专利名称：一种高效低毒的载蓖麻毒素a链超声微泡及其制备方法
技术领域：
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本发明涉及载蓖麻毒素A链超声微泡及其制备方法，将超声微泡作为抗肿瘤生物毒素 的运载工具，尤其涉及一种载蓖麻毒素A链的新型共聚物超声微泡及其制备，该载药微泡 可以通过声像图引导，并应用一定能量超声使载药微泡在肿瘤部位破裂释放出蓖麻毒素， 顺着通透性增高的细胞膜进入细胞内，达到肿瘤靶向治疗的目的。
技术背景-
常规超声造影剂是一种微米级造影剂,微泡的平均直径约2 4 u m,不透过血管，是一 种血池显像剂。近年来研究发现，微泡超声造影剂作为一种新型的药物载体，不仅可以增 强超声显像，还具有分子成像、促进血栓溶解、促进基因转染及药物体内运输定点释放等 作用。
超声波为正负压交替的疏密机械波，在声场中微泡造影剂随着声压的交变不断地被动 压縮和膨胀，当声强达到一定阈值时，微泡瞬间破裂产生"空化效应"。空化效应瞬间产 生的"休克波"可使直径〈7nm的毛细血管破裂，临近组织细胞膜上出现可逆性微孔， 细胞膜通透性增高，细胞对大分子物质短暂开放即"声孔效应"。如果将包裹有药物的微 泡经静脉注射后，在治疗部位或肿瘤局部经体表给予一定能量的超声辐照，可使微泡在局 部破裂，释放出其所包裹的药物。但目前所采用的药物多为临床上使用的抗肿瘤药物，在 微泡释放后，部分药物可能随血液循环进入全身，仍将造成一定毒副作用。
蓖麻毒素是一种糖蛋白异二聚体,两条多肽链分别称为A链和B链。A链是活性链，具 有抑制细胞蛋白质合成的N-糖苷酶的活性部位；B链是一半乳糖特异的凝集素，和细胞表 面的受体结合后，整个蓖麻毒素分子通过受体介导的内吞途径进入细胞，A链在胞浆内催 化核糖体60S亚基失活,从而抑制细胞蛋白质的合成，最终导致细胞死亡，是迄今为止抗 肿瘤活性最强的天然产物之一。但由于蓖麻毒素B链与细胞膜表面受体的结合缺乏特异性， 蓖麻毒素在全身用药抗肿瘤的同时常导致正常细胞的死亡，产生严重的毒副作用。如果单 纯使用蓖麻毒素A链，由于缺乏B链的引导，A链难以进入细胞内产生细胞毒活性，其活 性通常比完整的蓖麻毒素小105 106倍。
采用微泡包载蓖麻毒素A链，结合超声辐照，将A链释放到病变部位，并通过超声辐 照后通透性增高的细胞膜进入肿瘤细胞内发挥抗肿瘤作用。而在非超声辐照部位，A链则 难以通过完整的细胞膜进入胞内产生细胞毒作用。这样，通过超声触发微泡靶向定点释放 蓖麻毒素A链既可明显增强病变部位抗肿瘤效应，又可显著减轻全身毒副作用，真正达到 肿瘤靶向治疗的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡及其制备方法，从而由 超声造影剂微泡携带蓖麻毒素A链，在声像图引导下，用一定能量的超声辐照使之在肿瘤 局部破裂，定点释放药物，并协助药物进入细胞内，达到靶向治疗肿瘤的目的。
本发明采用的技术方案是将蓖麻毒素A链与各种超声微泡结合。所述结合包括蓖麻毒
4素A链包裹于微泡内或吸附于微泡表面而制得载蓖麻毒素A链超声微泡。所述的载蓖麻毒 素A链超声微泡可采用水/油/水复乳-溶剂挥发法制备成的载蓖麻毒素A链的 PLGA-PEG-PLGA微泡，或者也采用二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、司班、 甘油、磷酸盐缓冲液与蓖麻毒素A链混合制得的载蓖麻毒素A链的脂质超声造影剂微泡。
本发明所使用的蓖麻毒素A链可以采用基因重组的方法制备或现代色谱方法纯化，而 其中以基因重组方法制备为优选。采用基因工程方法制备的蓖麻毒素A链，在原核系统进 行表达时，由于缺乏糖基化，蛋白质第10个氨基酸残基无寡糖链连接，不容易被降解， 体内半衰期明显延长，更有利于发挥其抗肿瘤作用。
