诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子及其制备方法，该粒子包括牛血清蛋白、稀土金属离子与抗癌活性药物，稀土金属离子与牛血清蛋白通过配位作用形成具有造影功能的纳米粒子，抗癌活性药物固定在纳米粒子上，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上。与现有技术相比，本发明选用具有一定浓度的牛血清蛋白溶液和稀土金属离子溶液，通过配位作用形成复合粒子。其中，通过改变两种溶液的浓度，可以调控复合粒子的结构与形态，改善粒子的性能。另外，在体系中的配位点上引入了具有MRI效应的元素(稀土金属离子)。与传统纳米粒子相比，本发明具有调控方式灵活易控，重复性强，所得到的纳米粒子性能优越等优点。
【专利说明】诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子及其制备方法【技术领域】
[0001]本发明属于高分子纳米生物医药材料领域，尤其是涉及一种诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子及其制备方法。
【背景技术】
[0002]癌症是由控制细胞生长增殖的机制失常而引起的疾病，严重危害着人类的健康。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织，甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分。据统计，目前每年全球有1200万人被确诊为癌症，760万人死于癌症，而且癌症的发病率还在不断增加，预计2030年全世界将有2600万新增病例，死亡人数达到1700万人，其中大多数将发生在中低收入的发展中国家。在一些西方国家，例如美国，目前所有死亡人数的25%是因癌症死亡,而每年约有0.5%人口诊断出癌症。在我国肿瘤发病率约为200/10万人，每年新发病例达220万人以上，在治患者600万人以上。由于其高致死率和较高的发病率，癌症不仅已经成为威胁我国人民生命的头号杀手，而且还占用了国家大量的医疗资源。
[0003]癌症治疗手段主要有化学治疗、手术切除、放疗、单克隆基因治疗等。放疗和单克隆基因治疗目前处于试验阶段，存在着不可预计的风险。手术切除和化学治疗是目前癌症治疗的主要方法，化疗对于癌症的治疗及控制癌细胞的转移具有重要意义，然而化疗也面临着许多尚未解决的问题。如药物副作用大、溶解度低，循环时间短，无靶向性、药物利用率低等。为此，开发新型多功能纳米药物传递系统是解决此类问题的主要途径，目前受到了众多学者的广泛关注。
[0004]纳米粒子是一常 见的纳米药物传递系统，如何让药物选择性的在病变部位释放，同时又具有诊断、成像等多种功能，是材料学家、医学者们共同努力的方向。
[0005]中国专利CN 102512687A公布了一种pH响应抗癌药物制剂及其制备方法。在反应过程中，以BSA作为抗癌药物的载体，以金属锌离子作为中间体，采用去溶剂法制备抗癌纳米载药颗粒，利用肿瘤部位的酸性环境，达到靶向药物释放。但该发明并未引入造影剂，没有肿瘤诊断的功能，实现不了诊疗一体化。
[0006]本发明利用BSA作为药物载体，创新性地引入具有造影功能的稀土金属，不仅实现药物在肿瘤环境微小酸性PH范围内的缓释，并且还实现了快速诊断的功能，达到了诊疗一体化的目的。
【发明内容】
[0007]本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于pH响应的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子及其制备方法，该纳米粒子能有效解决现有技术中纳米聚合物作为药物载体时载药率低、药物泄露、无法将癌症诊断与治疗有机结合、不能有效清晰地跟踪观察药物治疗效果等问题，并且能够延长药物在体内的半衰期，改善体内药物分布情况，减少药物被肾或肝清除，保护药物免受降解。[0008]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0009]诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，包括牛血清蛋白、稀土金属离子与抗癌活性药物，所述的稀土金属离子与牛血清蛋白通过配位作用形成具有造影功能的纳米粒子，所述的抗癌活性药物固定在纳米粒子上，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上。
[0010]所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子为具有pH响应性的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，粒径为4~200nm。
[0011]所述的牛血清蛋白含有583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。
[0012]所述的抗癌活性药物具有类似葱醌类的结构。
[0013]所述的抗癌活性药物包含如下结构中的一种:米托葱酮、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸伊达比星、盐酸表阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸佐柔比星、吡柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、罗多比星或美多比星。
