小刺猴头的发酵的制作方法

专利名称：小刺猴头的发酵的制作方法
技术领域：
本发明涉及猴头菌丝体的发酵，属于含有真菌的医用配制品，IPC分类号为A61K 36/06。
背景技术：
本发明所称的猴头菌为齿菌科真菌小刺猴头菌(Hericium caput-medusae)，其菌丝体的发酵产物多年来作为原料药应用于临 床。我国市场上以猴头菌丝体培养浸膏为原料制成的药品有胃乐新冲 剂，该制剂对胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎等显示出良好的疗效。

发明内容
本发明要解决的技术问题是提供猴头菌丝体的发酵，其包括取小刺猴头纯菌株，经过斜面菌种培养、 一级摇瓶种子培养、二 级摇瓶种子培养、 一级种子罐培养、二级种子罐培养、发酵、发酵液加热、过滤、浓縮；所述斜面培养的温度为27±1° C，时间为7_9天，摇瓶种子培 养、种子罐培养和发酵的温度为27±1° C，时间为5_7天，发酵液 加热的温度为100° C;
所述斜面培养的培养基配方为马铃薯100:葡萄糖l:磷酸二氢钾 l:琼脂l;所述摇瓶培养的培养基配方为葡萄糖3—4%，磷酸二氢钾0.03 %,蛋白胨0.3%，氯化钠0.05%，维生素B1适量，聚醚消沫剂适所述种子罐培养和发酵的培养基配方为葡萄糖0.3%，磷酸二氢 钾0.03%，蛋白胨0.3%，氯化钠0.05%，维生素B1适量，聚醚消 沫剂适量。
具体实施方式
取小刺猴头纯菌株，在27±1° C下斜面菌种培养7—9天，在 27士1° C下一级摇瓶种子培养5—7天，在27±1° C下二级摇瓶种子 培养5 — 7天，在27±1° C下一级种子罐培养5 — 7天，在27±1° C 二级种子罐培养5—7天，在27±1° C下发酵5 —7天，在IOO。 C下 加热发酵液，过滤、浓縮；所述斜面培养的培养基配方为马铃薯100: 葡萄糖l:磷酸二氢钾l:琼脂1;所述摇瓶培养的培养基配方为葡萄 糖3—4%，磷酸二氢钾0.03%，蛋白胨0.3%，氯化钠0.05%，维 生素Bl适量，聚醚消沫剂适量；所述种子罐培养和发酵的培养基配 方为葡萄糖0.3%，磷酸二氢钾0.03。X，蛋白胨0.3%，氯化钠0.05 %,维生素B1适量，聚醚消沫剂适量。 1.化学反应过程及生产流程<image>image see original document page 5</image>3. 1. 1.斜面接种操作接种于无菌室超净台下迅速取下原种斜 面、空白斜面棉塞，将原种菌块用接种针挑入空白斜面内，塞上棉塞， 加纱面，系上线绳，送培养室恒温箱培养；3. 1. 2.斜面培养基配方:
马铃薯 200g 葡萄糖2g磷酸二氢钾2g 琼脂2gPH自然制法将新鲜马铃薯200g去皮切成小块加水1000ml煮沸25分 钟，用纱布过滤取滤液，琼脂预先浸湿后加入滤液中煮沸同时不断搅 拌，防止沸出直至全部溶解，然后分别加入葡萄糖、磷酸二氢钾等物 质搅拌均匀，趁热分装于试管中，塞好瓶塞后置于灭菌锅灭菌，蒸汽 压力l.l个大气压，120°C，时间30分钟，取出后自然降温至40-45° C，铺成斜面，空白培养1天，无杂菌方可使用； 3. 1. 3.摇瓶接种操作一级摇瓶接种于无菌室超净台下迅速取下斜面、一级摇瓶瓶塞， 将斜面菌块用接种针挑入摇瓶后塞上棉塞；二级摇瓶接种于无菌室超净台下迅速取下一、二级摇瓶瓶塞，将一级种子迅速倒入二级摇瓶内，塞上棉塞，盖上纱面，系上线绳，放摇瓶机上培养；3. 1. 4.培养条件将一、二级摇瓶置于摇瓶机内于1S0 230转， 27±1°C培养4一7天取下放冰箱备用；3. 1. 5.摇瓶培养基配方27±1°C， 5—7天左右，下斜面后4。C冰 箱保存备用；摇瓶培养基(一、二级摇瓶制法相同) 配方葡萄糖(工业) 3-4%KH2P04 0.03%
