专利名称：银杏酮酯在制备抗心律失常的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及银杏酮酯的新的医药用途。
背景技术：
银杏叶提取物(EGB)是一种含有多种活性成份并具有多种药理作用的中药，临床常用于冠心病和心脑缺血性疾病的防治，并有良好的疗效。银杏叶中含有黄酮类、萜内酯类以及少量的多酚类、生物碱、长链醇、酮类及微量元素等主要化学成分。目前国际上常用的银杏叶提取物为德国Schwabe公司在上世纪70年代的专利产品EGb761，其中黄酮类的含量为22％～27％，萜内酯含量为5％-7％。而我国自主研发的银杏酮酯(GBE50)是一种新的银杏叶标准提取物，其成分为总黄酮44％，总内酯6％，因产品工艺的先进性，已取得多国专利。
中国专利CN1145230A于1997年03月19日公开了一种高含量银杏叶黄酮内酯浸膏，该银杏叶黄酮内酯浸膏是通过下列方法制备的将干燥的银杏叶粉碎成粗粉，过60目筛，用原生药重量5-30倍量的水加热回流提取，热提2-3次，每次1-3小时，然后将提取液于低于60℃条件下减压浓缩至比重为1.15-1.25，加入原生药量的1-5倍量水溶解，静置36-72小时，过滤，滤液通过以不带离子交换基团的分离介质为载体的柱层析1-2次，再用水及水-醇混合溶剂洗脱，收集洗脱液，于低于60℃的条件下减压浓缩、干燥后制得高含量银杏叶黄酮内酯浸膏，用此方法获得的银杏叶黄酮内酯浸膏，其中含总黄酮≥44％、黄酮甙≥24％、内酯≥6％、银杏酸≤10ppm。该银杏叶浸膏经药理、毒理研究证实其对心、脑血管有明显的保护机体、改善功能作用。
目前银杏酮酯对心血管作用的研究主要包括 降血脂、血黏和抗血小板激活因子GBE50对家兔可改善血液流变学参数，抑制血小板聚集，明显降低血黏度，并延长凝血时间，提示有预防血栓形成和促进血栓溶解作用。Koltringer P等考察银杏酮酯对家兔血液粘弹性的影响发现银杏酮酯30μg/ml、60μg/ml能降低血液粘度、弹性并且减慢其增加速率、延长粘、弹模量的复钙时间。Kaibara M等考察银杏酮酯对家兔血液凝固过程的影响发现银杏银杏酮酯30μg/ml、60μg/ml有延长血液凝固时间，减慢血液凝固速率，延缓整个血液凝固过程。沈连忠等研究发现MACO手术可引起实验大鼠低、中、高切血液粘度显著升高，而银杏酮酯则可计量依赖性地降低上述各粘度。
抗缺血和缺血再灌注损伤张锋等发现GBE50可促进兔心肌细胞抗凋亡基因bcl-2，bcl-xL的表达。小鼠急性心肌缺血模型，预先给予银杏叶提取物有效抑制缺血所致线粒体膜磷脂含量减少、丙二醛增高，提高线粒体Ca2+-ATP酶及胞浆超氧化物歧化酶活性，其部分作用呈剂量依赖性。闵旸等结扎狗冠状动脉左前降支的分支，观察银杏酮酯对冠状动脉结扎心梗的治疗作用发现银杏酮酯可剂量依赖性缩小心肌缺血范围和心肌梗死范围，并能显著性地降低冠状动脉结扎犬心电图ST段升高总和和ST段升高大于2mV的心电导联数(N-ST)。王淑仙等以动脉夹夹闭大鼠双侧颈总动脉造成脑缺血，观察银杏酮酯对大鼠急性脑缺血的影响发现对照组缺血再灌后脑电图(EEG)恢复较银杏酮酯、川芎嗪慢，60分钟仅恢复到正常水平的67％，而银杏酮酯缺血再灌10分钟后即恢复到正常的90％左右。
此外，张锋等发现银杏酮酯可促进兔心肌细胞抗凋亡基因bcl-2，bcl-xL的表达。
而临床研究显示银杏酮酯对心绞痛、心绞痛引起的心悸、脑动脉硬化引起的眩晕、高脂血症、糖尿病周围神经病变等疾病有确切疗效。
显然，银杏酮酯有广泛的防治心血管疾病的作用以及临床运用前景，但目前对银杏叶提取物(EGB)包括银杏酮酯(GBE50)抗心律失常作用及其机制的研究未有报导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提出银杏酮酯在制备抗心律失常的药物中的应用。
