专利名称：减毒的活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及减毒黄病毒(flavivirus)活疫苗。
背景技术：
黄病毒牙+包4舌三个属，即黄病毒属(genus flaviviridae),瘟病毒属(genus pestiviruses)以及肝炎病毒属(genus hepaciviruses)。
黄病毒属主要包括由蚊子或蜱传播的病毒，这些病毒中许多是人类， 同时也是动物的重要病原体。尤其重要的是黄热(YF)病毒(yellow fever virus),曰本月西炎(JE)病毒(Japanese encephalitis virus),登革(Den)病毒(dengue viruses)的四种血清型，蜱传脑炎(TBE)病毒(tick-borne encephalitis vims)以及 近来也在北美作为病原体在人类和各种鸟类体内发现的西尼罗(WN)病毒 (West Nile vims)。
瘟病毒属包含极有经济意义的动物病原体，即典型猪发热(CPV)病毒 (classical porcine fever), 牛病毒性腹泻(BVD)病毒(bovine viral diarrhea vims) 以及边界病病毒(border disease virus)(BDV)。
肝炎病毒属包含丙型肝炎病毒(hepatitis C vims)(HCV)的不同亚型以及 相关的病毒，如庚型肝炎病毒(hepatitis G vims)(HGV)。
这三个属都属于黄病毒科的成员，因为该家族的所有代表成员都有几 乎相同的基因组结构，并且在许多结构和功能特性方面都显示一致性。所 有的黄病毒都是相对小的，有包膜的病毒，包含单链RNA分子，具有以 mRNA作为基因组的倾向。基因组有较长可读框，编码以多蛋白(polyprotein) 形式存在的所有蛋白。单个成熟的病毒蛋白通过病毒和细胞的蛋白酶酶切 形成。单个病毒蛋白在基因组中的排列对所有黄病毒来说是相同的，即5，
3端开始是衣壳蛋白，然后是表面蛋白和一系列非结构蛋白，最后是病毒的 聚合酶。瘟病毒还有一特殊的特征，即在衣壳蛋白之前还含有自身蛋白酶
(autoprotease)。黄病毒的核衣壳仅由单一病毒蛋白即衣壳蛋白形成，核衣壳 包绕病毒基因组。所述衣壳呈现二十面体对称。
人们还不知道任何一种黄病毒衣壳蛋白准确的三维结构。但已知的氨 基酸序列有许多相关性，因此很可能这些衣壳蛋白存在多种结构相似性。 在这种情况下，同 一属的代表之间的相似性自然会比不同属的代表之间的 相似性更大。在所有情况下，衣壳蛋白都是相当小的蛋白，长度大约100 到190个氨基酸。其中有异乎寻常高比例的碱性氨基酸，即赖氨酸和精氨 酸。推测这些碱性氨基酸对于与病毒RNA之间的相互作用是重要的 (Khromykh和Westaway， 1996)。另夕卜，所有黄病毒衣壳蛋白还有特征性的疏 水区(
图1)。这类疏水区通常是由羧基末端约20个氨基酸形成。该区在基因 组序列中充当随其后的表面结构蛋白的内部信号序列。该信号序列在蛋白 合成过程中与内质网膜结合，使衣壳蛋白开始时锚定到所述膜上。然后， 此锚通过蛋白裂解切除。此外，还存在内部疏水区。在黄病毒属的代表中， 内部疏水区功能的重要性已由Markoff等描述。