[0014]诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，包括以下步骤:
[0015](I)在牛血清蛋白溶液中添加含有稀土金属离子的溶液，搅拌反应，使牛血清蛋白发生变性；
[0016](2)向步骤(1)所得体系中加入碱液调节溶液PH，使之变为澄清；
[0017](3)对步骤(2)所得体系进行提纯，除去未发生作用的稀土金属离子以及杂质，得到纳米粒子；
[0018](4)负载药物:在中性条件下，将步骤(3)所得纳米粒子溶于水中形成溶液，并加入抗癌活性药物，抗菌活性药物与纳米粒子发生反应，固定在纳米粒子的内部，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上；
[0019](5)提纯，除去步骤(4)体系中游离的抗癌活性药物和多余的杂质，冻干得到一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子。
[0020]步骤⑴所述的牛血清蛋白溶液中牛血清蛋白的溶度为0.5mg/ml~50mg/ml。
[0021]步骤(1)所得体系中，稀土金属离子与牛血清蛋白的摩尔浓度比为12: I~I: 5。
[0022]步骤(2)所得体系中，碱液与牛血清蛋白的摩尔浓度比为1: 50~1: 12。
[0023]步骤(4)中加入的抗癌活性药物与牛血清蛋白的质量比为1: 5~3: 10。
[0024]所述的碱液为氨水或氢氧化钠溶液。
[0025]与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果:
[0026](I)本发明提供一种简便构建诊疗一体化纳米系统的方法，选用具有一定浓度的牛血清蛋白溶液和稀土金属离子溶液，通过配位作用形成复合粒子。其中，通过改变两种溶液的浓度，可以调控复合粒子的结构与形态，改善粒子的性能。另外，在体系中的配位点上引入了具有MRI效应的元素(稀土金属离子)。与传统纳米粒子相比，该法具有调控方式灵活易控，重复性强，所得到的纳米粒子性能优越等优点。
[0027](2)制备得到的纳米粒子具有高度的稳定性、良好的生物相容性以及降解性。
[0028](3)在稀土金属离子的配位点上接入药物，在酸性肿瘤环境下能快速释放药物，有效提高药物在肿瘤部位积累的可能与数量。
[0029](4)将纳米粒子载药与磁共振成像有效地结合，可在提高诊断准确率的同时，对疾病进行治疗，实现诊治一体化，对肿瘤的诊断和治疗有重要的意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0030]图1为实施例1中负载了抗癌活性药物的载药蛋白纳米粒子透射电镜图；
[0031]图2为实施例1中牛血清蛋白与稀土金属离子钆复合水溶液粒径分布图；
[0032]图3为实施例1中负载了抗癌活性药物的牛血清蛋白与稀土金属离子钆复合水溶的粒径分布图；
[0033]图4实施例1中为纯药、未负载药物的纳米粒子、负载了药物的纳米粒子的细胞毒性图；
[0034]图5为实施例1中的负载了药物的蛋白纳米颗粒在不同pH下药物释放研究曲线。【具体实施方式】
[0035]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0036]实施例1
[0037]在制备的过程中，分别加入750mg、150mg、75mg、15mg牛血清蛋白配成的15ml 二次水溶液于4个100ml的烧杯中，然后分别加入0.2mmol的氯化钆溶液，在磁力搅拌器上匀速搅拌3min，反应温 度为常温25°C。然后分别加入50ul，Imoir1的氢氧化钠水溶液，继续搅拌2个小时，溶液形成稳定的体系，经过12个小时的透析以及高速离心分离，即可得到粒径均一的纳米粒子，如图2所示，粒径在IOnm左右。然后各自冻干取IOmg放在离心管里形成水溶液，加入抗癌药物2mg，透析6小时除去未载上的药物，得到负载了药物的纳米粒子，如图1、图3所示，粒径大小比较均匀。各取5mg纳米粒子在不同的pH下研究药物释放行为，如图5所示，抗癌纳米粒子在微酸性肿瘤环境下药物释放行为与在中性条件下存在较大差异，证明具有pH敏感肿瘤祀向性。称取5mg抗癌药物蛋白纳米粒子按图4示浓度梯度(药物浓度、BSA-Gd浓度，BSA-Gd-dox浓度)进行MTT细胞毒性实验，结果如图4所示，研究合成的抗癌药物蛋白纳米颗粒的毒性。
[0038]实施例2
[0039]在制备的过程中，加入150mg牛血清蛋白配成的15ml 二次水溶液于4个100ml的烧杯中，然后分别加入0.2mmol,0.15mmol,0.1mmol70.05mmol的氯化礼溶液,在磁力搅拌器上匀速搅拌3min,反应温度为常温25°C。然后分别加入50ul, ImolI/1的氢氧化钠水溶液，继续搅拌2个小时，溶液形成稳定的体系，经过12个小时的透析以及高速离心分离，即可得到粒径均一的纳米粒子。然后各自冻干取IOmg放在离心管里形成水溶液，加入抗癌药物2mg,透析6小时除去未载上的药物,得到负载了药物的纳米粒子。
[0040]实施例3
[0041]在制备的过程中，各自加入150mg牛血清蛋白配成的15ml 二次水溶液于3个100ml的烧杯中,然后分别加入0.15mmol的氯化礼溶液,在磁力搅拌器上匀速搅拌3min,反应温度为常温25°C。然后分别加入50ul、40ul、30ul Imol L—1的氢氧化钠水溶液，继续搅拌2个小时，溶液形成稳定的体系，经过12个小时的透析以及高速离心分离，即可得到粒径均一的纳米粒子三氧化钆。然后各自冻干取IOmg放在离心管里形成水溶液，加入抗癌药物2mg，透析6小时除去未载上的药物，得到负载了抗癌药物的纳米粒子。[0042]实施例4