本发明银杏酮酯的制备方法没有特别之处，按照中国专利CN1145230A公开的方法制得银杏叶黄酮内酯浸膏后，再添加药用辅料，按照常规方法制得任何一种药剂学上所说的剂型即可。
本发明从整体、组织、细胞、离子水平采用多种心律失常模型，通过心电记录、心肌特性的测定以及单个细胞常规微电极记录等方法显示 (1)应用乌头碱(Aconitine，Aco)、哇巴因(Ouabain，Oua)建立稳定的、重复性好的大鼠心律失常模型，银杏酮酯(GBE50)增加了Aco、Oua造成的大鼠室性早搏(Ventricular premature beat，VP)、室性心动过速(Ventricular tachycardia，VT)、室性纤颤(Ventricular fibrillation，VF)、心脏停搏(Cardiac arrest，CA)的诱发剂量且作用呈一定剂量依赖性。表明了银杏酮酯对Aco、Oua造成的心律失常有很好的抑制作用。
(2)银杏酮酯降低右心房的自律性，降低心房的收缩力，延长左心房FRP，降低左心房的静息后增强效应，且作用呈一定剂量依赖性。表明了银杏酮酯抑制心律失常的作用与改善心肌特性有关。
(3)应用哇巴因和高钙建立稳定的、重复性好的DAD和TA模型，银杏酮酯延长了DAD的潜伏期，缩短了DAD的时程，减少了DAD的幅值，抑制了TA的发生，表明了银杏酮酯抗心律失常的作用与抑制异常的电生理过程有关。
实验研究证实银杏酮酯增加了Aco、Oua造成的大鼠VP、VT、VF、CA的诱发剂量且作用呈一定剂量依赖性。表明了银杏酮酯对心律失常有很好的抑制作用。
本发明的动物实验表明银杏酮酯具有良好的抗心律失常作用，银杏酮酯有望成为疗效较好、毒副作用小的抗心律失常新药。
具体实施例方式 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
1.实验材料与方法 1.1大鼠心律失常模型心电的记录 1.1.1动物 雄性SD大鼠109只，体重270±30g。上海中医药大学实验动物中心提供。
1.1.2溶液与试剂 (1)含2％丙二醇(PF)生理盐水溶液。
(2)银杏酮酯母液每5mg银杏酮酯溶解于1ml 2％丙二醇(PF)溶液中备用，GBE50由杏林药业提供(批号050901)。
(3)乌头碱乌头碱(Fluka公司，批号402350/1)，用生理盐水溶解，配制成50mg/L的母液备用，实验中体积稀释至三倍使用。
(4)哇巴因哇巴因(Sigma公司，批号057K1625)，用生理盐水溶解，配制成1g/L的溶液。
(5)奎尼丁奎尼丁(Sigma公司，批号108F0776)，用生理盐水溶解，配制成1.5625g/L的溶液。
(6)盐酸地尔硫卓10mg盐酸地尔硫卓(日本田边制药，批号0602002)，用生理盐水溶解，配制成234.375mg/L的溶液。
1.1.3实验仪器 RM6240C生物信号采集系统(成都仪器厂)；ZCZ-50自动抽注机(浙江医科大学医学仪器实验厂)。
1.1.4大鼠心电的记录 麻醉动物用20％乌拉坦按5ml/Kg腹腔注射，仰卧固定，颈静脉插管备用。大鼠接上肢体导联电极，通过RM6240C生物信号采集系统密切观察并记录II导联心电图。
1.1.5实验方案 (1)银杏酮酯预防给药抗乌头碱诱发心律失常实验 ①49只实验大鼠随机分为五组溶剂(丙二醇)对照组、奎尼丁组、GBE50高、中、低剂量组。
②对照组经颈静脉注射含2％丙二醇(PF)生理盐水溶液(0.64ml/100g)；奎尼丁组经颈静脉注射奎尼丁溶液1mg/100g；GBE50组注射不同剂量的GBE50液(8mg/Kg，16mg/Kg，32mg/Kg)。注射剂量均为0.64ml/100g，2min内注射完，稳定10min后由颈静脉通过自动抽注机恒速注入乌头碱溶液(0.55μg·0.033ml-1·min-1)，通过RM6240C生物信号采集系统密切观察并记录II导联心电图，并准确计算诱发异常心电(室早、室速、室颤、停搏)的乌头碱用药剂量。
