一种流脑疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种流脑疫苗。该流脑疫苗由A群脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria?meningitidis）发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水组成。实验证明，本发明方法制备的多糖中内毒素含量非常低，为1EU/μg，由该多糖制成的疫苗中内毒素含量非常低，为1EU/μg。本发明的疫苗安全、有效，接种后不良反应更小，利于受众接纳，有利于国家预防免疫政策推广。
【专利说明】一种流脑疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种四价流脑多糖疫苗及其制备方法及工艺。
【背景技术】
[0002]流行性脑脊髓膜炎，是由脑膜炎双球菌感染脑膜或者脑脊髓膜引起的呼吸道传染病，临床表现主要有高烧、头痛、喷射状呕吐、脖子发硬。也可引起败血症，皮肤出现紫色淤血、瘀斑，脑膜炎会引起脑部损伤而遗留听力下降或耳聋、智力低下等后遗症。病死率在5%~10%。流脑冬春季节病例高发，一般11~12月份病例开始增多，第二年的2~5月份为发病高峰期。该病是发病率高，危险性大，是严重危害儿童健康的传染病。流行性脑脊髓膜炎(流脑)和败血症是由多种血清群的脑膜炎奈瑟菌引起的，本病在全球呈地方性流行，主要由A群、B群或C群脑膜炎球菌引起，但Y群也变得越来越重要，至少在美国部分地区如此。A群脑膜炎球菌是较大流行的主要致病血清群，特别是在所谓的非洲“流脑流行带”，每隔7~14年就会出现一次较大流行，引起儿童和年轻成人超额发病率与死亡率。近年来，这些地区及沙特阿拉伯也出现过W135群导致的流脑爆发，一些西方国家则出现过C群引起的流脑爆发。即使是在医疗条件比较完善的地方，流脑病死率仍然很高(5%~15%)。一般来说，仅靠药物预防措施来控制此病是不够的。
[0003]目前主要采取注射流脑疫苗的方式来预防流行性脑脊髓膜炎。我国主要接种A群脑膜炎多糖疫苗和/或AC群脑膜炎多糖疫苗为主，研制多价疫苗和联合疫苗是疫苗发展方向，但是疫苗中的非主要成分的叠加又会带来副反应大的问题，如何有效去除细菌内毒素是其中最为突出的难题。细菌内毒素是革兰氏阴性杆菌的细胞壁成分之一，是一种脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),LPS是脑膜炎球菌感染的主要致病物质,进入人体能引起机体发热，又称为热原质。按照现有的脑膜炎多糖疫苗的细菌内毒素药典标准，大部分人接种疫苗只有非常轻微的发热反应，但是个别人会因此出现严重发热反应。因此，去除流脑多糖中的细菌内毒素，减少疫苗不良反应，是研制多价疫苗和联合疫苗，提高疫苗品质的关键技术。`
【发明内容】
[0004]本发明的一个目的是提供一种四价流脑疫苗及其制备方法和工艺。
[0005]本发明所提供的流脑疫苗，由A群脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水组成；
[0006]其中，A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70yg/ml~130 μ g/ml，C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70 μ g/ml~130 μ g/ml，Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70 μ g/ml~130 μ g/ml，W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μ g/ml~130μ g/ml，乳糖在疫苗中的浓度为5mg/ml~10mg/ml。[0007]上述流脑疫苗可按照如下方法制备。
[0008]本发明所提供的流脑疫苗的制备方法，包括如下步骤:
[0009](1)分别发酵A群脑膜炎奈瑟氏球菌、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌，得到的发酵液依次记作A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、Wl35菌发酵液；
[0010](2)分别从A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、Wl35菌发酵液中分离多糖，将得到的多糖依次记作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖；
[0011](3)将A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用QS印haroseFF琼脂糖凝胶进行柱层析，收集洗脱峰，即分别得到由A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖；
