专利名称：从猴头菌丝体发酵产物提取的猴头菌丝体寡糖及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及从猴头菌丝体发酵产物提取的猴头菌丝体寡糖及其 应用，尤其涉及在制药领域中的应用；IPC分类号为A61K 36/06。
背景技术：
本发明所称的猴头菌为齿菌科真菌小刺猴头菌(Hericium caput-medusae)，其菌丝体的发酵产物多年来作为原料药应用于临 床。关于小剌猴头菌的发酵，可以采用本领域常用的深层培养通气搅 拌条件；例如参见《微生物通报》1985年第12巻第5期第198至200页。
我国市场上以猴头菌丝体培养浸膏为原料制成的药品有胃乐新 冲剂。尽管该制剂对胃、十二指肠溃疡、慢性胃炎等显示出良好的疗 效，但对菌丝体中有效成分的提取、分离、纯化方法及活性成分的基 本化学组成等问题仍未得到解决，长期以来一直制约着猴头菌丝体的 开发和利用。
通过对猴头菌丝体中有效成分的提取、分离、纯化得到了猴头菌 丝体寡糖，其基本化学结构为-
HPGPC分析结果表明，该化合物的分子量分布在O. 36-1. 5X 103， 说明该化合物主要为寡糖类成分；理化性质结果表明，糖的含量占 90%左右；组成糖分析结果表明，该化合物主要由Man， Glc两种单
糖组成，摩尔比为l: 5;液一质结果表明，该化合物主要由2—7个
单糖连接的寡糖构成，其中双糖和三糖各占20%左右，其它为四糖、
五糖、六糖、和七糖，还有少量的单糖。双糖、四糖、五糖均有两种
构型，六糖有三种构型，三糖和七糖有一种构型。采用HPLC法，氨 基柱纯化分离得到的双塘、三糖，利用丽R， LC-MS，GG-MS，GC及甲基 化分析，推测双糖是以a —Glcl—4a-Glc和a-Glcl—6Man(或a-Manl —6Glc)两种形式存在，三糖是以a—Glcl—4a—Glcl—6a-Glc形 式存在。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供猴头菌丝体寡糖及其用途，尤其 在制药中的应用。
实际上本发明提供猴头菌丝体寡糖作为制备治疗胃部疾病的药 中的应用。
为了更好地理解本发明，下面给出猴头菌丝体寡糖的提取方法， 以及药理试验来说明其在制药领域中的用途。 方法l
将猴头菌丝体发酵浸膏10kg，加水1-2倍稀释，搅拌，离心， 离心液加乙醇至醇浓度为80%，离心，收集沉淀，加蒸馏水配成水 溶液，对透析膜分子量范围8仟-1万水透析，收集透析外液，浓縮 至浸膏lkg，冷冻干燥，得猴头菌丝体寡糖800g。
方法2
取猴头菌丝发酵浸膏10kg，加水1-2倍稀释，搅拌，离心，离
心液加乙醇至醇浓度为80%，离心，收集沉淀lkg，加蒸馏水配成水 溶液，通过DEAE-S印hadexA50离子交换树脂柱，分别用蒸馏水洗脱， 收集洗脱液，浓縮至浸膏，冷冻干燥，得猴头菌丝体寡糖780g。 方法3
取猴头菌丝发酵浸膏10kg，加水1-2倍稀释，搅拌，离心，离 心液加乙醇至醇浓度为80%，离心，收集沉淀1 kg，加蒸馏水配成 水溶液。通过分子量范围在8仟一1万的中空纤维超滤，得到猴头菌 丝体寡糖800g。
经过药理学实验筛选，上述化合物具有治疗急、慢性胃炎，胃溃 疡，慢性萎縮性胃炎效果。
按药剂学方法，猴头菌丝体寡糖能够制备多种临床药物制剂作为 治疗急、慢性胃炎，胃溃疡，慢性萎縮性胃炎的药物，所说的药剂是 任何一种药剂学上所说的剂型，特别是作为各种口服剂型。