异常心电(室早、室速、室颤、停搏)判定方法 室早有提前出现的QRS波群和T波，其前面无提前的P波；早搏的QRS波群宽大畸形；室早后的代偿间歇完全。
室速存在有连续、快速、畸形的QRS波群，R-R间期大致相等。
室颤QRS波群基本图形消失，代之以振幅、形态和时距绝对不同、大小各异的波动。
停搏QRS波群消失，心电图基本成一直线。
(2)银杏酮酯预防给药抗哇巴因诱发心律失常实验 ①60只实验大鼠随机分为五组溶剂(丙二醇)对照组、盐酸地尔硫卓组(DIL)、GBE50高、中、低剂量组，每组12只。
②对照组经颈静脉注射含2％丙二醇(PF)生理盐水溶液(0.64ml/100g)；盐酸地尔硫卓组经颈静脉注射盐酸地尔硫卓溶液0.15mg/100g；GBE50组注射不同剂量的GBE50液(8mg/Kg，16mg/Kg，32mg/Kg)。注射剂量均为0.64ml/100g，2min内注射完，稳定10min后由颈静脉通过自动抽注机恒速注入哇巴因溶液(33μg·0.033ml-1·min-1)，通过RM6240C生物信号采集系统密切观察并记录II导联心电图，并准确计算诱发异常心电(室早、室速、室颤、停搏)的哇巴因用药剂量。
异常心电(室早、室速、室颤、停搏)判定方法同上。
1.2离体豚鼠心房肌生理特性实验 1.2.1动物 雄性豚鼠，体重220-250g，上海中医药大学实验动物中心提供。
1.2.2溶液 台氏液(Tyrode solution)配方成分如下(mmol·L-1)NaCl 137.0，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 1.0，NaHCO3 23.8，NaH2PO4 0.4，glucose11.0，用95％O2和5％CO2饱和，pH 7.4。
1.2.3试剂及配置 银杏酮酯(杏灵药业提供，批号050901)500mg，溶解于7ml 40％的PEG400溶液中配成母液备用。
1.2.4实验仪器 RM6240C生物信号采集系统(成都仪器厂)；JH-2肌张力传感器(北京航天医学工程研究所)。
1.2.5豚鼠心房肌特性测定操作步骤 (1)离体豚鼠右心房自发性收缩活动的测定 将豚鼠敲头致昏后，迅速打开胸腔，取出心脏，放入盛有通以95％O2和5％CO2混合气体的台氏液培养皿中，并尽快取下完整右心房肌。取出标本后将其悬挂于盛有37℃台氏液的离体器官浴槽内，并通以95％O2和5％CO2混合气体。标本的顶端心房尖部通过丝线与肌张力传感器相连，静息张力控制于0.75g，并通过生物信号采集系统记录其自发性收缩曲线并测定其收缩频率以及收缩力。
(2)离体豚鼠左心房收缩活动测定 取豚鼠敲头致昏后，迅速打开胸腔，取出心脏，放入盛有通过95％O2和5％CO2混合气体的台氏液培养皿中，并尽快取下完整左心房肌。取出标本后将其悬挂于盛有37℃台氏液的离体器官浴槽内，并通以95％O2和5％CO2混合气体。标本的顶端心房尖部通过丝线与肌张力传感器相连，静息张力控制于0.75g。
给予单脉冲刺激，刺激频率1Hz，波宽1ms，刺激电压从0.5V起以增量1V逐渐提高至诱发左心房收缩，以此电压为阈电压，调整刺激电压至5倍阈电压。
左心房肌于离体器官浴槽稳定30min后，用成对刺激法测定心房功能不应期(FRP)，连续观察30s，若30s内偶有单收缩峰出现，可稍延长双脉冲间隔，直至两个刺激都可引起可见的收缩反应，此时两脉冲间的最短时间间距即为FRP。共测2-3次不应期，取均数作为对照。然后累积加入GBE50(10、20、40、80、160mg.L-1)，给药时间间隔10min，每次给药10min后，观察药物作用。