本发明所述超声造影剂微泡包括高分子材料超声造影剂微泡、脂质超声造影剂微泡、
人血白蛋白超声造影剂微泡。具体如下
(1) 高分子材料超声造影剂微泡包括微泡壳成分中含有各种高分子作为成膜材料 的超声微泡。所用的高分子材料具体包括聚乙二醇、乳酸/羟基乙酸共聚物、或其二元 或三元嵌段共聚物、接枝共聚物、氰基丙烯酸酯等。应用高分子聚合物材料制备的超声微 泡具有许多优点，多数聚合物材料均具有较高的稳定性和可塑性；通过改变聚合物的组成
比例、分子量以及制备工艺等条件可调节材料的柔顺性，控制壳的厚度、弹性、粒径分布，
进而调节其声学特性和声学效果持续时间；制备的微泡直径小、分布均匀、半衰期较长。
(2) 脂质超声造影剂微泡包括各种用磷脂或磷脂类衍生物作为成膜材料的脂质微 泡，如声诺维。所述的磷脂或磷脂类衍生物，包括卵磷脂、胆固醇、1， 2-二棕榈酰
基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐、1， 2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱、1， 2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐等。
(3) 人血白蛋白超声造影剂微泡包括各种用人血白蛋白作为成膜材料的超声微泡， 如Opt i son 。
本发明所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡的制备方法，包括如下步骤采用
水/油/水复乳-溶剂挥发法制备载药微泡，取配比量蓖麻毒素A链水溶液加入配比量的 PLGA-PEG-PLGA溶液,在高转速搅拌下得到初乳液，倒入适宜浓度适宜量的聚乙烯醇水溶液 中，高转速搅拌后，再低转速磁力搅拌，使有机溶剂挥发完全，离心分离，重蒸水洗涤，获 得载蓖麻毒素A链超声微泡，真空冷冻干燥后充入惰性气体，低温保存；上述的蓖麻毒素 A链与PLGA-PEG-PLGA共聚物摩尔比为1 X 10—4 1 X 10—3: 1 。
上述获得的载蓖麻毒素A链超声微泡可以加入防冻剂甘油，真空冷冻干燥后充入惰性 气体，低温保存；惰性气体一般选自全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫等等。所述的超声造 影剂微泡的气体内核成分可采用常温下呈气态的全氟丙烷、全氟丁垸或六氟化硫等等。
本发明的上述步骤所述的PLGA-PEG-PLGA共聚物的分子量为2000 20000dal,优选 5880dal。
本发明的上述步骤所述的蓖麻毒素A链水溶液的浓度为l 10mg/ml， PLGA-PEG-PLGA 三氯甲垸溶液浓度为20 200 mg/ml，聚乙烯醇水溶液浓度为0. 5% 5%。
本发明的上述步骤所述的蓖麻毒素A链水溶液加入PLGA-PEG-PLGA溶液，在2000 20000转/分转速搅拌0.5 5 min，得到初乳液，倒入聚乙烯醇水溶液中，在2000 20000 转/分转速搅拌0. 5 5 min，再于100 500转/分转速，磁力搅拌4 24 h。
本发明在使用时，可以对载蓖麻毒素A链的超声微泡进行定位超声控释即将载蓖麻毒素A链的微泡造影剂进行静脉注射，用声像图监控造影剂到达靶组织显影后，用一定能 量的超声波破坏微泡，超声频率为0.5-2 MHz，声强为0. 2-2. 0 W/cm2，作用时间l-3min， 间歇l-3min，重复1-3次。微泡瞬间破裂产生"空化效应"，"休克波"可使直径〈7 U m 的毛细血管破裂，临近组织细胞膜上出现可逆性微孔，细胞膜通透性增高，细胞对大分子 物质短暂开放即"声孔效应"。包载在微泡内的蓖麻毒素A链顺着通透性增高的细胞膜进 入细胞内，产生抗肿瘤作用。而没有经过超声辐照的组织器官，细胞膜完整，通透性正常， 这样蓖麻毒素A链由于缺乏B链的引导难以进入靶区以外机体正常细胞内，因此本发明可 准确达到药物体内定位释放靶向治疗，提高治疗效果，减轻全身毒副作用的目的。
