专利名称：一种骨支架材料及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于骨损伤修复的骨支架材料及其制备方法与应用。
背景技术：
脱钙骨基质(Demineralized bone matrix , DBM)主要由胶原构成的，是骨在去 除无机成分后所留下的一种有机支架材料，目前在临床上作为骨修复材料巳经得到了 -定的应用。然而，脱钙骨基质的机械强度太差，在移植后很容易发生塌縮，大大影 响修复效果(Gebhart and Lane ， ^cfa ft^力o/ ^e^^ , 57:130-143.)。而且由于 在处理过程中，内含的生长因子如骨形态发生蛋白一2(Bone morphogenetic protein-2， BMP-2)很容易失活，所以BMP-2需要额外加载，但脱转骨基质与BMP-2的 结合能力不够强，BMP-2很容易从材料中扩散出去，这不利于有效的利用BMP-2，而 且扩散的BMP-2对机体也有潜在的风险(Chen et al. ， A'，afe/^ah 28:1027-1035.; Yao et al. ， &',ter2'aZs 27:1608-1616.)。
发明内容
本发明的一个目的是提供了一种骨支架材料及其制备方法。 本发明所提供的骨支架材料是在脱钙骨基质上交联肝素得到的复合物(HC-DBM)。 所述脱钙骨基质可直接从商业途径获得，或用离体的松质骨按照现有的方法进行 制备。
所述复合物中，所述肝素与所述脱钙骨基质的比例为(1.5-2.5) ug肝素lmg
脱钙骨基质。
本发明所提供的上述骨支架材料制备方法，是将肝素交联到脱钙骨基质上得到骨 支架材料。
该方法中，所述肝素可按照如下方法交联到脱钙骨基质上以N-(3-二-甲基氨丙 基)-N9-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)作为交联剂，将所述肝素交联 到所述脱钙骨基质上。
其中，所述肝素和所述脱钙骨基质以1/25-1/10比例进行交联，优选为1/15。所 述肝素和所述N-羟基丁二酰亚胺(NHS)用量的比例可为1. 25/1-2. 5/1，优选为1. 67/1。 所述N-(3-二-甲基氨丙基)-N9-乙基碳二亚胺(EDC)和所述脱钙骨基质用量的比例可 为1/25-1/10，优选为1/15。
所述肝素交联到所述脱钙骨基质上的反应条件可为30°C-4(TC反应3. 5-6小时。
3其中，所述肝素交联到脱钙骨基质上的具体反应条件为37"C反应4小时。
在上述骨支架材料上复合骨形态发生蛋白一2 (BMP-2)得到的复合物(HC-DBM/ BMP-2)也属于本发明的保护范围。
本发明将肝素交联到脱钙骨基质上，利用交联的肝素来结合骨形态发生蛋白一2 (BMP-2)，这样，BMP-2与脱钙骨基质就成为一个有机整体， 一方面脱l丐骨基质的多 孔结构很适合于骨细胞的生长，另一方面又可以利用BMP-2的诱骨活性诱导骨的再生， 这样就形成了一个活性的骨修复材料。与此同时，交联可以使得材料的机械强度得到 提高，使得材料在移植后，能够抵抗更高的压力，从而能够保持伤口的形状以及材料 的结构，这点对于骨再生是很重要的。
实验证明，与脱钙骨基质相比，本发明的骨支架材料HC-DBM的压縮模量提高7 倍，同时与BMP-2的结合能力提高了3-5倍。在大鼠皮下包埋实验中，等量的BMP-2 分别加载到DBM与HC-DBM上得到复合物DBM/BMP-2和HC-DBM/BMP-2，结果表明 HC-DBM/BMP-2无论在成骨速度以及成骨总量上，都要高于DBM/BMP-2，这对于有效利 用BMP-2，节约成本以及减少过量BMP-2的扩散对身体的潜在危害，都有重要的意义。 本发明的骨支架材料可用于制备骨支架。
图1为DBM和HC-DBM压縮模量的测量结果 1=DBM ， 2二HC-醒
图2为DBM和HC-DBM在不同浓度的BMP-2溶液中，所吸附BMP-2能力的分析结果 1=DBM ， 2=HC-DBM
图3为HC-DBM及由其得到的HC-DBM/BMP-2 2周时各个组织切片的V0N COSSA染色结 果，及钙化面积与碱磷酶活性统计分析
A为包埋第一天的DBM/BMP-2的组织切片 B为包埋第 一天的HC-DBM/BMP-2的组织切片 C为包埋第14天的DBM/BMP-2的组织切片 D为包埋第14天的HC-DBM/BMP-2的组织切片 E为C的组织切片的放大 F为D的组织切片的放大
SODBM/BMP-2或HC-DBM/BMP-2， CT—丐化组织，1=DBM/PBS， 2=HC-DBM/PBS ， 3=DBM/BMP-2 ， 4二 HC-DBM/BMP-2