心肌标本在停止刺激静息一段时间后给予阈上刺激，刺激引起的第一个收缩幅度最大，此为静息后增强效应(PRP)。左心房以波宽1ms，频率1Hz和2倍阈电压方波进行刺激触发收缩，平衡一段时间后，停止刺激40s，然后予以同样刺激参数，测定其PRP。
1.2.6实验方案 (1)离体豚鼠右心房自发性收缩测定实验 ①溶剂对照组右心房于浴槽中稳定30min后，测定其自发性收缩频率以及收缩力做为对照，然后在离体器官浴槽内累积加入溶剂PEG400(56、112、224、448、896μl/L，因为10、20、40、80、160mg.L-1的GBE50溶液中溶剂PEG400的含量即分别为56、112、224、448、896μl/L)，每次间隔时间为10min，测定其收缩频率以及收缩力变化，最后按下式计算 收缩频率抑制率(％)＝(药前收缩频率-药后收缩频率)×100/药前收缩频率 收缩幅度抑制率(％)＝(药前收缩力-药后收缩力)×100/药前收缩力 ②GBE50药物组右心房于浴槽中稳定30min后，测定其自发性收缩频率以及收缩力作为对照，然后累积加入GBE50(10、20、40、80、160mg.L-1)，每次间隔时间为10min，测定其收缩频率以及收缩力变化，观察药物抑制豚鼠右心房收缩活动的程度。用台氏液冲洗浴槽2-3次，20-30min后重复测定收缩频率以及收缩力，观察其恢复情况。
(2)离体豚鼠左心房心肌收缩力、功能不应期、静息后增强效应的测定实验 ①溶剂对照组离体豚鼠左心房肌于离体器官浴槽内稳定30min后，用成对刺激法测定左心房心肌收缩力、功能不应期、静息后增强效应作为对照，然后累积加入溶剂PEG400(56、112、224、448、896μl/L)，每次间隔时间为10min，每次给溶剂10min后，观察各指标变化。
②GBE50药物组离体豚鼠左心房肌于离体器官浴槽内稳定30min后，用成对刺激法测定左心房心肌收缩力、功能不应期、静息后增强效应作为对照，然后累积加入GBE50(10、20、40、80、160mg.L-1)，每次间隔时间为10min，观察左心房心肌收缩力、功能不应期、静息后增强效应变化。用台氏液冲洗浴槽2-3次，20-30min后重复测定上述指标，观察其恢复情况。
1.3豚鼠右心室乳头肌细胞跨膜电位的记录 1.3.1动物 雄性豚鼠，体重220-250g，上海中医药大学实验动物中心提供。
1.3.2溶液 台氏液(Tyrode solution)配方成分如下(mmol·L-1)NaCl 137.0，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 1.0，NaHCO3 23.8，NaH2PO4 0.4，glucose11.0，95％O2和5％CO2饱和，pH 7.4 诱发延迟后除极(DAD)配方——高钙台氏液成分如下(mmol·L-1)NaCl137.0，KCl 5.4，CaCl25.4，MgCl2 1.0，NaHCO3 23.8，NaH2PO40.4，glucose11.0，ouabain2.0*10-3，95％O2和5％CO2饱和，pH 7.4。
1.3.3试剂及配置 银杏酮酯(杏灵药业提供，批号050901)500mg，溶解于7ml 40％的PEG400溶液中配成母液。哇巴因(美国Sigma公司，Ouabain Lot number116K1344)用超纯水配置成1*10-3mol.L-1的母液。上述母液-20℃冷冻保存，实验时加适量于灌流液中达到实验所需浓度。各种灌流液中PEG400浓度均低于1‰。其余常规试剂均为国产分析纯。
