流脑多糖联合疫苗及制备工艺的制作方法

专利名称：：流脑多糖联合疫苗及制备工艺的制作方法
技术领域：
：-本发明涉及流脑多糖联合疫苗的制备方法，尤其是提供了流脑多糖联合疫苗制剂及制备工艺，用于脑脊髓膜炎重要疫病的免疫预防，属于疫苗生产制备
技术领域：
。技术背景-流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌(Meningococcus)引起的细菌性脑膜炎(简称流脑)，为急性呼吸道传染病。主要临床表现为发热、头痛、呕吐、皮肤粘膜瘀点、瘀斑及脑膜刺激征。重者可有败血症性休克和脑膜脑炎。此病发病急，病死率高，且在各年龄组中都可发生，15岁以下儿童发病占75%以上。为有效控制流行性脑脊髓膜炎的发生，应提前预防接种疫苗。1984年Ambrosch等制备出A、C、W135和Y群四联流脑多糖菌苗，对成人志愿者免疫后，血清阳转率分别达到92.5%、92.5%、97.5%和95%，免疫效果是肯定的。WHO与1976年制定了单价A群和C群流脑多糖菌苗的制检规程，又于1980年进行了修订；补订了W135、Y群流脑多糖菌苗及A和C，A、C、W135及Y群二联和四联多糖菌苗制检规程。适合中国人群的A、C、W135和Y群四联流脑多糖菌苗未见公开文献报道。
发明内容本发明提供一种流脑多糖联合疫苗，具有一针多种免疫的功能。本发明的流脑多糖(ACYWn5群)联合疫苗，每支成品(复溶后体积0.5ml)含以下组分及含量A群脑膜炎球菌多糖疫苗50UgC群脑膜炎球菌多糖疫苗50ixgY群脑膜炎球菌多糖疫苗50"gW135群脑膜炎球菌多糖疫苗50yg乳糖2.53.0tng。本发明联合疫苗的制备工艺，包括以下步骤.-1.菌种的的选用选用A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟氏球菌，用于冻干ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备。2.生产用菌种启开工作种子批，经传代，经检定合格后，接种于改良半综合培养基或其他适宜培养基，制备数量适宜的生产用种子。3.生产用培养基采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基。培养基不应含有与十六垸基三甲基溴化铵形成沉淀的成分。4.培养采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。5.收获和杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。6.去核酸将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六垸基三甲基溴化钹，充分混匀，形成沉淀;离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六垸基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%,2—8'C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。7.沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20'C以下，待纯化。8.多糖纯化将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按l:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行。9.内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2um滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。10.半成品配制及分装将检定合格的ACYWu5群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。11.冻干将ACYW,35群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为-35匸预冻2小时，制品-40'C冷冻4~5小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，3(TC以下恒温真空干燥5~6小时，全过程累计2024小时，制备出冻干ACYWw群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。12.成品检定根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。本发明生产工艺的特点培养基不含有马血清或其他致敏物质；不含有能与cetavlon形成沉淀的成分或有害物质；培养基适于脑膜炎球菌繁殖生长，并适于产生丰厚的荚膜多糖物质；常用酸水解酪蛋白做基础液，加入酵母透析液、硫酸镁、葡萄糖等制成半综合培养基。美国则采用Frantz培养基，pH7.47.6。本发明与WHO规程有几点不同①细菌培养时间不通，WH0规程培养10-12h，国内只培养6-8h;②冊0规程对中间产品进行冻干，国内则放低温(-2(TC)保存；我国ACYW135群流脑多糖疫苗质量控制指标与WHO规程比较见表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明的积极效果在于运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACYW135脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACYWu5群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打四针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。实施例1:200502批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、W,35群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25。C不生长。于35—37。C二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将己杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六烷基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8'C静置1—3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%,充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一20。C以下，待纯化。4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15'C以下进行。5、内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2"m滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。6、半成品配制及分装将检定合格的A、C、Y、Wu5群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。6、冻干将ACYW。5群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为-35°0预冻2小时，制品-4(TC冷冻4~5小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，3(TC以下恒温真空干燥5~6小时，全过程累计2024小时，制备出冻干ACYW。5群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。实施例2:200503批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、Wu5群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25'C不生长。于35—37'C二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六垸基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lraol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8。C静置l一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%,充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一2(TC以下，待纯化。