本发明的载蓖麻毒素A链超声微泡适用于机体绝大部分实体瘤的靶向治疗，包括肝、 肾、胰腺、脾、前列腺、子宫、卵巢、腹膜后、甲状腺、乳腺以及颈部和浅表软组织肿瘤， 包括良性和恶性肿瘤。
图1为本发明的载蓖麻毒素A链的PLGA-PEG-PLGA共聚物微泡的光学显微镜图。 图2为本发明的模型组荷人肝癌裸鼠皮下移植瘤图。
图3为本发明的载蓖麻毒素A链的PLGA-PEG-PLGA微泡靶向治疗裸鼠肝癌效果图。
具体实施例方式
下面结合附图对本发明进行详细说明 实施例
1. 蓖麻毒素A链的克隆表达纯化
从蓖麻籽提取蓖麻毒素A链的RNA，逆转录制备DNA模板，PCR扩增目的基因片段； 纯化扩增基因，克隆入PcDNA3.1质粒载体中并进行序列测定；将测序正确的重组质粒 PcDNA3. 1-ricinA双酶切，将目的片段插入pRSetA融合表达载体构建pRSetA-ricinA表达 载体；将重组融合表达载体pRSetA-ricinA转化导入BL21感受态细胞，挑克隆扩增后， 加入IPTG诱导目的基因表达，超声破碎细胞；采用镍金属螯合柱纯化，免疫印迹法鉴定 纯化蛋白为蓖麻毒素A链，MTT法测得纯化蛋白对肝癌H印G2细胞作用24h的半数抑制浓 度为2.0X10—6 mol/L。
2. PLGA-PEG-PLGA共聚物的合成与表征
在三口瓶中放入15g Mw为1500的聚乙二醇，150。C真空条件下搅拌3h，加入3. 2g乙 交酯，19. 3g丙交酯以及0. 04g催化剂辛酸亚锡，氮气保护下反应8hr。将产物溶于三氯 甲烷中，无水乙醇沉淀纯化，常温干燥至恒重。采用高效凝胶渗透色谱分析仪测定共聚物 的分子量为5880dal，傅立叶红外光谱、NMR谱显示为典型的PLGA-PEG-PLGA结构。
3. 载蓖麻毒素A链的PLGA-PEG-PLGA微泡的制备
采用水/油/水复乳-溶剂挥发法制备载药微泡。0. 2 ml蓖麻毒素A链水溶液(lmg/ml) 加入0.8 ml PLGA-PEG-PLGA 二氯甲烷/乙酸乙酯混合溶液(50mg/ml) ， 10000转/分搅拌 lmin，得到初乳液,倒入4 ml 3°/。聚乙烯醇水溶液中，10000转/分搅拌lmin，再加入15ml 3%聚乙烯醇水溶液，400转/分磁力搅拌10h，使有机溶剂挥发完全,离心分离，重蒸水洗 涤，所得微泡加入防冻剂甘油，真空冷冻干燥后充入惰性气体全氟丙烷，低温保存。
4. 载蓖麻毒素A链的PLGA-PEG-PLGA微泡的表征
将微泡分散于生理盐水中，倒置显微镜下观察微泡呈圆球形，表面光滑，分散良好，无粘连，大小较均匀(见图1)。取适量微泡粉末分散于生理盐水中，激光粒度分析仪测 定微球粒径1. 3-5. 2Mffi。
称取载蓖麻毒素A链超声微泡(以下简称载药微泡)10mg，加入2ml三氯甲烷，剧烈 震荡5min使微泡破裂，加入2ml生理盐水剧烈震荡5min萃取，静置30min后，取水相， 酶联免疫吸附试验法检测蓖麻毒素A链的含量，计算微泡包封率为(78.29士18.36) %。
5. 载药微泡的体外抗肝癌作用
人肝癌Bel-7402细胞培养于6孔板，加入载药微泡后，lMHz超声辐照5min，继续培 养24h后，MTT法测得肿瘤细胞半数致死浓度为2.9X10—7mol/L，而单纯载药微泡的半数 致死浓度为4.8X10—5 mol/L。
6. 载蓖麻毒素A链的脂质微泡制备
称取二硬脂酰磷脂酰胆碱10mg、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺4mg、司班80 2mg、甘油0. lml、 磷酸盐缓冲液0. 9ml、蓖麻毒素A链0. lmg，混合后，置于1. 5ml的内含全氟丙烷的管形 瓶内，4(TC水浴30min后，涡旋振荡仪振荡lmin，静置5min后加入lml磷酸盐缓冲液稀 释，即得到载蓖麻毒素A链的脂质超声造影剂微泡。