1.3.4实验仪器 RM6240C生物信号采集系统(成都仪器厂)；SWF-1W微电极放大器(成都仪器厂)；PE-21微电极拉制仪(NARISHIGE，JAPAN)；PF5-1微推进器(NARISHIGE，JAPAN)。
1.3.5豚鼠心室乳头肌标本制备和跨膜电位的记录 将豚鼠(220-250g，雄性)击昏后开胸，迅速取出心脏置于37℃ 95％O2和5％CO2饱和的台氏液中，解剖分离出右侧心室乳头肌用0号不锈钢针固定于恒温(36±0.5℃)、恒流(4ml.min-1)的灌流槽中央底部。以铂金丝电极作细胞外刺激。用RM6240C型生理实验系统输出电脉冲刺激，刺激波宽1ms、强度为阈值的1.5-2倍，频率为1.67Hz(BCL＝600ms)。以尖端裸露、乏极化银丝作为细胞外参考电极，记录电极为玻璃毛细管(直径1.5mm，有芯，型号GG-17，中科院上海生理所出品)经微电极拉制仪拉制而成，拉制好的微电极，其内冲以3mol.L-1KCl的电极内液，电极电阻为10-20MΩ，并以铂金丝电极引导，采用标准微电极技术，用微推进器将玻璃微电极插入已分离的右心室乳头肌内引出跨膜电位，信号经微电极放大器放大，由RM6240C信号处理系统显示、记录、处理、分析。延迟后除极(DAD)所测定的参数包括DAD的幅值(amplitude ofDAD)、DAD的区间(durition of DAD)、DAD的面积(area of DAD)和DAD出现的时间(induced time of DAD)等。
1.3.6实验方案 (1)32只雄性豚鼠，体重220-250g，随机分成5组(实验对照组、维拉帕米组、GBE50高、中、低剂量组) (2)实验对照组以强度为阈值的2倍，频率为1.67Hz(BCL＝600ms)的刺激刺激标本，在正常台氏液中持续灌流2-4h，待肌肉稳定后记录动作电位，波形稳定30min达到稳态，改用含有哇巴因的高钙台氏液灌流标本30min，观察DAD及TA出现的时间及各项指标的变化，并以正常台氏液洗回以验证相应诱发的DAD和TA的重复性，以此作为对照组。
(3)维拉帕米组、GBE50高、中、低剂量组以强度为阈值的2倍，频率为1.67Hz(BCL＝600ms)的刺激刺激标本，在正常台氏液中持续灌流2-4h，待肌肉稳定后记录动作电位，波形稳定30min达到稳态，分别改用含有阳性对照药维拉帕米以及不同浓度GBE50的哇巴因、高钙台氏液灌流标本30-50min，观察、记录DAD及TA出现的时间及各项指标的变化，同样以正常台氏液洗回以验证相应诱发的DAD和TA的重复性。
1.4分离豚鼠心室肌细胞以及细胞内游离钙的测定 1.4.1动物 雄性豚鼠，体重220-250g，上海中医药大学实验动物中心提供。
1.4.2溶液 (1)无钙MOPS液(mmol·L-1)NaCl 100，KCl 10，KH2PO4 1.2，MgSO4 5.0，glucose 20，taurine 20，MOPS 10，用KOH将pH调至7.2 (2)正常细胞外液(mmol·L-1)NaCl 137，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 1.0，HEPES 10，glucose 10，用NaOH将pH调至7.4 1.4.3试剂及配置 银杏酮酯(杏灵药业提供，批号050901)500mg，溶解于7ml 40％的PEG400溶液中配成母液备用。
1.5数据的统计学处理 所有数据用均数±标准差(Mean±SD)表示，实验计数资料均用单因数方差分析以及t检验进行统计学分析，计量资料用精确概率法进行统计分析，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。资料用RM6240C信号处理软件、微软Excel 2003及SPSS11.0软件进行原始图形的采集、数据处理、分析及绘图。