图4为HC-DBM及由其得到的HC-DBM/BMP-2 8周时各个组切片的H. E.染色结果，及 成骨面积与钙沉积的统计分析A为包埋第 一天的DBM/BMP-2的组织切片
B为包埋第 一天的HC-DBM/BMP-2的组织切片
C为包埋第56天的DBM/BMP-2的组织切片
D为包埋第56天的HC-DBM/BMP-2的组织切片
E为C的组织切片的放大
F为D的组织切片的放大 SC= DBM/BMP-2或HC-DBM/BMP-2， NB^新生骨组织，1二DBM ， 2=HC-DBM ， 3=DBM/BMP-2 ， 4= HC-DBM/BMP-2
具体实施例方式
下面以流产的胎牛的松质骨为例，阐明本发明的骨支架材料及其制备方法。 肝素是一种多糖，在调控机体生理生化过程发挥着重要的作用，同时，它能够与 许多蛋白分子结合，包括BMP-2。本实验用N-(3-二-甲基氨丙基)-N9-乙基碳二亚胺 (EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)作为交联剂，其中，EDC与脱钙骨基质胶原的N端反应， 丽S与肝素的羟基反应，随后EDC与NHS反应，这样肝素就被交联到了脱钙骨基质上， 具体的实验方法如下
一、 胎牛脱钙骨基质(DBM)的制备 脱钙骨基质(DBM)按照如下方法制备
取流产的胎牛的松质骨，去除软骨及脂肪等附着组织，用大量去离子水冲洗。
1. 将松质骨进行分割，在丙酮中处理48小时。
2. 浸入O. 5-0. 7mo1/1的盐酸中脱f丐24小时直至看到多孔结构的出现并且再无明 显的无机成分被洗出(当用手挤压没有明显的混浊出现时，表明可脱出的无机成分已 去除完全)。
3. 再转入(10-15) g/100ml双氧水中漂白10-30分钟。
4. 取出后，用大量的去离子水冲洗，在去离子水中平衡过夜。
5. 室温下，用0.5% (质量百分含量)的胰酶(北京化学试剂公司)处理6-8小时。
6. 再用大量的去离子水冲洗，在去离子水中平衡过夜，取出后冻干，形成脱钙骨 基质。
二、 将肝素交联到脱钙骨基质上
1、肝素，N-(3-二-甲基氨丙基)-N9-乙基碳二亚胺(EDC) (39391， Sigma, U.S. A.) 与N-羟基丁二酰亚胺(NHS) (14405，Sigma，U.S.A.)共同溶解于l毫升O. 05mol/l MES[2-(N-吗啉代)乙烷磺酸]溶液中(pH5. 6)。肝素和脱钙骨基质以l/25-l/10比例进行交联；肝素和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)用量的比例为l. 25/1-2. 5/1;脱钙骨基质和 N-(3-二-甲基氨丙基)-N9-乙基碳二亚胺(EDC)用量的比例为l/25-l/10。
2、 将脱钙骨基质浸泡在步骤l的溶液中，接着在200帕斯卡的低压中处理30秒使 得溶液能够彻底的浸润材料。
3、 随后从低压仓中取出，转移到3(TC-4(TC的摇床中，处理3.5-6小时。
4、 将经过步骤3处理的脱钙骨基质在0. lmo1/1 Na2HP04溶液中浸泡两个小时，再转 移到4mo1/1 NaCl溶液中浸泡24小时，中间换液3次。
5、 大量水洗后，冻干，形成交联有肝素的脱钙骨基质(HC-DBM)，其HC-DBM中肝 素与脱钙骨基质的比例为l. 5ug/mg-2. 5ug/mg。
6、 Co60照射灭菌。 具体的实验方法和结果见下述实施例。 实施例l、骨支架材料的制备
一、 胎牛脱钙骨基质(DBM)的制备 脱钙骨基质(DBM)按照如下方法制备
取流产的胎牛的松质骨，去除软骨及脂肪等附着组织，用大量去离子水冲洗。
1、 将松质骨分割成5X4X2mm的大小，在丙酮中处理48小时。
2、 浸入0.5-0.7mol/l的盐酸中脱钙24小时直至看到多孔结构的出现，并且再 无明显的无机成分被洗出当用手挤压没有明显的混浊出现时，表明可脱出无机成分已 去除完全。。
3、 再转入(10-15) g/100ml双氧水中漂白10-30分钟。
4、 取出后，用大量的去离子水冲洗，在去离子水中平衡过夜。
5、 室温下，用0.5% (质量百分含量)的胰酶(北京化学试剂公司)处理6-8小时。
6、 再用大量的去离子水冲洗，在去离子水中平衡过夜，取出后冻干，形成脱钙 骨基质。
二、 将肝素交联到脱钙骨基质上
1、 2mg肝素，2mgN-(3-二-甲基氨丙基)-N9-乙基碳二亚胺