蛋白胨 0.3%NaCl 0.05%维生素Bi 微量消沬剂 少许制法将以上试剂用蒸馏水加热溶解，500ml瓶(一级摇瓶)内 装量100ml， 2000ml瓶(二级摇瓶)内装量500ml，塞好棉塞，装入 灭菌锅于一个大气压、12rC灭菌30分钟，冷却至室温放置一天，备 用；3. 2.控制室操作到发酵台取样；镜检罐内菌丝生长情况，判断准 确无误；下达发酵、配料、转罐、放罐生产指令；准确填写批生产记 录和其它记录；负责检査收集车间各种生产记录并存档。3. 3.发酵配方 3. 3. 1.培养基配方葡萄糖(工业) 0.3%KH2P04 0.03%蛋白胨 0.3% NaCl 0.05%维生素B, 微量消沫剂 少许一、二、三级发酵，种子罐配方相同，将上述原料加入种子罐 中，加水至要求体积。3. 4.配料操作操作前开启自来水阀门，将罐内各部冲洗干净，关
闭所有开孔及阀门，开启压縮空气阀门排净罐中水，关闭压縮空气， 开启排气阀泄压，压力表为零；开启自来水阀及排气阀，把水加至配 料罐大约l/2处打开(人孔)入料孔、加入工业糖，培养基、原料若 干，盖好罐盖(既人孔入料口)，拧紧入料口上盖螺丝，并用加力棒 拧紧；开启进罐蒸汽阀门，进行直接加温，温度控制在80°C-100°C 溶解罐内料液混合物待排气阀排出蒸汽时，关闭蒸汽阀；开启要进料 罐的上料阀门及靠罐(主阀门)开启配料罐的出料阀门。开启并调节 压縮空气阀门，使空气压力在0、 2兆帕左右，用压差法把料液通过 料管经过滤器压入待消罐内，待消罐要按照规定的计料体积加够足量 的水，盖好罐盖，并用加力棒拧紧，关闭上料阀门待消毒；用视镜观 察，待料液全部压出后，压力表回压关闭压縮空气阀门，开启排气阀 门，排气至压力表为零，关闭排气阀门；打开入料孔，放入自来水冲 洗清除污垢残渣，备下次用。 3. 5.发酵消毒工段 3. 5. 1.消罐3. 5. 1. 1.消总过滤器关闭空气入总空阀门，开启蒸汽阀门及放 冷凝水阀门，放净管内冷凝水；开启车间内14个罐分过滤器排气阀 门及总空排气阀门；开启蒸汽阀门，进行高温消毒灭菌，把总空罐压 控制在0.15Mpa左右(调节排气阀和总空入蒸汽阀)灭菌时间2小时；灭菌完成后，先关闭入总空蒸汽阀门，开启空气入总空阀门，保压吹 干总空气过滤器内活性碳、棉花及潮气吹24小时左右；关闭总空排 气阀及14个分过滤器排气阀门；每次停产重新启动后消毒一次；填
写消毒记录。3. 5. 1. 2.消种子罐(1) 操作前准备操作前开启靠罐主阀门及自来水阀门将罐内各部 冲洗干净，关水阀开启下水阀，用压縮空气把污水压入下水道，关闭 下水阀，开排气卸压；开启上料阀，待配料罐料液压入种子罐后关闭 上料阀，等待消毒；开启自来水阀，加足够量水(按种子罐内所规定的计料体积)，盖好罐盖，拧紧罐盖螺丝并用加力棒较紧，等待消毒； 过滤器消毒先开启蒸汽阀门，压力控制在1.2公斤，慢开尾气阀，蒸汽流量控制在0.3公斤以内，保压计时30分钟，先关尾汽阀，再 关蒸汽阀，同时迅速开启空气阀门保压，过滤器消毒完毕；开启接种、 空气、放料蒸汽阀门进蒸汽，进行高温消毒，在罐温升至 