2.实验结果 2.1银杏酮酯预防给药对哇巴因、乌头碱所致心律失常的影响 2.1.1银杏酮酯预防给药对哇巴因所致心律失常的影响 实验结果显示，对照组大鼠在颈外静脉给哇巴因平均剂量达534.49μg/kg时出现室性早搏，剂量达1056.50μg/kg时发生室速，剂量达1579.18μg/kg时诱发室颤，当剂量增加至1891.09μg/kg时则导致心跳停搏。地尔硫卓组(DIL)则使哇巴因诱发的室早、室速、室颤、停搏剂量分别提高至845.24μg/kg、1341μg/kg、2099μg/kg、2404μg/kg，与对照组比较具有显著性差异(P＜0.01或P＜0.05)；8mg/Kg和16mg/Kg GBE50使哇巴因诱发的室早剂量提高至755.28μg/kg和751.72μg/kg，16mg/Kg GBE50使哇巴因诱发的室速剂量提高至1291μg/kg，上述数值和对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)；8mg/Kg和16mg/Kg GBE50使哇巴因诱发的室颤剂量提高至1682.43μg/kg和1836.08μg/kg，停搏剂量提高至1918.86μg/kg和2170.24μg/kg，但与对照组比较不具有统计学上的显著性差异(P＞0.05)；而32mg/Kg GBE50使哇巴因诱发的室速、室颤、停搏剂量分别降至858.94μg/kg、1216.03μg/kg、1360.64μg/kg，但上述数值和对照组比较不具有统计学上的具显著性差异(P＞0.05)，而16mg/Kg GBE50组与地尔硫卓组比较具有统计学上的显著性差异(P＜0.05)。结果显示8mg/Kg和16mg/Kg银杏酮酯GBE50可明显提高哇巴因所致大鼠心律失常实验中哇巴因诱发的室早、室速、室颤、停搏剂量，但作用较地尔硫卓要弱，而32mg/Kg GBE50则没有明显的预防作用，表明了GBE50抗心律失常作用在一定浓度范围内有效(表1)。
表1GBE50对哇巴因所致大鼠心律失常的影响
与对照组相比ap＜0.05，bp＜0.01；与32mg/L GBE50组相比cp＜0.05；与8mg/L GBE50组相比dp＜0.01vs；ep＜0.05 2.1.2银杏酮酯GBE50预防给药对乌头碱所致心律失常的影响 实验结果显示，对照组大鼠在颈外静脉给乌头碱平均剂量达23.86μg/kg时出现室性早搏，剂量达27.21μg/kg时发生室速，剂量达34.71μg/kg时诱发室颤，当剂量增加至43.40μg/kg时则导致心跳停搏。奎尼丁组则使乌头碱诱发的室早、室速、室颤、停搏剂量分别提高至29.55μg/kg、34.52μg/kg、39.15μg/kg、48.68μg/kg，其中乌头碱诱发的室早、室速剂量与对照组比较具有显著性差异(P＜0.05)；8mg/Kg GBE50使乌头碱诱发室速剂量提高至提高至32.62μg/kg，16mg/Kg GBE50使乌头碱诱发的室颤、停搏剂量剂量提高至48.62μg/kg和57.43μg/kg，32mg/Kg GBE50使乌头碱诱发的室早、室速剂量提高至28.06μg/kg和31.30μg/kg，上述数值和对照组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)详见表2和图4。实验结果表明了GBE50具有抗乌头碱所致心律失常的作用。
表2GBE50对乌头碱所致大鼠心律失常的影响(x±s，n＝12)