4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.1mol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15。C以下进行。5、内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2Pm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。6、半成品配制及分装将检定合格的A、C、Y、Wu5群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。6、冻千将ACYWu5群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，步骤为-35匸预冻2小时，制品-4(TC冷冻4~5小时，逐渐升温真空干燥1012小时，30'C以下恒温真空干燥56小时，全过程累计2024小时，制备出冻干ACYWn5群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。实施例3:200504批ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗的制备1、取A群脑膜炎球菌29201菌株、C群脑膜炎球菌29205菌株、Y群脑膜炎球菌29028菌株、Ww群脑膜炎球菌29037菌株，接种于含10%羊血普通琼脂培养基，脑膜炎球菌在25'C不生长。于35—37'C二氧化碳的环境中培养16—20小时，长出光滑、湿润、灰白色的菌落，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中显现均匀混悬液。染色镜检应为革兰阴性双球菌、单球菌。2、采用培养罐液体培养。在培养过程中取样进行纯菌检査，涂片做革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌，应废弃。于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养。取样进行菌液浓度测定及纯菌检查，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌。以确保杀菌安全又不损伤其多糖抗原为宜。3、将已杀菌的培养液(单批或多批混合)离心后收集上清液，加入十六垸基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8'C静置l一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液。于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%，充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一2(TC以下，待纯化。4、将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达10—20mg/ml;按h2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用O.lM)l/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液。提取过程应在15。C以下进行。5、内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.2wm滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量。6、半成品配制及分装将检定合格的A、C、Y、Wi35群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空干燥，放28'C库待检。6、冻干将ACYWn5群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，歩骤为-35°(:预冻2小时，制品-40'C冷冻45小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，3(TC以下恒温真空干燥5~6小时，全过程累计2024小时，制备出冻干ACYWns群脑膜炎球菌多糖疫苗成品，根据现行版《中华人民共和国药典》相关要求进行全面检定。试验例l1、按《中华人民共和国药典》2005版三部对A群脑膜炎球菌多糖疫苗制品的要求，我们对ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗进行热原质试验，以保证制品的安全性。试验方法根据《中华人民共和国药典》2005版三部A群脑膜炎球菌多糖疫苗制造及检定3.4.4项A群脑膜炎球菌多糖疫苗热原质试验方法，将三批的ACYW,35群脑膜炎球菌多糖疫苗每批取样，注射剂量按家兔体重每1Kg注射0.1!xg多糖。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在初试3只家兔中,体温升高均低0.6'C,并且3只家兔体温升高总和低T1.4°C。2、按《中华人民共和国药典》2005版三部对A群脑膜炎球菌多糖疫苗制品的要求，我们对ACYWn5群脑膜炎球菌多糖疫苗进行异常毒性试验，以保证制品的安全性。试验方法根据《中华人民共和国药典》2005版三部A群脑膜炎球菌多糖疫苗制造及检定3.4.3项要求，将三批ACYWu5群脑膜炎球菌多糖疫苗每批取样各100支，每批注射体重1822g小白鼠5只、每只腹腔注射(0.5ml/支)，250~350g豚鼠2只，每只腹腔注射(5ml/支)，于注射后第7天进行观察，动物应健康存活，到期体重比注射前增加。结果按上述方法三批制品分别注射健康豚鼠二只、小白鼠五只，观察结果见表l、表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1.一种流脑多糖联合疫苗，每支成品(复溶后体积0.5ml)含以下组分及含量A群脑膜炎球菌多糖疫苗50μgC群脑膜炎球菌多糖疫苗50μgY群脑膜炎球菌多糖疫苗50μgW135群脑膜炎球菌多糖疫苗50μg乳糖2.5～3.0mg。2.权利要求1所述的疫苗为冻干剂型。3.权利要求1所述的疫苗制备方法，包括以下步骤(1)菌种的的选用选用A、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟氏球菌；(2)生产用菌种启开工作种子批，经传代，检定合格后，接种于改良半综合培养基，制备生产用菌种；(3)生产用培养基采用改良半综合培养基或经批准的其他适宜培养基；(4)培养采用培养罐液体培养，在培养过程中取样进行纯菌检查，涂片做革兰氏染色镜检，废弃污染杂菌；(5)收获和杀菌于对数生长期的后期或静止期的前期终止培养；取样进行菌液浓度测定及纯菌检査，合格后在收获的培养液中加入甲醛溶液杀菌，或采用加热方法杀菌；(6)去核酸将已杀菌的培养液离心后收集上清液，加入十六垸基三甲基溴化铵，充分混匀，形成沉淀；离心后的沉淀物加入适量氯化钙溶液，其最终浓度为lmol/L，使多糖十六烷基三甲基溴化铵解离，加入乙醇至最终浓度为25%，2—8。C静置1一3小时或过夜，离心收集澄清的上清液；(7)沉淀多糖于上述上清液中加入冷却乙醇至最终浓度为80%,充分振摇，离心收集沉淀，用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，将沉淀物即为多糖粗制品，应保存在一2CTC以下，待纯化；(8)多糖纯化将粗制品溶解于1/10饱和中性醋酸钠溶液中，使其浓度达io—20mg/ml;按1:2容量用冷酚(100g结晶酚溶于40ml的1/10饱和醋酸钠溶液)提取数次，离心收集上清液，并用0.lmol/L氯化钙溶液或其他适宜溶液透析，加入乙醇至终浓度为75%80%;离心收集的沉淀物用无水乙醇及丙酮各洗2次以上，干燥后用灭菌注射用水溶解沉淀物，即为纯化多糖原液；(9)内毒素去除取A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖原液，经超速离心法除去内毒素，在用0.21im滤膜除菌后取样检测，以凝胶法测定内毒素含量(10)半成品配制及分装将检定合格的A、C、Y、Wn5群脑膜炎球菌多糖原液与乳糖按比例混合均匀后，按要求进行分装，分装量0.5mL/瓶，分装后迅速进行冷冻真空千燥，放28"C库待检；(11)冻干将ACYWn5群脑膜炎球菌多糖疫苗半成品进行冷冻干燥，-35"预冻2小时，制品-40。C冷冻45小时，逐渐升温真空干燥10~12小时，3(TC以下恒温真空干燥56小时，全过程累计2024小时，制备出冻干疫苗成品。全文摘要本发明提供一种流脑多糖联合疫苗，运用超速离心法除去内毒素技术制备冻干ACYW135脑膜炎球菌多糖疫苗，从而确保ACYW₁₃₅群脑膜炎球菌多糖原液的内毒素含量较离心前大大降低。使用本发明疫苗对患者来说一针就可以预防流脑的疾病传染，达到并超过以前打四针才能达到的预防效果，减少了患者的痛苦，降低了预防成本。文档编号A61P31/00GK101428144SQ20081005162公开日2009年5月13日申请日期2008年12月19日优先权日2008年12月19日发明者孙惠军,爽巨,冲李,杨宗辉申请人:长春长生生物科技股份有限公司