120°C—130°C，罐压控制在0.12—0.13兆帕(调节排气阀和进罐蒸汽 阀稳压)灭菌时由120°C计算，不超过130°C，灭菌时间为3040 分钟；灭菌完成后，先关闭接种蒸汽阀门，空气蒸汽阀门，放料进罐 蒸汽阀门及靠罐主阀门，然后关闭排气阀门和其它阀门，开启冷水阀 降温，当罐压低于空气压力时，开启压縮空气阀门保压；(2) 菌种室种子罐接种关上靠罐阀门，打开排气阀，20秒后关闭 排气阀；打开接种管路顶端快卡，取下接种口盲板，用快卡把接种瓶 和接种口连接好并拧紧；打开排气阀门，再慢慢打开蒸汽阀消毒10 分钟；关排气阀门，再关蒸汽阀门，开靠罐阀门，打开接种瓶阀门， 由发酵人员配合接种；关靠罐阀，打开排汽20秒，再关上排气，打 开快卡，取下接种瓶，盖上盲板，拧紧快卡，操作完毕。(3)对发酵罐中样品糖、氮的测定；糖的测定用斐林试剂法发酵总糖的测定；取发酵液lml置入25mL比色管中，加入 2mol/LH2S0415ml，把比色管放入沸水中溶15分钟；于250ml三角 烧瓶中分别加入斐林甲、乙试液各5mL;将沸溶后的中间体迅速冷却， 用40%NaOH调pH6.8后置入lOOmL容量瓶中，反复冲洗比色管定 容；取pH6.8的中间体5ml于备好的250mL三角瓶中，置1200W电 炉使其沸腾，从沸腾起计时1分钟；用0.1%葡萄糖标准液滴定；记 下消耗数为y;测定空白250ml三角烧瓶中加入斐林甲、乙液各5ml， 不加中间体，直接以0.1%葡萄糖标准液滴定，消耗数为x,然后计算。总数- (x-y) X2; 氨基氮的测定用甲醛滴定法所需试剂---1%酚酞指示剂-—陽0.5%H2SO4——0.1%甲基红溶液——腦甲醛 ——O.lmolNaOH操作方法用1°/。酚酞指示剂O.lmolNaOH将18。/。HCHO调至半微粉 红色置于棕色瓶中备用；用0.5。/。H2SHt与0.1%甲基红将250ml蒸馏 水调至红色溶液备用；将已备好的溶液分别置于100ml三角烧鸡瓶中 50ml左右，然后取发酵液5ml于100ml三角烧瓶中；用O.lmolNaOH 调至淡黄色后，加入备好的18%HCH05ml，酚酞指示剂D;用O.lmol NaOH标准液滴定至茶色为终点；
计算消耗数X0.02:氨基氮含量 测量各项指标所需试剂的配制保管；将各项指标做好记录。 3. 5. 1. 3.消中罐(1) 操作前准备操作前开启靠罐主阀门及自来水阀门将罐内各部 冲洗干净，关闭入水阀，开启下水阀，用压縮空气把污水压入下水道， 关闭下水阀，开排气卸压；开启上料阀，待配料罐料液压入种子罐后 关闭上料阀，等待消毒；开启自来水阀，加足够量水(按种子罐内所 规定的计料体积)，盖好罐盖，拧紧罐盖螺丝并用加力棒拧紧，等待 消毒；过滤器消毒先开启蒸汽阀门，压力控制在1.2MPa，慢开尾 气阀，蒸汽流量控制在0.3 MPa以内，保压计时30分钟，先关尾汽 阀，再关蒸汽阀，同时迅速开启空气阀门保压，过滤器消毒完毕；开 启接种阀门、空气阀门、放料蒸汽阀门进蒸汽，进行高温消毒，在罐 温升至120。C一130。C，罐压控制在0.12—0.13兆巾白(调节排气阀和 进罐空气阀稳压)灭菌时间从120。C开始计算，不超过130。C，灭菌 时间为30分钟；灭菌完成后，先关闭接种，空气，放料进罐蒸汽阀 门及靠罐主阀门，然后关闭排气阀门和所有阀门，开启冷水阀降温， 当罐压低于空气压力时，开启压縮空气阀门保压；(2) 倒料(接种)操作法开启阀门站(接种站)的所有尾阀及所 要接种罐给种罐(种子罐)靠罐阀门的尾阀，开启接种站(阀门站) 的蒸汽阀门进行接种管道灭菌，灭菌时间为30分钟，蒸汽压力为0.2 兆帕左右；灭菌时间到后，先关闭给种罐(种子罐)要接种罐(中罐) 靠罐阀的尾阀，然后关闭接种站(阀门站)所有尾阀，关闭接种站(阀