(EDC) (39391， Sigma， U, S. A.)与l. 2mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS) (14405, Sigma， U. S. A.) 共同溶解于l毫升O. 05raol/l MES[2-(N-吗啉代)乙烷磺酸]溶液中(pH5. 6)。
2、 将30mg脱钙骨基质浸泡在步骤l的溶液中，接着在200帕斯卡的低压中处理30
秒使得溶液能够彻底的浸润材料。
3、 随后从低压仓中取出，转移到37"C的摇床中，处理4小时。
64、 将经过步骤3处理的脱f丐骨基质在0. lnioVl Na2HP04溶液中浸泡两个小时，再转 移到4mo1/1 NaCl溶液中浸泡24小时，中间换液3次。
5、 大量水洗后，冻干，形成交联有肝素的脱钙骨基质(HC-DBM)。其HC-DBM中 肝素与脱钙骨基质的比例为l. 5ug/mg。
6、 Co60照射灭菌。 实施例2、骨支架材料功能的验证
1) 肝素交联前后脱钙骨基质的机械强度的分析
分别按照如下方法测量实施例1的HC-DBM和肝素交联前的DBM的压縮模量. 实验采用力学测量仪 (Tinius olsen H5KS)，以lmm/min的速度进行压縮，得到 位移压力曲线，根据曲线线性区的斜率，得到压縮模量。实验设三次重复。结果如图 l所示，HC-DBM的压縮模量从交联前的4. 1± 0.42 kPa提高到了31.4士 3.1 kPa，有 了7.8的提高。
2) HC-DBM的BMP-2结合能力分析
将浓度分别为7u g/ml、20u g/ml、 183 y g/ml和550 y g/ml的BMP-2 (sig腿，B3555) 溶液(溶剂是O. 1M、 pH7. 4的PBS溶液)分别浸泡10mg实施例l的DBM或10mg实施例l的 HC-DBM，然后利用ELISA方法计算浸泡前后溶液中BMP-2的变化，从而计算出DBM上所 结合的BMP-2。实验设三次重复。结果如图2所示，在浓度为7.0ug/ml BMP-2溶液中， 10mg实施例l的HC-DBM吸附的BMP-2的量为0. 63±0. 05ug，而10mg实施例l的DBM吸附 BMP-2的量为0. 52±0. 05ug;实施例l的HODBM的BMP-2结合能力与DMB的结合能力相比 有了1.2倍的提高。
在浓度为20ug/ml BMP-2溶液中，10mg实施例l的HC-DBM中吸附的BMP-2的量为1. 84 ±0. 09ug，而10mgDBM吸附BMP-2的量为1.48土0. lug;实施例l的HODBM的BMP-2结合 能力与DMB的结合能力相比有了l. 24倍的提高。
在浓度为183ug/mlBMP-2溶液中，10mg实施例l的HC-DBM中吸附的BMP-2的量为 14.0±3. lug，而10mg实施例l的DBM吸附丽P-2的量为4.2土1.0ug;实施例1的HC-DBM 的BMP-2结合能力与DMB的结合能力相比有了3.33倍的提高。
在浓度为550ug/ml BMP-2溶液中，10mg实施例l的HC-DBM中吸附的BMP-2的量为 39. 4±6. 9ug，而10mg实施例l的DBM吸附BMP-2的量为8. 9±1. 6ug;实施例1的HC-DBM 的BMP-2结合能力与DMB的结合能力相比有了4.4倍的提高。
3) 复合BMP-2的DBM与HC-DBM的诱骨生成能力分析
将20mg实施例1的DBM与20mg实施例1的HC-DBM分别加载30ug的BMP-2，得到 DBM/BMP-2和HC-DBM/BMP-2 。同时将20mg实施例1的DBM与20mg实施例1的HC-DBM分别在
70. 1M、 pH7. 4的PBS溶液中浸泡10分钟，得到DBM/PBS和HC-DBM/PBS。
DBM/PBS， DBM/BMP-2， HC-DBM/PBS与HC-DBM/BMP-2移植SD大鼠皮下，每只都移植 上述4种材料，每种材料20mg。实验设6个重复，分别在第2周和8周取出，共12只老鼠。
在2周时取出，做切片及钙化面积与碱性磷酸酶活性统计分析，其中统计方法为t 检验。其中，钙化面积指的是从切片中，用深染的部位即钙化部分的总面积除以总的 固体部分(新生骨与材料面积之和)的百分比；碱性磷酸酶测定使用ALP试剂盒(北 京化学试剂公司)，方法参照试剂盒说明书。
在8周时取出，做切片及成骨面积与钙沉积的统计分析。成骨面积为成骨部位的 总面积除以总的固体部分(新生骨与材料面积之和)的百分比；钙含量测定使用钙浓 度测量试剂盒(北京化学试剂公司)，方法参照试剂盒说明书。
