 (lng/ml)， TNFct (25ng/ml)， LPS (100ng/ml )。作用32小时加氖，16小时收氖，测 量统计。
结果单用炎性因子BECs的显著增殖，LECs的生长却受到明显抑制。 但是将Ang-2重组蛋白与炎性因子共同加入处理液后，得到有趣的结果 LECs的增殖不仅未受抑制，反而显著提高，而BECs的增长却受到抑制(见 图7)。以VEGF-C为对照的结果显示，VEGF-C单独使用时对LEC和BEC 的增殖均有明显的促进，但是VEGF-C与炎性因子联合使用则没有增殖作 用。
2. 细胞迁移试验
将LECs和BECs种植于6孔细胞培养;f反S己套的8jim孔径细胞培养池 (Becton Dickinson, USA)，加入含有炎性因子(TNF a )的培养液，置37 °C， 5。/。C02条件下培养16小时后取出细胞培养池行Giemsa染色PBS浸 洗细胞培养池l分钟x3次，曱醇固定20分钟，自然干燥。用Giemsa染 液染色10分钟，蒸馏水浸洗。在相差显微镜下每个细胞培养池随机选取 5个高倍视野计数膜上、下的细胞，以迁移到膜下的细胞数除以膜上下细 胞总数计算细胞的迁移率。不同标本来源的细胞重复实-验3次。
结果Ang2单独作用时对LECs迁移其没有直接促进作用.在炎性因子(TNF oc )介导下Ang2能够促进LECs的迁移，VEGF-C对LECs和BECs 有明显的促进迁移作用，而Ang2对其没有直接促进迁移作用(图8) 3. Ang-2对体内炎性淋巴管生长的影响 材泮牛和方法(1 )BALB/cA -nude棵小鼠，4 ~ 6周龄8只，雌雄兼用，体重17 ~ 25 g, SPF 条件下饲养；兔抗鼠 Lymphatic Vessel Endothelial hyaluronan receptor-1 ( LYVE-1 ， AngioBio); Streptoavidin-HRP第二抗体(EnVision, DAK0);带Ang2基因、VEGF - C基因、EGFP基因的pcDNA3. 1 质粒载体(酶切鉴定同前)；质粒小量抽提纯化试剂盒(上海华舜公司)； 质粒大量抽提试剂盒(QIAGEN Inc.);电穿孔4义(ECM830 )(图9)。(2) 自耳根部皮肤向耳缘方向进针，皮内注射0.1ml生理盐水、 pCDNA3. 1-EGFP lOOpg、 pcDNA3. 1-VEGF-C lOOpg, pcDNA3. 1-Ang2 lOOpg 和pcDM3. 1-Ang2 100vig+LPS50ng/TNF a 25ng。注射时以上质粒均溶解于 0. lml生理盐水中。电穿孔^f义电压100mv，频率20ms。随即分组，自身对 照，两周取材。(3) 耳皮肤淋巴管染色及计数创美图像分析软件进行计数 结果1电穿孔仪电压及频率参数的设定及质粒有效表达 以EGFP - pcDNA3. 1质粒检测目的基因在棵鼠耳皮肤的表达，寻求最佳质 粒表达的电压和频率，本实验参照大鼠皮肤参数进行了适当的调整，得出 电穿孔仪最佳参数为电压100mv，频率为20ms。不至于烧坏皮肤及获得 EGFP基因在体内有效的表达(2W)(图10)。2淋巴管染色及计数通过淋巴管免疫组织化学染色可以直观看到Ang2基因在炎性环境中淋巴 管增粗和数目增多的改变(图ll)。体内实验的结果表明在炎性因子(TNFct )介导下Ang2促进LECs毛细管 的形成的数量和速度。Ang2基因能促进局部淋巴管生长，数目增多并扩 张。
权利要求
1、Ang-2在制备治疗或预防体内外炎性淋巴管生长疾病药物中的应用。
2、 根据权利要求1所述的应用，所述的疾病是淋巴水肿或胂瘤淋巴道 转移或器官移植后的排斥性疾病。
3 、 Ang-2基因在制备治疗或预防体内外炎性淋巴管生长疾病药物中的应用。
4、 根据权利要求3所述的应用，所述的疾病是淋巴水肺或肿瘤淋巴道 转移或器官移植后的排斥性疾病。
5、 Ang-2在制备治疗或预防机体淋巴管及周围组织炎症疾病药物中的应用。
6、 根据权利要求5所述的应用，所述的疾病是淋巴循环障碍相关的感 染或细菌，霉菌和其它微生物引发的淋巴系统及周围组织炎症疾病。
7、 Ang-2基因在制备治疗或预防机体淋巴管及周围组织炎症疾病药物中 的应用。
8、 根据权利要求7所述的应用，所述的疾病是淋巴循环障碍相关的感 染或细菌，霉菌和其它微生物引发的淋巴系统及周围组织炎症疾病。
全文摘要
本发明涉及Ang-2的用途，尤其涉及在制药领域中的应用。本发明技术方案如下Ang-2及其基因在制备治疗或预防体内外炎性淋巴管生长疾病药物中的应用。Ang-2及其基因在制备治疗或预防机体淋巴管及周围组织炎症疾病药物中的应用。该发明的优点表现在对Ang-2及其基因发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
文档编号A61P31/00GK101518644SQ20081003389
公开日2009年9月2日 申请日期2008年2月26日 优先权日2008年2月26日
发明者刘宁飞, 胡学庆, 蒋朝华 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院