专利名称：促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种促进骨缺损修复的PHBV复合纳米纤维支架材料的制备方法，属于组织工程技术领域。
背景技术：
骨是人体中最坚硬的结缔组织，具有一定的再生和自修复能力，但是由外伤、炎症、肿瘤手术等引起的骨缺损，在单纯依靠骨的自修复无法愈合的情况下，则需要外科手术治疗，骨缺损治疗仍然是一个棘手的临床问题。在组织工程中，人们为了模拟真实的临床情形，设计了动物模型(包括鼠、兔、狗、羊的胫骨、股骨、桡骨、下颂骨等)来测试骨修复情况。 临床试验证明，自体骨移植是治疗骨缺损的最佳方法，但来源极其有限，取材还会造成二次缺损；异体骨有优越的组织学特点，但是存在免疫排斥反应，而且成本较高。为了克服这些缺点，涌现了大量人工材料用于骨缺损修复。1998年实施了第一例人骨部分缺损部位植入多孔陶瓷材料的手术，虽然坚硬的陶瓷材料在前期可起到支撑作用，但是由于其不能降解， 不利于后期的骨愈合，所以此后极少用相似的方法处理。现在临床上使用的商业化人工骨材料主要为碳酸钙和磷酸钙等含钙盐的三维多孔支架，用于小范围骨缺损部位的填充。但是支架材料的多孔性导致了机械性能的下降，并且在动物体内非常容易崩解。现在的研究主要集中在无机材料(磷酸钙，碳酸钙，羟基磷灰石等)与有机材料(胶原，壳聚糖等)相结合的复合三维多孔支架，并在支架制备过程中引入利于成骨的生长因子。多孔材料的制备通常采用溶剂浇铸-颗粒浙滤、冷冻干燥等方法，得到的多孔支架孔径一般在几微米到几百微米。这些材料虽然在某种程度上达到了弥补缺陷的作用，但其骨修复效率难以与自体骨相比。静电纺丝技术得到的超细纤维比表面积大，孔隙率高，连通性好，形态结构与天然细胞外基质类似，可以为细胞生长提供良好的环境。聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)作为一种可降解，无免疫源性，生物相容性良好的生物材料受到广泛关注，PHBV电纺纤维更是被用做组织工程支架来研究细胞成骨、成软骨特性。但是目前的研究中，PHBV电纺纤维直径一般在微米级，并且膜状电纺纤维支架缺乏足够的强度，因此电纺纤维应用于骨缺损修复的研究仍停留在体外细胞实验阶段。
发明内容
技术问题本发明的目的在于提供一种促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架的制备和应用方法，是以PHBV为基质，掺杂纳米级羟基磷灰石(nHA)的复合纳米纤维支架材料的制备方法，并应用于骨缺损修复中。PHBV静电纺丝复合纳米纤维支架具有高孔隙率和连通性，与细胞外基质结构类似，有利于细胞的粘附和增殖。根据文献报道方法制备的nHA 均勻地分散在PHBV纳米纤维中，该纤维用于骨缺损
修复效果显著。技术方案本发明提供的以PHBV为基质的复合纳米纤维支架材料的制备方法包
3括以下步骤
首先选取生物材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV和具有骨传导能力但需要载体的纳米级羟基磷灰石nHA为原料，通过静电纺丝方法制备PHBV非定向及定向复合纳米纤维膜，然后通过裁剪和折叠得到多层棒状三维支架，用做小范围骨缺损修复的植入材料。PHBV纤维的获得是通过在PHBV溶液中掺杂另一种生物材料聚氧化乙烯PEO来实现的，掺杂比为PHBV:PE0=9 1，使PHBV纤维的直径从5微米减小到2. 5微米，以及静电纺丝所需溶液的浓度从40%减小到3%，增加了 PHBV纤维的延展性。PHBV纳米级纤维的获得是通过比较三种不同溶剂三氯甲烷、二氯甲烷、三氟乙醇 TFE，最终选择三氟乙醇为溶剂来实现；当溶剂为三氯甲烷及二氯甲烷时纤维直径分别为 2. 5微米和2微米，而三氟乙醇为溶剂时获得了直径600纳米的非定向纳米纤维。nHA的掺入是通过超声和搅拌的方法实现的，首先将PHBV和PEO与溶剂TFE用磁力搅拌器搅拌90分钟至溶解，同时nHA加入TFE中超声90分钟至完全分散，然后两者混合， 磁力搅拌30分钟，得到均勻的静电纺丝溶液。三维支架的获得是通过将PHBV-nHA纳米纤维薄膜裁剪成等腰梯形，以下底为轴， 将薄膜卷起，形成多层棒状三维支架。本发明提供的PHBV复合纳米纤维支架材料用于骨缺损修复包括以下步骤 丨丨)电纺得到的两种PHBV纳米纤维膜经过裁剪和折叠得到三维棒状支架；在兔左前肢建立临界骨缺损模型，植入步骤1得到的三维支架材料，逐层缝合手术伤口，包扎。有益效果本发明优点在于用简便易行的方法得到纳米级PHBV纤维复合nHA支架材料，且成本低廉；PHBV材料表现出良好的生物相容性，在动物实验中无免疫排斥反应； PHBV超细纤维的形态和取向及纳米级羟基磷灰石颗粒与天然骨成分类似，有效促进骨细胞的生长，促进骨缺损部位的愈合。
图1为非定向(左)及定向(右)PHBV纳米纤维扫描电镜图， 图2为非定向(左)及定向(右)PHBV-nHA纳米纤维扫描电镜图， 图3为获得三维棒状支架的示意图。