与对照组相比ap＜0.05，bp＜0.01；与16mg/L GBE50组相比cp＜0.05，dp＜0.01 2.2银杏酮酯对离体豚鼠心房肌的影响 2.2.1银杏酮酯对离体豚鼠右心房肌收缩频率和收缩力的影响 溶剂对照组右心房的收缩频率及收缩力有所下降，但无统计学意义(P＞0.05，如图5，6)。而在10～160mg/L浓度范围内，银杏酮酯GBE50对右心房收缩力和自发性收缩频率呈一定的剂量依赖性负性作用(表3和图7，8，9)。GBE50(10、20、40、80、160mg/L)对右心房收缩频率抑制率分别为(4.23±3.23)％、(6.22±4.52)％、(8.18±5.09)％、(9.37±5.95)％、(9.73±6.78)％，除10mg/L外，其它组别均与对照组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)；GBE50(10、20、40、80、160mg/L)对右心房收缩力抑制率分别为(16.10±27.61)％、(14.72±10.46)％、(18.96±7.80)％、(36.74±10.70)％、(42.32±12.51)％，上述数据均与对照组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。实验结果表明了GBE50能够降低右心房的自律性，降低右心房的收缩力，且作用呈一定剂量依赖性。
表3.GBE50对豚鼠离体右心房肌自发性收缩节律和收缩力的影响(x±s，n＝10)
与对照组相比ap＜0.05，bp＜0.0；与10mg/L GBE50组相比cp＜0.05，dp＜0.01vs GBE50；与20mg/L GBE50组相比ep＜0.01；与40mg/L GBE50组相比fp＜0.01 2.2.2银杏酮酯GBE50对离体豚鼠左心房心肌收缩力、功能不应期、静息后增强效应的影响 溶剂组左心房的收缩力、静息后增强效应同对照数据有所下降，功能不应期有所延长但无统计学意义。而在10～160mg/L浓度范围内，银杏酮酯GBE50对左心房收缩力和静息后增强效应呈一定的剂量依赖性负性作用，对左心房功能不应期呈一定的剂量依赖性正性作用。
GBE50(10、20、40、80、160mg/L)对左心房收缩力抑制率分别为(12.26±8.86)％、(22.42±11.41)％、(32.65±14.40)％、(41.67±14.90)％、(47.09±15.05)％，上述数据均与对照组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。
将给药前PRP定为100％，则不同浓度GBE50(10、20、40、80、160mg/L)的左心房PRP分别降至给药前的(87.30±14.02)％、(85.57±14.02)％、(75.37±16.94)％、(66.09±15.13)％、(65.71±12.08)％，除10mg/L外，上述数据均与对照组比较具有显著性差异(P＜0.05或P＜0.01)。
40、80、160mg/L的GBE50可使心房肌FRP由给药前(93.80±9.37)ms延长至给药后10min的(106.20±9.43)ms、(111.10±8.69)ms、(116.40±8.95)ms(P＜0.01)；较低浓度GBE50(10、20mg/L)使心房肌FRP由给药前(93.80±9.37)ms延长至给药后10min的(97.80±9.96)ms、(101.60±9.95)ms，但与给药前数据比较不具显著性差异。实验结果表明了GBE50能够延长左心房FRP，降低左心房的静息后增强效应，降低左心房的收缩力且作用呈一定剂量依赖性。见表4。
表4.GBE50对豚鼠离体左心房肌收缩力、功能不应期和静息后增强效应的影响(x±s，n＝10)