[0012](4)将由A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水按照权利要求1中所述浓度进行混合，即得到流脑疫苗。
[0013]上述制备方法中，所述步骤(3)中，用QS印haroseFF琼脂糖凝胶进行柱层析的方法中，上样的样品为分别将步骤(2)得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用水溶解后得到的多糖浓度为10~20mg/ml的溶液， 洗脱液为生理盐水，监测波长为206nm，收集第一峰。
[0014]上述制备方法中，在所述柱层析之后，还包括如下超滤脱盐步骤:将柱层析收集的样品用截留分子量为IOOkD的膜包，用10~20倍体积水进行洗滤脱盐。
[0015]上述制备方法中，在所述超滤脱盐步骤之后，还包括如下除菌步骤:将脱盐样品用
0.2μπι孔径膜进行除菌过滤。
[0016]上述制备方法中，所述步骤(2)中，从发酵液中分离多糖的方法包括如下步骤:
[0017]I)分别去除A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液和W135菌发酵液中的菌体；
[0018]2)为如下a)和/或b):
[0019]a)、用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中的多糖，分别收集沉淀；
[0020]b)、先用截留分子量为30kD的超滤膜分别对去除菌体的Y菌发酵液或去除菌体的W135菌发酵液进行超滤浓缩，得到Y菌浓缩液或W135菌浓缩液；再用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中的多糖，分别收集沉淀；
[0021]3)、用氯化钙分别将步骤2)所得沉淀中的多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离，得到解离液；
[0022]4)、用95%乙醇水溶液分别去除步骤3)的解离液中的杂质，收集上清液；
[0023]5)、用95%乙醇水溶液分别从步骤4)的上清液中沉淀多糖，收集沉淀；
[0024]6)、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤5)所得沉淀；
[0025]7)、分别将步骤6)洗涤后沉淀进行干燥；
[0026]8)、将步骤7)所得干燥后沉淀用1:10饱和中性醋酸钠水溶液溶解，分别得到粗糖溶液，依次记作A菌粗糖溶液、C菌粗糖溶液、Y菌粗糖溶液、Wl35菌粗糖溶液；
[0027]9)、用酚分别对步骤8)所得粗糖溶液进行提取，弃去中层及酚层，收集上层液；[0028]10)、用氯化钙水溶液分别对步骤9)所得上层液进行透析，收集透析后的溶液；
[0029]11)、用95%乙醇水溶液分别对步骤10)所得透析后的溶液进行沉淀，收集沉淀；
[0030]12)、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤11)所得沉淀；
[0031]13)、分别将步骤12)洗涤后沉淀进行干燥，分别得到A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖。
[0032]上述制备方法中，所述步骤2)的a)中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体A菌发酵液或去除菌体C菌发酵液中多糖的方法包括如下步骤:分别向所述去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合液中的浓度为0.1%~0.3% (质量百分含量)，在温度为10~15°C的条件下搅拌反应0.5~I小时，再静置10~16小时，离心，收集沉淀；
[0033]上述制备方法中，所述步骤2)的b)中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中的多糖的方法包括如下步骤:分别向所述Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.1%~0.3% (质量百分含量)，在温度为10~15°C的条件下搅拌反应0.5~I小时，再静置10~16小时，离心，收集沉淀；
[0034]上述制备方法中，所述步骤3)中，用氯化钙解离的方法包括如下步骤:向所述沉淀中加入2mol/L氯化钙水溶液,2mol/L氯化钙水溶液与所述沉淀的配比为3~IOml:lg,再加入水，使氯化钙在体系中的最终浓度为lmol/L，搅拌I~3小时，使多糖与十六烷基三
甲基溴化铵解离；
[0035]上述制备方法中，所述步骤4)中，用95%乙醇水溶液分别去除步骤3)的解离液中的杂质的方法包括如下步骤:分别向解离液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为25%，混匀，在2~8°C静置I~3小时，离心去沉淀，收集上清液；