作者指出对一系列黄病毒而 言该区的边界如下登革病毒l: 46-67,登革病毒2: 46-66,登革病毒 3: 46- 67，登革病毒4: 45 -65，日本脑炎病毒46-62,西尼罗病毒 46 - 62，墨累山谷脑炎(Murray Valley encephalitis)病毒46-62,圣路易脑 炎(Saint louis encephalitis)病毒45-61，黄热病毒43 - 58， Langat: 42 -54,玻瓦散病毒(Powassan): 40- 52, TBE: 42 - 54。对于丙型肝炎病毒， 已鉴定出一个在功能方面重要的内部疏水区(Hope and Mclauchlan, 2000)， 该区是从氨基酸119延伸到氨基酸145，尤其是氨基酸125 - 144。痘病毒 具有短的主要具有疏水特性的内部区。
疫苗已成功地用于抗御一些黄病毒。已有活疫苗抗雄卩YF病毒，JE病 毒和CPF病毒，灭活疫苗用来抗御JE和TBE。鉴于黄病毒在人类医学和兽 医学方面极其重要，所以极需开发新的改进的疫苗。
已知有一系列减毒的黄病毒，其减毒是基于对基因组的不同区域突变 进行的。减毒性突变可见于天然产生的菌抹中，也可通过实验室中病毒的 一系列传代获得，或通过在中和抗体存在下筛选突变体而制备，或者借助 于重组克隆技术通过靶向引入突变而获得。数种黄病毒的感染性cDNA克
权利要求
1.一种包含黄病毒突变体的减毒的黄病毒活疫苗，其特征在于所述黄病毒突变体在衣壳蛋白中有至少4个以上连续的氨基酸的缺失，其中，羧基末端疏水区不受该缺失的影响。
2. 依照权利要求l的活疫苗，其特征在于所述缺失涉及衣壳蛋白的内部 疏水结构域。
3. 依照权利要求1或2的活疫苗，其特征在于衣壳蛋白中缺失了5到70个， 优选6到25个，更优选7到20个连续的氨基酸。
4. 依照权利要求1至3任一项的活疫苗，其特征在于所述缺失大于20个连 续的氨基酸，且衣壳蛋白额外还包含一个或多个进一步的突变，通过所述突 变衣壳蛋白的疏水性得到增强，所述进一步的突变优选选自*可增强衣壳蛋白疏水性的点突变，或*具有显著疏水特征的氨基酸片段的插入，尤其是衣壳蛋白疏水区的重复。
5. 依照权利要求1至4任一项的活疫苗，其特征在于所述黄病毒选自黄热 病毒(YFV),日本脑炎病毒(JEV),登革病毒(DV)的四种血清型，蜱传脑炎病 毒(TBE病毒)，西尼罗病毒(WNV),墨累山谷脑炎病毒(MVEV)，圣路易脑炎 病毒(SLEV),玻瓦散病毒(PV)，典型猪发热病毒(CPFV),牛病毒性腹泻病毒 (BDV)，边界病病毒(BDV)，丙型肝炎病毒(HCV)或庚型肝炎病毒(HGV)。
6. 依照权利要求1至5任一项的活疫苗，特征在于其包含101 - 107个，优 选102 - 106个，更优选103 - 105个黄病毒感染单位。
7. 依照权利要求1至6任一项的活疫苗，特征在于其进一步包含抗生素， 防腐剂，稳定剂，緩冲物质或它们的混合物。
8. 依照权利要求7的活疫苗，特征在于其包含新霉素，卡那霉素，硫柳 汞，人白蛋白，乳糖-山梨糖醇，山梨糖醇-明胶，polygdine, MgCl2， MgS〇4， 氨基酸，多糖，緩沖盐或它们的混合物。
9. 依照权利要求1至8任一项的活疫苗，特征在于其是由非转化的宿主细 胞制备。
10. —种黄病毒疫苗，特征在于其包含编码权利要求1至5任一项定义的 缺失的衣壳蛋白的核酸。
全文摘要
本发明公开了一种包含黄病毒突变体的减毒黄病毒活疫苗，其特征在于该黄病毒突变体包含缺失至少4个以上连续氨基酸的衣壳蛋白，而疏水的羧基末端区不受所述缺失的影响。
文档编号C12N15/40GK101658669SQ200910142709
公开日2010年3月3日 申请日期2002年2月11日 优先权日2001年2月21日
发明者克里斯琴·曼德尔, 弗朗兹·X·海因茨 申请人:英特塞尔股份公司