门站)蒸汽阀；开启要接种罐(中罐)的接种靠罐阀进行管道保压。 接种时把种子罐的排气阀关闭，调节压縮空气阀门，进行罐内升压(0.2兆帕)，要接种罐(中罐)调节排气，把罐压降到0.05兆帕；开启种子罐接种靠罐阀门，用压差法进行接种(把种子罐药液压入中 罐)接种完成后关闭接种罐(中罐)靠罐阀门进行空气培养(保温28°C);培养开启供热水(或冷却循环水)阀门，加热(或降温)种子罐使罐温控制在28°C压縮空气压控制在0.15兆帕左右，排气压 控制在0.05兆帕左右，空气培养生长；备注转罐时可根据生产情况适当延长生产周期，大中罐之间可以相互倒种转罐。3. 5. 1. 4. 30吨发酵罐的消毒、倒种、培养、取样同中罐； 3. 5. 2.发酵人员放罐GOT罐发酵终点)操作3. 5. 2. 1.排冷凝水操作关空气进气阀，开排气阀，使罐压回零；开下水阀和倒种排气阀及阀门站的所有排气阀，然后开进蒸汽阀和阀门站蒸汽阀，排冷凝水；待冷凝水排净后，先关蒸汽阀和阀门站蒸汽 阀，然后关下水阀，阀门站排气阀及倒种排气阀； 3. 5. 2. 2.加温操作先开靠罐阀和倒种阀，然后开蒸汽阀，阀门 总站的蒸汽阀及空气蒸汽阀，三路进蒸汽，给罐加温，待罐温升到 7(TC左右把排气关上，继续加温到100'C;温度加到IO(TC后保持10 分钟，降温至9(TC，把水关上；3. 5. 2. 3.放罐打开空气进气阀，升罐压至0.2Mpa，由专人开放料 陶；3. 5. 2. 4.特殊情况剩一个罐时，总空气压力高时，调节进空气
阀门，控制罐压在0.2Mpa.3. 6.提取3. 6. 1.板框过滤3. 6. 1. 1.板框过滤之前必须认真检查滤布是否铺好，不得有折皱;3. 6. 1. 2.不能漏料，滤液要求澄清透明，滤液流入贮料罐内贮存;3. 6. 1. 3.如有漏料立即关阀门不得放料进入浓縮工段；3. 6. 1. 4.板框拆开以后，菌丝体落进准备好的不锈钢板上；3. 6. 1. 5.用过滤布必须冲洗干净；3. 6. 1. 6.认真检査板框油压泵；3. 6. 2.化验条件化验多糖含量不低于5%。3. 7.浓縮3. 7. 1.操作前认真检査罐体上每个阀门，如有问题立即找人维修。 3. 7. 2.罐温控制在60-8(TC之间，蒸汽压力在MPaO.04-0.06左右； 真空罐真空度控制在0.06 0. 09MPa。3. 7. 3.在最上的加热管要露出来时加料，每次料要少加勤加，约 30分钟。3. 7. 4.浓縮到所有的料全部进完时，将两个缸的料合在一起，放 缸前将真空度下降，罐温度提高到9(TC左右。3. 7. 5.料浓縮到最上边的加热管露出取样测婆美度，然后就要勤 测婆美度控制在33-38即要出料(不同品种除外)。 3. 7. 6.每次取样、放料时，先停泵，真空回零后再取样测比重。 3. 7. 7.出料按SOP-SC-036-02执行.3. 7. 8.出料装桶时取样测多糖，测定结果同5.5.2。3. 7. 9.料出完彻底清洗罐内，用水冲刷罐，冲后加水，煮沸后放 水，不得有罐垢。4. 成品质量标准猴头菌流浸膏本品为齿菌科真菌小刺猴头Hericium Caput-Medusae(Bull.ex..Fr) Pere的发酵液与菌丝提取液的浓縮浸膏。