7. 超声介导载蓖麻毒素A链微泡体内抗裸小鼠皮下移植肝癌作用 建立荷人肝癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤模型，当肿瘤生长到直径为l.Ocm时，将载药微泡
通过静脉注入裸鼠体内，1 MHz超声辐照3min，间隔3分钟，重复3次。14天后，处死裸 鼠，剥离肿瘤称质量，计算肿瘤生长抑制率为42. 8%。
8. 超声介导载蓖麻毒素A链微泡体内抗裸大鼠原位移植肝癌作用
超声引导下，将人肝癌细胞H印G2与Matrigel混合后，注入裸大鼠肝实质内，建立 原位移植肝癌模型。当肿瘤生长到约l.Ocm时，通过静脉注入载蓖麻毒素A链微泡，1^fflz 超声辐照3min，间隔3分钟，重复3次。14天后，彩色多普勒超声观察发现大鼠肝癌明 显小于模型组、单纯载药微泡组、单纯超声辐照组，抑瘤率为39. 1%，病理检査可见肿瘤 组织大片坏死。
9. 超声介导载蓖麻毒素A链微泡体内抗裸小鼠皮下移植胰腺癌作用 建立荷人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤模型，当肿瘤生长到直径为l.Ocm时，将载药微
泡通过静脉注入裸鼠体内，1 MHz超声辐照3min,间隔3分钟，重复3次。14天后，处死 裸鼠，剥离肿瘤称质量，计算肿瘤生长抑制率为48. 6%。
10. 超声介导载蓖麻毒素A链微泡体内抗裸小鼠皮下移植乳腺癌作用 建立荷人乳腺癌裸鼠皮下移植瘤肿瘤模型，当肿瘤生长到直径为l.Ocm时，将载药微
泡通过静脉注入裸鼠体内，1 MHz超声辐照3min，间隔3分钟，重复3次。14天后，处死 裸鼠，剥离肿瘤称质量，计算肿瘤生长抑制率为46. 7%。
权利要求
1、一种高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡，其特征在于采用蓖麻毒素A链与超声造影剂微泡结合成的载蓖麻毒素A链超声微泡。
2、 根据权利要求1所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡，其特征在于所述的 蓖麻毒素A链与超声造影剂微泡的结合采用蓖麻毒素A链包裹于微泡内，或蓖麻毒素A链 吸附于微泡表面。
3、 根据权利要求1所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡，其特征在于所述超 声造影剂微泡选自高分子材料超声造影剂微泡、脂质超声造影剂微泡、人血白蛋白超声造 影剂微泡之一种。
4、 根据权利要求1所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡，其特征在于所述的 载蓖麻毒素A链超声微泡采用水/油/水复乳-溶剂挥发法制备成的载蓖麻毒素A链的 PLGA-PEG-PLGA微泡，或者采用二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、司班、甘 油、磷酸盐缓冲液与蓖麻毒素A链混合制得的载蓖麻毒素A链的脂质超声造影剂微泡。