图3是2周后材料切片及成骨面积与钙沉积的统计分析，结果显示由实施例l的 HC-DBM得到的HC-DBM/BMP-2的l丐化面积79 % ± 6. 3 % ，高于由实施例1的DBM得到的 DBM/BMP-2 (60% ±5%)，同时材料内的碱磷酶活性HC-DBM/BMP-2为 0. 24±0. 02(nmol/min/mg)高于由DBM得到的DBM/BMP-2 (0, 15±0. 04(腸l/min/mg))， 远高于其他，并且有显著性的差异(p<0.05);说明由实施例1的HC-DBM得到的 HC-DBM/BMP-2的骨化过程是非常旺盛的。
图4是8周后材料切片做H. E染色及成骨面积与钙沉积测定及统计分析，结果显 示没有加载BMP-2的实施例1的HC-DBM和DBM依然没有成骨的迹象，而在 HC-DBM/BMP-2或DBM/BMP-2中，开始出现了骨的形态；由实施例1的DBM得到的 DBM/BMP-2成骨的面积为35. 8%±7.3%,比较有限，在材料的中间，仍然有大部分没 有骨化，而且骨比较幼稚(钙含量为18. 1±1.9%)，由实施例1的HC-DBM得到的 HC-DBM/BMP-2中，不仅成骨面积大(62%±4. 9%)，而且成骨更加成熟(钙含量为25. 1 ±0.6%)。从这个结果可以看出，在加载了等量的BMP-2之后，实施例1的HC-D丽 不仅成骨速度最快，而且成骨量最大，这对于有效利用BMP-2，提高修复速度和质量， 是非常有意义的。
权利要求
1、一种骨支架材料，是在脱钙骨基质上交联肝素得到的复合物。
2、 制备权利要求1所述的骨支架材料的方法，是将肝素交联到脱钙骨基质上得 到骨支架材料。
3、 根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述肝素按照如下方法交联到脱钙骨基质上以N-(3-二-甲基氨丙基)-N9-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺作为交 联剂，将所述肝素交联到所述脱钙骨基质上。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述复合物中，所述肝素与所述 脱钙骨基质的比例为(1.5-2.5) ug肝素/lmg脱钙骨基质。
5、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述肝素和所述脱钙骨基质 以1/25-1/10比例进行交联；优选为1/15。
6、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述肝素和所述N-羟基丁二酰亚 胺用量的比例为1. 25/1-2. 5/1;优选为1. 67/1。
7、 根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述N-(3-二-甲基氨丙基)-,-乙基碳二亚胺和所述脱钙骨基质用量的比例为1/25-1/10;优选为1/15。
8、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述肝素交联到脱钙骨基质 上的反应条件为30°C-40。C反应3. 5-6小时，优选反应条件为37。C反应4°C 。
9、 一种骨支架材料，是在权利要求1至8中任一所述的骨支架材料上复合骨形 态发生蛋白一2得到的复合物。
10、 权利要求1至9中任一所述的骨支架材料在制备骨支架中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种骨支架材料及其制备方法与应用。本发明的骨支架材料，是在脱钙骨基质上交联肝素得到的复合物。其中，肝素按照如下方法交联到脱钙骨基质上以N-(3-二-甲基氨丙基)-N9-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺作为交联剂，将所述肝素交联到所述脱钙骨基质上。与脱钙骨基质相比，本发明的骨支架材料HC-DBM的压缩模量提高7倍，同时与BMP-2的结合能力提高了3-5倍。在大鼠皮下包埋实验中，等量的BMP-2分别加载到DBM与HC-DBM上得到复合物DBM/BMP-2和HC-DBM/BMP-2，结果表明HC-DBM/BMP-2无论在成骨速度以及成骨总量上，都要高于DBM/BMP-2，这对于有效利用BMP-2，节约成本以及减少过量BMP-2的扩散对身体的潜在危害，都有重要的意义。本发明的骨支架材料可用于制备骨支架。
文档编号A61L27/36GK101496911SQ20081005697
公开日2009年8月5日 申请日期2008年1月28日 优先权日2008年1月28日
发明者戴建武, 航 林, 赵燕南 申请人:烟台正海生物技术有限公司;中国科学院遗传与发育生物学研究所