具体实施例方式1 .PHBV加入溶剂三氟乙醇(TFE)中，通过磁力搅拌器搅拌至完全溶解，为了得到纳米级纤维，加入了另一种生物材料聚氧化乙烯(PEO)，PHBV与PEO质量比为9 1 ；
2.在0.5M的醋酸溶液中加入5毫升0. 5M的CaCl2水溶液和3毫升0. 5M的H3PO4,搅拌，滴加0. 5M NaOH,使pH=9，25度搅拌2小时，反应结束，得到白色沉淀，反复水洗离心、超声，最终得到的中性沉淀100度真空干燥，得到纳米棒状羟基磷灰石粉末；
3.nHA加入TFE中，超声90分钟，使nHA均勻分散在TFE中，nHA添加量为PHBV的10% (质量百分含量)；
4.步骤1，3得到的溶液混合搅拌均勻，得到终浓度为m的静电纺丝溶液；
5.将纺丝溶液加入20毫升的注射器中，注射器针头为平口，内径为0.5毫米，注射器
4固定在推进泵上，推进速度设为5毫升/小时，高压直流电源正极接注射器针头，负极接收集器(滚轴转速为2500转/分钟)，电压为12千伏，收集距离为25厘米，2小时后将得到的 PHBV纳米纤维膜取下，60度真空干燥M小时得到PHBV复合电纺纤维膜；
6.将所得PHBV纤维膜裁剪成上底1.5厘米，下底2. 5厘米，高10厘米的等腰梯形，以下底为轴将梯形卷起(下底与定向纤维的取向平行)，形成多层棒状支架，支架长2. 5厘米， 直径约0. 3厘米，高温高压消毒，烘干备用，详见说明书附图3 ；
7.在兔子左前肢建立桡骨缺损模型，对兔子实施手术，首先将兔子用m的戊巴比妥钠麻醉，将手术腿用硫化钠脱毛，然后用手术刀直接将皮肤肌肉层打开到骨膜，用钝器分离，露出桡骨，然后将桡骨取下1. 5厘米，将PHBV材料植入骨缺损处，最后按肌肉、皮肤顺序逐层缝合伤口，伤口碘伏消毒，包扎。 8.每4周拍X片查看骨缺损部位修复效果。
权利要求
1.一种促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于首先选取生物材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯PHBV和具有骨传导能力但需要载体的纳米级羟基磷灰石 nHA为原料，通过静电纺丝方法制备PHBV非定向及定向复合纳米纤维膜，然后通过裁剪和折叠得到多层棒状三维支架，用做小范围骨缺损修复的植入材料。
2.根据权利要求1所述的促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于PHBV纤维的获得是通过在PHBV溶液中掺杂另一种生物材料聚氧化乙烯PEO来实现的，掺杂比为PHBV PE0=9 1，使PHBV纤维的直径从5微米减小到2. 5微米，以及静电纺丝所需溶液的浓度从40%减小到3%，增加了 PHBV纤维的延展性。
3.根据权利要求1所述的促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于PHBV纳米级纤维的获得是通过比较三种不同溶剂三氯甲烷、二氯甲烷、三氟乙醇 TFE,最终选择三氟乙醇为溶剂来实现；当溶剂为三氯甲烷及二氯甲烷时纤维直径分别为 2. 5微米和2微米，而三氟乙醇为溶剂时获得了直径600纳米的非定向纳米纤维。
4.根据权利要求1所述的促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于nHA的掺入是通过超声和搅拌的方法实现的，首先将PHBV和PEO与溶剂TFE用磁力搅拌器搅拌90分钟至溶解，同时nHA加入TFE中超声90分钟至完全分散，然后两者混合， 磁力搅拌30分钟，得到均勻的静电纺丝溶液。
5.根据权利要求1所述的促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架材料的制备方法，其特征在于三维支架的获得是通过将PHBV-nHA纳米纤维薄膜裁剪成等腰梯形，以下底为轴，将薄膜卷起，形成多层棒状三维支架。
全文摘要
促进骨缺损修复的复合纳米纤维支架的制备方法涉及一种基于静电纺丝技术的纳米纤维支架材料的制备方法。它是将可降解、无免疫源性，但不能诱导成骨的生物材料聚羟基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)和具有骨传导能力但需要一定载体的纳米级羟基磷灰石(nHA)结合起来，通过静电纺丝的方法，得到直径在600纳米左右的非定向电纺纤维薄膜及直径300纳米左右的定向电纺纤维薄膜，通过裁剪和折叠最终得到多层棒状三维支架材料。经动物实验证实该材料生物相容性好，由此材料得到的定向及非定向三维支架均可实现临界骨缺损的修复，其中定向三维支架的修复效果好于非定向支架，修复后骨的弹性模量与正常骨一致，优于非定向支架修复后的骨弹性模量。
文档编号D01D1/02GK102166372SQ20111003759
公开日2011年8月31日 申请日期2011年2月14日 优先权日2011年2月14日
发明者吕兰欣, 张晓峰, 黄宁平 申请人:东南大学