[0036]上述制备方法中，所述步骤5)中，用95%乙醇水溶液分别从步骤4)的上清液中沉淀多糖的方法包括如下步骤:向上清液中加入95%乙醇水溶液，至乙醇在混合液中的体积百分比为80%，混匀，在2~8°C条件下静置8~16小时，离心去上清，收集沉淀；
[0037]上述制备方法中，所述步骤8)中，所述1:10饱和中性醋酸钠水溶液由饱和醋酸钠水溶液和水组成，其中饱和醋酸钠水溶液与水的体积比为1:9,1:10饱和中性醋酸钠水溶液的PH值为7.0 ;各粗糖溶液中多糖的浓度均为10~25mg/ml ；
[0038]上述制备方法中，所述步骤9)中，用酚对粗糖溶液进行提取的方法包括如下步骤:分别向各粗糖溶液中加入2倍体积的酚，混匀，离心分离，弃去中层及酚层，收集上层液；
[0039]上述制备方法中，所述步骤10)中，用氯化钙水溶液透析的方法中，氯化钙水溶液的浓度为0.lmol/L ；
[0040]上述制备方法中，所述步骤11)中，用95%乙醇水溶液沉淀的方法包括如下步骤:向透析后的溶液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为80%，混匀，在2~8°C条件下静置8~16小时，离心去上清，收集沉淀。
[0041]上述制备方法中，所述发酵的方法包括如下发酵罐培养步骤:将菌种分别以5 XlOVml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的发酵罐中，37°C培养6~8小时，至对数生长后期，得到发酵液，将发酵罐中所有物质记作发酵液。
[0042]上述制备方法中，所述发酵的方法中，在所述发酵罐培养之前，还包括如下步骤:[0043]I)制备生产菌种:
[0044]第一代培养:将工作种子批菌种接种在10%羊血普通琼脂培养基上，放37°C、8%二氧化碳环境培养18小时；
[0045]第二代和第三代培养:将第一代菌种接种于流脑半综合培养基，37°C培养12小时；
[0046]将第二代菌种接种于流脑半综合培养基，37°C培养12小时；
[0047]2)第四代菌种罐培养
[0048]将第三代菌种以5X 108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的菌种罐中，37°C培养3~4小时。
[0049]其中，所述10%羊血普通琼脂培养基的组成及其在培养基中的浓度可为如下:胰蛋白胨，1% (质量)；酵母浸粉，0.3% (质量)；氯化钠，0.5% (质量)；牛肉浸膏，0.7% (质量)；琼脂粉，1.6% (质量)；注射用水，加至总量；新鲜去纤维羊血，10% (体积)；葡萄糖水溶液(葡萄糖水溶液浓度为50%)，I % (体积)。
[0050]上述任一所述疫苗或任一所述疫苗的制备方法中，所述A群脑膜炎奈瑟氏球菌为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株A4，其在CMCC的编号为29201 ；
[0051]所述C群脑膜炎奈瑟氏球菌为C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株Cl I，其在CMCC的编号为 29205 ；
[0052]所述Y群脑膜炎奈瑟氏球菌为Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株Y，其在CMCC的编号为29303 ；
[0053]所述W135群脑膜炎奈瑟氏球`菌为W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株W135，其在CMCC的编号为29055。
[0054]上述任一所述疫苗或任一所述疫苗的制备方法中，所述水均为生理盐水或无热源注射用水。
[0055]实验证明，本专利发明工艺制备的A群多糖、C群多糖、Y群多糖、W135群多糖中内毒素含量均非常低，为IEU/μ g，大大低于国家要求小于IOEU/μ g。由该多糖制成的疫苗中内毒素含量非常低，最高为lEU/yg。本发明的疫苗安全性很好，无明显的全身反应。
【具体实施方式】
[0056]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0057]本实施例中所使用的菌株为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株A4CMCC29201，C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株C11CMCC29205，Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株YCMCC29303，W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株W135CMCC29055，各菌株均购自中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。