本发明的药物含有治疗有效量的上述化合物为活性成分，以及含 有一种或多种药学上可以接受的载体。
上文的载体是指药学领域常规的药物载休，包括稀释剂、赋形刑、 填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附 载体。
本发明药物可以通过口服、直肠、静脉、肌肉注射或胃肠外给药 方式施用于这种治疗的患者。按照药学领域的常规生产方法制备各种 剂型如片剂、颗粒剂、冲剂、胶囊、栓剂、喷雾剂、缓释剂和注射剂。 也可使其活性成分或组合物与多种载体或药物混合，制成所需剂型。 下述的药理实验证实了猴头菌丝体寡糖的药物制剂具有治疗急、 慢性胃炎，胃溃疡，慢性萎縮性胃炎的药理活性。 一、猴头菌提取物对乙酸所致损伤型胃溃疡的影响
摘要本实验观察猴头菌寡糖对乙酸所致损伤型胃溃疡大鼠的影
响。分别连续灌胃给予乙酸所致损伤型胃渍疡大鼠4S0mg / kg猴头菌 寡糖14天，对乙酸所致损伤型胃溃疡均有显著的抑制作用。
药物阳性药为胃乐新，由白求恩医大药厂生产，批号041205。 动物220-260g雄性大鼠。购自中国人民解放军208医院动物室。
方法取大鼠禁食不禁水48小时，乙醚麻醉，仰位固定，腹部 去毛，碘酒、酒精消毒，剑突下正中开2.5cm左右的切口，用弯止血 钳在右肝脏下方将十二指肠轻轻勾出，将胃部轻轻拉出腹外，在胃的 腹侧面胃体部与幽门窦交界处，用0.25ml注射器刺入大鼠胃浆膜下 0.4-0.5mm，注入10%醋酸溶液0. 05ml，将胃轻轻送回，缝合腹壁肌 层及皮肤，消毒后常规词养，于术次日起，分组，连续给药14天， 末次给药2h，断头，结扎幽门和贲门，胃浸于1%甲醛液中，固定 10分钟，沿胃大弯剪开，外翻洗涤，在注射醋酸溶液相应部位的粘 膜面观察溃疡形成情况，以溃疡最长径和最短径的均值作为溃疡直 径，计算溃疡指数。见表l。
表1.猴头菌提取物对乙酸所致损伤型胃溃疡的影响
组别 剂量mg/kg 溃疡直径mm 溃疡愈合百分率％
模型组 5. 13±1. 13
阳性组 480 3.63士1.39※ 29.24
猴头菌寡糖 480 3.46 ±0.89※※※ 32.55
猴头菌寡糖 240 4. 04 ±1. 09※ 21.25
注n=8，义士SD。※P〈0.05，※※※P〈0.001。
小结480mg/kg猴头菌寡糖14天，对乙酸所致损伤型胃溃疡 均有显著的抑制作用。480mg/kg对乙酸所致损伤型胃溃疡的抑制作 用尤其显著。
二，猴头菌提取物对应激性胃溃疡的影响
摘要采用应激性胃溃疡模型比较猴头菌提取物与胃乐新的抗溃 疡作用。
分别连续灌胃给予大鼠4S0mg / kg猴头菌寡糖15天，结果猴头菌寡 糖具有明显的抗溃疡作用。
动物Wister大鼠32只，购自白求恩医科大学动物室。 药物阳性药为胃乐新，由白求恩医大药厂生产，批号041205。 方法取大鼠50只，随机分为5组，每组10只，每天灌胃给予 480mg/kg猴头菌寡糖及胃乐新各一次，对照组给予常水，连续给予 15天，第14天给药后将大鼠饥饿32h，次日下午16时用乙醚麻醉， 将大鼠四肢用蝇绑在铁笼上，同时将绑完的大鼠头朝下，垂直放置 18h，将动物拉颈处死。将其胃的贲门及幽门结扎，取全胃，并向内 注入lQ/。福尔马林固定5min后，沿胃大弯剪开，平展于玻璃扳上，观 察判断等级。