多糖含量不得低于5% (费 林试剂法)。性状本品显褐色、气微香、味微苦。检査溶化性应不得有混悬物。多糖含量葡萄糖标准溶液的制备精密称取105"C干燥至恒 重的无水葡萄糖对照品O.lg，置100ml量瓶中，加水溶解，并稀释 至刻度，摇匀，即得(每lml中含无水葡萄糖lmg)。标准曲线的制备精密量取葡萄糖标准溶液0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1.0、 1.2、 1.4、 1.6ml，分别置于25ml量瓶中，加水至2.0mL，分 别精密加3， 5-二硝基水扬酸试液1.5ml，混匀，在沸水浴中加热5 分钟，取出，立即用冷水冷却至室温，加水稀释至刻度，摇匀，用 水作空白，照分光光度法(《中华人民共和国药典》2005年版二部 附录IVA)在520nm的波长处测定吸光度，绘制标准曲线。供试品溶液的制备取本品lg，精密称定，置50ml量瓶中，加 水30ml， 50"C水浴加热20分钟，取出，冷却至室温，加水稀释至 刻度，摇匀，滤过，即得。
测定法总糖的测定精密量取供试品溶液2ml置25ml量瓶中， 加6mol/L盐酸溶液5ml，水5ml，在沸水浴中加热30分钟，冷却 后加酚酞指示液1滴，用20%氢氧化钠溶液调节至微红色，加水至 刻度，滤过，精密量取滤液lml，照标准曲线制备项下的方法，自 "加水至2.0ml起"，依法测定吸光度，从标准曲线中读出糖的浓度 值，即得。单糖的测定精密量取供试品溶液2ml，置10ml量瓶中，加水至 刻度，摇匀，滤过，精密吸取滤液lml，照标准曲线制备项下的方 法，自"加水至2.0ml"起，依法测定吸光度，从标准曲线中读出 糖的浓度，即得。多糖的浓度按总糖的浓度，减去单糖的浓度。多糖含量不得低于5.0%。
权利要求
1、治疗胃部疾病的小刺猴头菌(Hericium caput-medusae)发酵浸膏的制备方法，包括小刺猴头纯菌株的斜面菌种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、一级种子罐培养、二级种子罐培养、发酵、发酵液加热、过滤、浓缩。
2、 根据权利要求1的方法，所述斜面培养的温度为27±1° C， 时间为7—9天，摇瓶种子培养、种子罐培养和发酵的温度为27±1° C， 时间为5 — 7天，发酵液加热的温度为100° C。
3、 根据权利要求1的方法，所述斜面培养的培养基配方为马铃 薯100:葡萄糖l:磷酸二氢钾l:琼脂1。
4、 根据权利要求1的方法，所述摇瓶培养的培养基配方为葡萄 糖3_4%，磷酸二氢钾0.03%，蛋白胨O. 3%，氯化钠0.05%，维 生素B1适量，聚醚消沫剂适量。
5、 根据权利要求1的方法，所述种子罐培养和发酵的培养基配 方为葡萄糖0.3%，磷酸二氢钾0.03%，蛋白胨O. 3。％，氯化钠0.05 。％，维生素B1适量，聚醚消沫剂适量。
全文摘要
一种小刺猴头的发酵，涉及猴头菌丝体的发酵，属于含有真菌的医用配制品。其制备方法，包括小刺猴头纯菌株的斜面菌种培养、一级摇瓶种子培养、二级摇瓶种子培养、一级种子罐培养、二级种子罐培养、发酵、发酵液加热、过滤、浓缩。
文档编号C12N1/14GK101396379SQ20081005123
公开日2009年4月1日 申请日期2008年9月28日 优先权日2008年9月28日
发明者屹 冯, 刘淑芳, 孙立群, 李凤才, 李敬轩 申请人:白求恩医科大学制药厂