[0043]在制备的过程中，加入150mg牛血清蛋白配成的15ml 二次水溶液于I个100ml的烧杯中，然后分别加入0.15mmol的氯化礼溶液,在磁力搅拌器上匀速搅拌3min,反应温度为常温25°C。然后加入40ul Imol L—1的氢氧化钠水溶液，继续搅拌2个小时，溶液形成稳定的体系，经过12个小时的透析以及高速离心分离，即可得到粒径均一的纳米粒子三氧化礼。然后各自冻干取IOmg放在离心管里形成水溶液,分别加入抗癌药物1.5mg、2mg、2.5mg、3mg,透析6小时除去未载上的抗癌药物，得到负载了抗癌药物的纳米粒子。
[0044]实施例5
[0045]具有pH响应性的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，包括牛血清蛋白、稀土金属离子与抗癌活性药物，牛血清蛋白含有583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7，稀土金属离子与牛血清蛋白通过配位作用形成具有造影功能的纳米粒子，抗癌活性药物固定在纳米粒子上，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上。粒径为 4 ~200nm。
[0046]抗癌活性药物具有类似葱醌类的结构。抗癌活性药物包含米托葱酮。
[0047]诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，包括以下步骤:
[0048](I)在牛血清蛋白溶液中添加含有稀土金属离子的溶液，搅拌反应，使牛血清蛋白发生变性，牛血清蛋白溶液中牛血清蛋白的溶度为0.5mg/ml，稀土金属离子与牛血清蛋白的摩尔浓度比为12:1 ;
[0049](2)向步骤(1)所得体系中加入碱液调节溶液pH，碱液(氨水)与牛血清蛋白的摩尔浓度比为1: 50使之变为澄清；
`[0050](3)对步骤(2)所得体系进行提纯，除去未发生作用的稀土金属离子以及杂质，得到纳米粒子；
[0051](4)负载药物:在中性条件下，将步骤(3)所得纳米粒子溶于水中形成溶液，并加入抗癌活性药物，加入的抗癌活性药物与牛血清蛋白的质量比为1: 5，抗菌活性药物与纳米粒子发生反应，固定在纳米粒子的内部，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上；
[0052](5)提纯，除去步骤⑷体系中游离的抗癌活性药物和多余的杂质，冻干得到一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子。
[0053]实施例6
[0054]具有pH响应性的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，包括牛血清蛋白、稀土金属离子与抗癌活性药物，牛血清蛋白含有583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7，稀土金属离子与牛血清蛋白通过配位作用形成具有造影功能的纳米粒子，抗癌活性药物固定在纳米粒子上，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上，粒径为 4 ~200nm。
[0055]抗癌活性药物具有类似葱醌类的结构。抗癌活性药物包含如下结构中的一种:盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸伊达比星或盐酸表阿霉素。
[0056]诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，包括以下步骤:
[0057](I)在牛血清蛋白溶液中添加含有稀土金属离子的溶液，搅拌反应，使牛血清蛋白发生变性，牛血清蛋白溶液中牛血清蛋白的溶度为5mg/ml，稀土金属离子与牛血清蛋白的摩尔浓度比为1:1;
[0058](2)向步骤(1)所得体系中加入碱液调节溶液pH，碱液(氨水)与牛血清蛋白的摩尔浓度比为1: 20使之变为澄清；
[0059](3)对步骤(2)所得体系进行提纯，除去未发生作用的稀土金属离子以及杂质，得到纳米粒子；
[0060](4)负载药物:在中性条件下，将步骤(3)所得纳米粒子溶于水中形成溶液，并加入抗癌活性药物，加入的抗癌活性药物与牛血清蛋白的质量比为1: 4，抗菌活性药物与纳米粒子发生反应，固定在纳米粒子的内部，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上；
[0061](5)提纯，除去步骤⑷体系中游离的抗癌活性药物和多余的杂质，冻干得到一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子。
[0062]实施例7
[0063]具有pH响应性的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，包括牛血清蛋白、稀土金属离子与抗癌活性药物，牛血清蛋白含有583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7，稀土金属离子与牛血清蛋白通过配位作用形成具有造影功能的纳米粒子，抗癌活性药物固定在纳米粒子上，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上，粒径为 4 ~200nm。