与对照组相比ap＜0.05，bp＜0.01；与10mg/L GBE50组相比cp＜0.01；与20mg/L GBE50组相比dp＜0.05，ep＜0.01；与40mg/L GBE50组相比fp＜0.05，gp＜0.05；与80mg/L GBE50组相比hp＜0.05 2.3哇巴因、高钙诱发的DAD和TA及银杏酮酯对其的影响 (1)应用标准微电极技术在台氏液中记录到豚鼠心室乳肌头动作电位，刺激强度为阈值的2倍，频率为1.67Hz(BCL＝600ms)，稳定30min，改用含有哇巴因(2μmol.L-1)的高钙(CaCl2 5.4mmol.L-1)台氏液灌流标本，在(12.37±2.26)min后开始出现DAD，连续灌流30min可以诱发乳头肌产生波形典型、重复性好的DAD，并可以观察到连续性的或非连续性的TA，其发生率为87.5％。同时动作电位波形开始明显改变，表现为RP除极，APA减小，APD缩短，平台期消失。
(2)GBE50对哇巴因、高钙诱发的延迟后除极(DAD)和触发活动(TA)的影响 GBE50大、中、小剂量组的DAD潜伏期从对照组的(12.37±2.26)min延长到(23.00±4.00)min(p＜0.01)、(14.33±1.03)min、(12.50±2.43)min；DAD的幅值从对照组的13.25±2.38)mV减少到(4.04±1.44)mV、(8.92±2.68)mV(p＜0.01)、(10.41±3.06)mV(p＜0.05)；DAD的时程从对照组的(191.38±53.62)ms减少到(57.00±18.62)ms、(103.33±20.64)ms、(128.33±18.91)ms(p＜0.01)；DAD下方的面积从对照组的(978.45±293.27)mV.ms减少到(110.11±27.72)mV.ms、(461.32±147.32)mV.ms、(581.81±153.47)mV.ms(p＜0.01)；TA其发生率从对照组的87.5％减少到16.67％(p＜0.05)、33.33％、33.33％。从实验结果可以看出GBE50可以明显抑制哇巴因、高钙诱发的延迟后除极(DAD)和触发活动(TA)，并成一定的浓度依赖性，见表5。
表5.GBE50对哇巴因、高钙诱发的豚鼠乳头肌延迟后除极(DAD)和触发活动(TA)的影响
与对照组相比ap＜0.05，bp＜0.01；与2mg/L GBE50组相比cp＜0.01；与10mg/L GBE50组相比dp＜0.01，ep＜0.05 3.结论 本发明从整体、组织、细胞、离子水平采用多种心律失常模型，通过心电记录、心肌特性的测定、单个细胞常规微电极记录等方法显示 (1)应用Aco、Oua建立稳定的、重复性好的大鼠心律失常模型，银杏酮酯增加了Aco、Oua造成的大鼠VP、VT、VF、CA的诱发剂量且作用呈一定剂量依赖性。表明了银杏酮酯对Aco、Oua造成的心律失常有很好的抑制作用。
(2)银杏酮酯降低右心房的自律性，降低心房的收缩力，延长左心房FRP，降低左心房的静息后增强效应，且作用呈一定剂量依赖性。表明了银杏酮酯抑制心律失常的作用与改善心肌特性有关。
(3)应用哇巴因和高钙建立稳定的、重复性好的DAD和TA模型，银杏酮酯延长了DAD的潜伏期，缩短了DAD的时程，减少了DAD的幅值，抑制了TA的发生，表明了银杏酮酯抗心律失常的作用与抑制异常的电生理过程有关。
综上所述，动物实验表明银杏酮酯具有良好的抗心律失常作用，银杏酮酯有望成为疗效较好、毒副作用小的抗心律失常新药。
权利要求
1、银杏酮酯在制备抗心律失常的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及银杏酮酯的新的医药用途，具体公开了银杏酮酯在制备抗心律失常的药物中的应用。
文档编号A61K36/16GK101606956SQ20081004352
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月20日 优先权日2008年6月20日
发明者张志雄, 王星禹 申请人:上海中医药大学