结果对照组为3. 87±0.35， 480mg/kg猴头菌寡糖为2.38士 1. 51 (P〈0. 05)，胃乐新为2. 13±1. 13(P<0. 001)。 由此可见猴头菌寡糖有非常明显的抗溃疡作用。
三、猴头菌提取物对大鼠慢性萎縮性胃炎实验研究
摘要采用主动免疫加灌服胆汁及热水的综合方法观察猴头菌寡
糖对大鼠慢性萎縮性胃炎CAG的治疗作用，结果Xmg/kgHl、 Xmg /kgL2可明显改善CAG大鼠胃粘膜的变薄，并使胃黏膜固有腺体增 多，有良好的治疗CAG的作用。 1.实验材料及方法
1. l动物Wistar雄性大鼠，购自长春高新医学动物实验研究中心， 合格10—5112，体重220—260g。
1. 2药物阳性药为胃乐新，由白求恩医大药厂生产，批号041205。 1. 3模型的制备-
1. 3 . 1佐剂抗原的制备取160—180gWistar大鼠，将其饥饿 24h后处死取胃黏膜，每只鼠胃黏膜加生理盐水3ml，利用组织匀浆机 将其打匀，然后加入等体积液体石腊制备成均匀的乳剂，备用。 1.3. 2模型的制备取220—260g大鼠90只，在每只大鼠2点背 部皮下注射佐剂抗原2ml，每点lml， 2周后重复1次，再1周后又 重复1次,共免疫3次；自免疫起每隔3天给人鼠灌服猪胆汁2ml / 只(胆汁甘油=1:1);同时除灌服猪胆汁当天外，每天连续灌服35 天55"C热水。
1.3. 3动物处理首次免疫35天处死10只大鼠取胃作组织形态学 检测，可见胃黏膜腺体变薄，胃腺体减少，个别胃可见有溃疡、出血、 粘膜下大量细胞浸润。
1. 3. 4分组及给药将余下大鼠随机分为六组，即模型对照组，每天给予常水4ml /只，480mg / kg胃乐新，480mg / kg猴头菌寡糖， 每天给药1次，连续给药30天，并于每周称重l次。
1. 3. 5对胃粘膜病理组织中变化的影响动物自胃窦沿小弯至贲 门取材，包埋切片。采用？检验。
2. 结果-
2. 1对胃黏膜组织形态学的影响
从表2可见，模型组胃黏膜变薄、腺体减少等现象的阴性率还是 明显高于给药组，并伴有大量炎细胞浸润从肌层增厚而猴头菌寡糖对 上述现象均有明显的抑制作用而且未见肌层增厚现象。 2. 2对慢性萎縮性胃炎大鼠体重变化的影响见表3。表3表明， 对慢性萎縮性胃炎大鼠体重的变化无影响。
小结上述结果表明，猴头菌寡糖对大鼠慢性萎縮性胃炎有一定
的治疗作用。
表2. 对慢性萎縮性胃炎胃粘膜组织形态学的影响
组别剂量动物数胃粘膜变薄胃腺的减少血管充血或出血
mg / kg阴性阴性阴性
模型对照组109107
阳性药■122承54
猴头菌寡糖480102氺2氺4
猴头菌寡糖240124承56
注同表l。
表3. 对慢性萎縮性胃炎大鼠体重变化的影响
组别剂量;f 体重变化
mg/kg只 0周 l周 2周 3周 4周
模型对照 ^~256.6~~± 262.8"""± 281.0~± 280.4~± 283.7~~^ 组 18.6 17.9 25.5 27.0 27.3
阳性药 480 12 猴头菌寡
480 12
猴头菌寡 糖
240 12
257.9 ± 264.4 ± 274.5
17.522.5 23.2
254. 1 ± 271.6 ± 278.4
19. 125. 0 29. 3
262.8 ± 280.2 ± 291.8
17. 726. 3 27. 3
± 275.3 ± 280.9 ±
23. 4 24. 0