[0064]抗癌活性药物具 有类似葱醌类的结构。抗癌活性药物包含如下结构中的一种:盐酸阿柔比星、盐酸佐柔比星、批柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、罗多比星或美多比星。
[0065]诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，包括以下步骤:
[0066](I)在牛血清蛋白溶液中添加含有稀土金属离子的溶液，搅拌反应，使牛血清蛋白发生变性，牛血清蛋白溶液中牛血清蛋白的溶度为50mg/ml，稀土金属离子与牛血清蛋白的摩尔浓度比为1:5;
[0067](2)向步骤(1)所得体系中加入碱液调节溶液pH，碱液(氢氧化钠溶液)与牛血清蛋白的摩尔浓度比为1: 12使之变为澄清；
[0068](3)对步骤(2)所得体系进行提纯，除去未发生作用的稀土金属离子以及杂质，得到纳米粒子；
[0069](4)负载药物:在中性条件下，将步骤⑶所得纳米粒子溶于水中形成溶液，并加入抗癌活性药物，加入的抗癌活性药物与牛血清蛋白的质量比为3: 10，抗菌活性药物与纳米粒子发生反应，固定在纳米粒子的内部，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上；
[0070](5)提纯，除去步骤(4)体系中游离的抗癌活性药物和多余的杂质，冻干得到一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子。
【权利要求】
1.诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，其特征在于，包括牛血清蛋白、稀土金属离子与抗癌活性药物，所述的稀土金属离子与牛血清蛋白通过配位作用形成具有造影功能的纳米粒子，所述的抗癌活性药物固定在纳米粒子上，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上。
2.根据权利要求1所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，其特征在于，所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子为具有PH响应性的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，粒径为4~200nm。
3.根据权利要求1所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，其特征在于，所述的牛血清蛋白含有583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。
4.根据权利要求1所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，其特征在于，所述的抗癌活性药物具有类似葱醌类的结构。
5.根据权利要求4所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子，其特征在于，所述的抗癌活性药物包含如下结构中的一种:米托葱酮、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸伊达比星、盐酸表阿霉素、盐酸阿柔比星、盐酸佐柔比星、吡柔比星、依索比星、卡柔比星、奈莫柔比星、戊柔比星、地托比星、罗多比星或美多比星。
6.如权利要求1~5中任一项所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)在牛血清蛋白溶液中 添加含有稀土金属离子的溶液，搅拌反应，使牛血清蛋白发生变性； (2)向步骤(1)所得体系中加入碱液调节溶液pH，使之变为澄清； (3)对步骤(2)所得体系进行提纯，除去未发生作用的稀土金属离子以及杂质，得到纳米粒子； (4)负载药物:在中性条件下，将步骤(3)所得纳米粒子溶于水中形成溶液，并加入抗癌活性药物，抗菌活性药物与纳米粒子发生反应，固定在纳米粒子的内部，并连接到与牛血清蛋白相互作用的稀土金属离子配位点上； (5)提纯，除去步骤(4)体系中游离的抗癌活性药物和多余的杂质，冻干得到一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子。
7.根据权利要求6所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的牛血清蛋白溶液中牛血清蛋白的溶度为0.5mg/ml~50mg/ml。
8.根据权利要求6所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(1)所得体系中，稀土金属离子与牛血清蛋白的摩尔浓度比为12:1~1: 5。
9.根据权利要求6所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(2)所得体系中，碱液与牛血清蛋白的摩尔浓度比为1: 50~1: 12。
10.根据权利要求6所述的诊疗一体化牛血清蛋白抗癌纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤(4)中加入的抗癌活性药物与牛血清蛋白的质量比为1: 5~3: 10。
【文档编号】A61K45/00GK103751811SQ201410020245
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】李永勇, 郑丽, 董海青, 朱海燕 申请人:同济大学