5、 根据权利要求3所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡，其特征在于l)所述 高分子材料微泡包括微泡壳成分中含有各种高分子作为成膜材料的超声微泡，所用的高分 子材料选自聚乙二醇、乳酸/羟基乙酸共聚物，或其二元或三元嵌段共聚物、接枝共聚物、 氰基丙烯酸酯中之一种；2)所述脂质微泡为包括各种用磷脂或磷脂类衍生物作为成膜材 料的脂质微泡，所述的磷脂或磷脂类衍生物选自卵磷脂、胆固醇、1， 2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸甘油基-钠盐、1， 2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱、1， 2-二棕 榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸-钠盐中之一种；3)所述人血白蛋白微泡包括各种用人血白 蛋白作为成膜材料的超声微泡。
6、 一种高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡的制备方法，包括如下步骤取配比量 蓖麻毒素A链水溶液加入配比量的PLGA-PEG-PLGA溶液，在高转速搅拌下得到初乳液,倒入 适宜浓度适宜量的聚乙烯醇水溶液中，高转速搅拌后，再低转速磁力搅拌后，使有机溶剂 挥发完全，离心分离，重蒸水洗涤，获得载蓖麻毒素A链超声微泡，真空冷冻干燥后充入 惰性气体，低温保存；上述的蓖麻毒素A链与PLGA-PEG-PLGA共聚物摩尔比为1X1(T4 1 X10—3: 1。
7、 根据权利要求6所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡的制备方法，其特征 在于获得的载蓖麻毒素A链超声微泡加入防冻剂甘油，真空冷冻干燥后充入惰性气体，低 温保存；超声造影剂微泡的气体内核成分选自常温下呈气态的惰性气体全氟丙垸、全氟丁 烷或六氟化硫中之一种。
8、 根据权利要求6或7所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡的制备方法，其 特征在于所述PLGA-PEG-PLGA共聚物的分子量为2000 20000dal。
9、 根据权利要求6或7所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡的制备方法，其 特征在于所述蓖麻毒素A链水溶液的浓度为1 10 mg/ml， PLGA-PEG-PLGA溶液浓度为20 200 mg/ml，聚乙烯醇水溶液浓度为0. 5% 5%。
10、 根据权利要求6或7所述的高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡的制备方法，其 特征在于所述蓖麻毒素A链水溶液加入PLGA-PEG-PLGA溶液，在2000 20000转/分转速搅拌0. 5 5 min，得到初乳液，倒入聚乙烯醇水溶液中，在2000 20000转/分转速搅拌0. 5 5 min，再于100 500转/分转速，磁力搅拌4 24 h。
全文摘要
本发明公开一种高效低毒的载蓖麻毒素A链超声微泡及其制备方法，所述的载蓖麻毒素A链超声微泡采用蓖麻毒素A链与超声造影剂微泡结合而成的。所述结合采用蓖麻毒素A链包裹于微泡内或吸附于微泡表面。所述制备方法为取配比量蓖麻毒素A链水溶液加入配比量的PLGA-PEG-PLGA溶液，在高转速搅拌下得到初乳液，倒入适宜浓度适宜量的聚乙烯醇水溶液中，高转速搅拌后，再低转速磁力搅拌后，使有机溶剂挥发完全，离心分离，重蒸水洗涤，获得载蓖麻毒素A链超声微泡，真空冷冻干燥后充入惰性气体，低温保存。因而通过超声触发微泡靶向定点释放蓖麻毒素A链，既明显增强病变部位抗肿瘤效应，又减轻全身毒副作用，真正达到肿瘤靶向治疗的目的。
文档编号A61K49/22GK101433515SQ20081007247
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月26日 优先权日2008年12月26日
发明者杨嘉嘉, 杨映红, 林礼务, 蔡敏娴, 薛恩生, 陈志奎 申请人:福建医科大学附属协和医院