± 275.3 ± 283.7 ±
32.2 31.7
± 281.6 土 290.6 ±
24. 9 29. 5
从以上结果可以得出本发明的优点在于有效部位明确,结构清 楚,服用量少，对于治疗急、慢性胃炎，胃溃疡，慢性萎縮性胃炎有 显著的疗效。并优于阳性对照药。
具体实施例方式
实施例1
将猴头菌丝体发酵浸膏10kg，加水1-2倍稀释，搅拌，离心， 离心液加乙醇至醇浓度为80%，离心，收集沉淀，加蒸馏水配成水 溶液，对透析膜分子量范围8仟-1万水透析，收集透析外液，浓縮
至浸膏lkg，冷冻干燥，得粉状猴头菌寡糖800g，装入药瓶中密封，
消毒制成产品。
实施例2
取猴头菌丝发酵浸膏10kg，加水1-2倍稀释，搅拌，离心，离 心液加乙醇至醇浓度为80%，离心，收集沉淀lkg，加蒸馏水配成水 溶液，通过DEAE-S印hadexA50离子交换树脂柱，分别用蒸馏水洗脱， 收集洗脱液，浓縮至浸膏，冷冻干燥，得猴头菌寡糖780g，装入药 瓶中密封，消毒制成产品。
实施例3
取猴头菌丝发酵浸膏10kg，加水1-2倍稀释，搅拌，离心，离 心液加乙醇至醇浓度为80%，离心，收集沉淀1 kg，加蒸馏水配成
水溶液。通过分子量范围在8仟一l万的中空纤维超滤，得猴头菌寡
糖800g，装入药瓶中密封，消毒制成产品。
权利要求
1、从小刺猴头菌(Hericium caput-medusae)菌丝体的发酵浸膏提取的猴头菌丝体寡糖。
2、 权利要求1所述猴头菌丝体寡糖的应用，用于制备治疗胃部 疾病的药物。
3、 根据权利要求2的应用，所述胃部疾病是胃炎疾病。
4、 根据权利要求2的应用，所述胃部疾病是胃溃疡疾病。
5、 根据权利要求3的应用，所述胃炎疾病是慢性萎縮性胃炎疾病。
6、 一种猴头菌丝体寡糖的提取方法，将猴头菌丝体发酵浸膏 10kg，加水1-2倍稀释，搅拌，离心，离心液加乙醇至醇浓度为80 。％，离心，收集沉淀，加蒸馏水配成水溶液，对透析膜分子量范围8 仟-1万水透析，收集透析外液，浓縮至浸膏lkg，冷冻干燥，得猴头 菌丝体寡糖800g。
7、 一种猴头菌丝体寡糖的提取方法，取猴头菌丝发酵浸膏10kg， 加水l-2倍稀释，搅拌，离心，离心液加乙醇至醇浓度为80%，离 心，收集沉淀lkg，加蒸馏水配成水溶液，通过DEAE-S印hadexA50 离子交换树脂柱，分别用蒸馏水洗脱，收集洗脱液，浓縮至浸膏，冷 冻干燥，得猴头菌丝体寡糖。
8、 一种猴头菌丝体寡糖的提取方法，取猴头菌丝发酵浸膏10kg， 加水l-2倍稀释，搅拌，离心，离心液加乙醇至醇浓度为80。％，离心， 收集沉淀1 kg，加蒸馏水配成水溶液。通过分子量范围在8仟一l万的中空纤维超滤，得到猴头菌丝体寡糖(
全文摘要
从猴头菌丝体发酵产物提取的猴头菌丝体寡糖及其应用，涉及从猴头菌丝体发酵产物提取的猴头菌丝体寡糖及其应用，将猴头菌丝体发酵浸膏加水稀释，搅拌，离心，离心液加乙醇至醇，离心，收集沉淀，加蒸馏水配成水溶液，对透析膜透析，收集透析外液，浓缩至浸膏，得猴头菌丝体寡糖。其有效部位明确，结构清楚，服用量少，对于治疗急、慢性胃炎，胃溃疡，慢性萎缩性胃炎有显著的疗效。
文档编号C07H1/00GK101375867SQ200810051238
公开日2009年3月4日 申请日期2008年9月28日 优先权日2008年9月28日
发明者屹 冯, 刘淑芳, 孙立群, 李凤才, 李敬轩 申请人:白求恩医科大学制药厂