[0058]10%羊血普通琼脂培养基的组成:
[0059]
【权利要求】
1.一种流脑疫苗，由A群脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水组成； 其中，A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μ g/ml~130 μ g/ml，C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70μ g/ml~130μ g/ml，Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70 μ g/ml~130 μ g/ml,W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖在疫苗中的浓度为70 μ g/ml~130 μ g/ml，乳糖在疫苗中的浓度为 5mg/ml ~10mg/ml。
2.根据权利要求1所述的流脑疫苗，其特征在于:所述流脑疫苗按照如下权利要求3~9中任一所述方法制备。
3.一种制备权利要求1中所述流脑疫苗的方法，包括如下步骤: (O分别发酵A群脑膜炎奈瑟氏球菌、C群脑膜炎奈瑟氏球菌、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌，得到的发酵液依次记作A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、W135菌发酵液； (2)分别从A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液、W135菌发酵液中分离多糖，将得到的多糖依次记作A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖； (3)将A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用QSepharose FF琼脂糖凝胶进行柱层析，收集洗脱峰，即分别得到由A群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖； (4)将由A群脑膜炎奈瑟氏`球菌发酵得到的多糖、C群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、Y群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖和W135群脑膜炎奈瑟氏球菌发酵得到的多糖、乳糖和水按照权利要求1中所述浓度进行混合，即得到流脑疫苗。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于:所述步骤(3)中,用QSepharoseFF琼脂糖凝胶进行柱层析的方法中，上样的样品为分别将步骤(2)得到的A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖分别用水溶解后得到的多糖浓度为10~20mg/ml的溶液，洗脱液为生理盐水，监测波长为206nm。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述步骤(2)中，从发酵液中分离多糖的方法包括如下步骤: O分别去除A菌发酵液、C菌发酵液、Y菌发酵液和W135菌发酵液中的菌体； 2)为如下a)和/或b): a)、用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中的多糖，分别收集沉淀； b)、先用截留分子量为30kD的超滤膜分别对去除菌体的Y菌发酵液或去除菌体的Wl35菌发酵液进行超滤浓缩，得到Y菌浓缩液或W135菌浓缩液；再用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中的多糖，分别收集沉淀； 3)、用氯化钙分别将步骤2)所得沉淀中的多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离，得到解离液； 4)、用95%乙醇水溶液分别去除步骤3)的解离液中的杂质，收集上清液；5)、用95%乙醇水溶液分别从步骤4)的上清液中沉淀多糖，收集沉淀； 6)、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤5)所得沉淀； 7)、分别将步骤6)洗涤后沉淀进行干燥； 8)、将步骤7)所得干燥后沉淀用1:10饱和中性醋酸钠水溶液溶解，分别得到粗糖溶液，依次记作A菌粗糖溶液、C菌粗糖溶液、Y菌粗糖溶液、Wl35菌粗糖溶液； 9)、用酚分别对步骤8)所得粗糖溶液进行提取，弃去中层及酚层，收集上层液； 10)、用氯化钙水溶液分别对步骤9)所得上层液进行透析，收集透析后的溶液； 11)、用95%乙醇水溶液分别对步骤10)所得透析后的溶液进行沉淀，收集沉淀； 12)、依次用无水乙醇和丙酮分别洗涤步骤11)所得沉淀； 13)、分别将步骤12)洗涤后沉淀进行干燥，分别得到A多糖、C多糖、Y多糖、W135多糖。
6.根据权利要求3或4或5所述的方法，其特征在于: 所述步骤2)的a)中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中的多糖的方法包括如下步骤:分别向所述去除菌体的A菌发酵液或去除菌体的C菌发酵液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合液中的浓度为0.1%~0.3% (质量百分含量)，在温度为10~15°C的条件下搅拌反应.0.5~I小时，再静置10~16小时，离心，收集沉淀； 所述步骤2)的b)中，用十六烷基三甲基溴化铵分别沉淀Y菌浓缩液或Wl35菌浓缩液中的多糖的方法包括如下步骤:分别向所述Y菌浓缩液或W135菌浓缩液中加入十六烷基三甲基溴化铵水溶液，使十六烷基三甲基溴化铵在混合溶液中的浓度为0.1%~0.3%(质量百分含量)，在温度为10~15°C的条件下搅拌反应0.5~I小时,再静置10~16小时,离心，收集沉淀； 所述步骤3)中，用氯化钙解离的方法包括如下步骤:向所述沉淀中加入2mol/L氯化钙水溶液，2mol/L氯化钙水溶液与所述沉淀的配比为3~IOml: lg，再加入水，使氯化钙在体系中的最终浓度为lmol/L，搅拌I~3小时，使多糖与十六烷基三甲基溴化铵解离； 所述步骤4)中，用95%乙醇水溶液分别去除步骤3)的解离液中的杂质的方法包括如下步骤:分别向解离液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为25%，混匀，在2~8°C静置I~3小时，离心去沉淀，收集上清液； 所述步骤5)中，用95%乙醇水溶液分别从步骤4)的上清液中沉淀多糖的方法包括如下步骤:向上清液中加入95%乙醇水溶液，至乙醇在混合液中的体积百分比为80%，混匀，在2~8°C条件下静置8~16小时，离心去上清，收集沉淀； 所述步骤8)中，所述1:10饱和中性醋酸钠水溶液由饱和醋酸钠水溶液和水组成，其中饱和醋酸钠水溶液与水的体积比为1:9，1:10饱和中性醋酸钠水溶液的pH值为7.0 ;各粗糖溶液中多糖的浓度均为10~25mg/ml ； 所述步骤9)中，用酚对粗糖溶液进行提取的方法包括如下步骤:分别向各粗糖溶液中加入2倍体积的酚，混匀，离心分离，弃去中层及酚层，收集上层液； 所述步骤10)中，用氯化钙水溶液透析的方法中，氯化钙水溶液的浓度为0.lmol/L ； 所述步骤11)中，用95%乙醇水溶液沉淀的方法包括如下步骤:向透析后的溶液中加入95%乙醇水溶液，使乙醇在混合液中的体积百分比为80%，混匀，在2~8°C条件下静置8~.16小时，离心去上清，收集沉淀。
7.根据权利要求3~6中任一所述的方法,其特征在于: 所述发酵的方法包括如下发酵罐培养步骤: 将菌种分别以5X 108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的发酵罐中，37°C培养6~8小时，至对数生长后期，得到发酵液，将发酵罐中所有物质记作发酵液。
8.根据权利要求3~7中任一所述的方法,其特征在于: 所述发酵的方法中，在所述发酵罐培养之前，还包括如下步骤: 1)制备生广囷种: 第一代培养:将工作种子批菌种接种在10 %羊血普通琼脂培养基上，放37°C、8%二氧化碳环境培养18小时； 第二代和第三代培养:将第一代菌种接种于流脑半综合培养基，37°C培养12小时； 将第二代菌种接种于流脑半综合培养基，37°C培养12小时； 2)第四代菌种罐培养 将第三代菌种以5X 108/ml的浓度接种于装有流脑半综合液体培养基的菌种罐中，.37°C培养3~4小时。
9.根据权利要求1或2所述的疫苗，或根据权利要求3~8中任一所述的方法，其特征在于:所述A群脑膜炎奈瑟氏球菌为A群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株A4，其在CMCC的编号为.29201 ； 所述C群脑膜炎奈瑟氏球菌为C群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株C11，其在CMCC的编号为.29205 ； 所述Y群脑膜炎奈瑟氏球菌为Y群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株Y，其在CMCC的编号为.29303 ； 所述W135群脑膜炎奈瑟氏 球菌为W135群脑膜炎奈瑟氏球菌菌株W135，其在CMCC的编号为29055。
【文档编号】A61K39/095GK103721249SQ201410020295
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】崔晓峰, 马小伟, 许项可, 潘若文, 安文琪, 范蓓 申请人:华兰生物工程股份有限公司, 华兰生物疫苗有限公司