专利名称：异甘草素作为预防或治疗恶性肿瘤术后转移和复发的药物的应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种从甘草属植物中提取的异黄酮类化合物——异甘 草素的新用途，特别涉及其作为恶性肿瘤手术切除后预防或治疗肿瘤复发和转移的药物中的 应用。
背景技术：
癌症(Cancer)也称为恶性肿瘤(malignant tumours)或赘生物(neoplasms),是一类可 发生于机体各部位的约100多种疾病的总称。WHO将癌症定义为可迅速超过其正常边界生长 的不正常细胞，这些细胞能够侵袭毗邻IK常部位并播散到其它器官一一这一过程称作转移 (metastasis )，转移是癌症死亡的主要原因[http :〃www. who. int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ ， 2007]。
癌症是世界人口死亡的首要因素之一。2005年全球死亡人数约5,800力，其中有760万 死于肿瘤。我国卫生部统计数据表明，2006年恶性肿瘤己成为我国城市和农村居民第一位死 亡原因。随着世界范围内人口老龄化的加剧，每年死于肿瘤的人数仍在继续增加，预计全球 2015年将有900万人死于肿瘤，到2030年将达1140万人，恶性肿瘤将成为影响全球人口最 主要的慢性疾病。
尽管科学的发展日新月异，恶性肿瘤治疗的新方式和方法也层出不穷，但仍未改变大多 数恶性肿瘤患者(约90%)最终死于肿瘤这一现实。转移是恶性肿瘤患者预后不良乃至死亡 的最主要原因，肿瘤转移是一个极其复杂的病理过程。转移指恶性肿瘤细胞能够侵袭毗邻^ 常部位组织并向远处播散到其它器官，是多,-骤、多因素参与和调控的复杂过稃。现有研究 表明，与细胞间粘附性、细胞外基质降解和血管新生相关的多种因子参与了肿瘤转移过程。 目莉常规的手术、放分和化学治疗对于肿瘤转移均未有理想的治疗效果，这也正是目前全球 肿瘤患者死亡数量居高不下的主要原因。
癌症治疗的目的在于彻底治愈肿瘤或延长患者生存期或改善患者生活质量。治疗手段主 要为手术切除、放疗或化疗。对于较早期未扩散或转移的癌灶，采用手术切除或放疗治疗清 除原发灶，无疑为消除可发生转移肿瘤细胞大本营的最佳方式，但对于发现时己发生远处转 移、处于晚期的肿瘤患者则不甚理想。遗憾的是，受现有诊断水平的影响，大部分患者在发 现患有恶性肿瘤时均己处于中晚期，已有远处转移发生，对于此类患者，目甜的治疗效果仍 然有限。廖美琳教授统计了 33年來上海地区肿癌发病情况，其中发现时己是111期的占30.4%， IV期的占47.5。/。，处于此期的患者5年总生存率不足10% (GLOBOCAN 2002， IARC， 2007
3年csco会议资料)。更糟糕的是，确诊为早期未转移的患者，并不一定真的未发生远处转移，
只不过受目前技术条件限制，不能发现而已。这也是大多数肿瘤患者死于转移的最主要原因。
手术治疗对于早期发现的未发生转移的恶性肿瘤患者算是最为合适的手段。为抑制肿瘤 转移，清除原发灶是必要的，只有这样才可以清除可转移细胞的大本营，但令人遗憾的是， 手术切除原发瘤的过程本身可促进肿瘤的转移，这种副作用源于与转移相关的几条通路间的 协同作用，包括肿瘤细胞由原发灶的脱离、新血管生成作用增强、生长因子的分泌和免疫抑
制。早在上世纪50年代，即己发现手术应激可致荷瘤鼠的生存时间縮短[l) Buinauskas P， McDonald GO, Cole WH, et al. Role of operative stress on the resistance of. the experimental animal to inoculated cancer cells. Ann. Surg. 1958; 148: 642-645]，随后的研究又表明，手术应激 可增加大鼠异体结肠癌种植后的成瘤率[Weese JL, Ottery FD， Emoto SE. Do operations facilitate tumor growth An experimental model in rats. Surgery. 1986 Aug;100(2):273-7.]。研究表 明，手术过程中由切除原发灶脱落下来的肿瘤细胞可在原位种植或通过血管发生远处转移， 导致肿瘤的复发和远处转移的发生[Weitz J, Herfarth C. Surgical strategies and minimal residual disease detection. Semin Surg Oncol. 2001; 20:329 - 333; Eschwege P, Dumas F， Blanchet P， et al. Haematogenous dissemination of prostatic epithelial cells during radical prostatectomy. Lancet. 1995; 346:1528 — 1530; Yamaguchi K, Takagi Y, Aoki S, et al. Significant detection of circulating cancer cells in the blood by reverse transcriptase-polymerase chain reaction during colorectal cancer resection, Ann Surg. 2000; 232:58 - 65.];另一方面手术可致患者细胞介导免疫功能抑制，如 NK细胞活性下降，导致肿瘤可以逃避免疫监视，致使肿瘤转移发生[Ben-Eliyahu S, Page GG, Yirmiya R， Shakhar G. Evidence that stress and surgical interventions promote tumor development by suppressing natural killer cell activity. Int J Cancer 1999;80:880 - 888.];近来研究还发现，手 术创口的修复可致机体内多种生长因子水平升高，如结合肝素的类表皮生长因子(HB-GEF) 和血小板衍生生长因子(PDGF)，这些因子可缩短肿瘤的倍增时间，促进已有微转移灶的生 长[Abramovitch R, Marikovsky M, Meir G and Neeman M. Stimulation of tumour growth by wound-derived growth factors. Br J Cancer. 1999; 79:1392 - 1398; Hofer SO, Molema Q Hermens RA, et al. The effect of surgical wounding on tumour development. Eur J Surg Oncol. 1999; 25:231 -243.];另外，手术过程或切除原发灶可促进血管新生因子(bFGF、 EGF等)[Maniwa Y, Okada M, Ishii N， Kiyooka K. Vascular endothelial growth factor increased by pulmonary surgery accelerates the growth of micrometastases in metastatic lung cancer. Chest. 1998;114(6):1668-75; Yoon SS, Kim SH, Gonen M, et al. Profile of plasma angiogenic factors before and after hepatectomy for colorectal cancer liver metastases. Ann Surg Oncol. 2006;13(3):353-62]表达水平 的升高、抗血管新生因子(如血管抑素和内皮抑素)表达水平降低，也导致新转移灶的形成和处于休眠状态转移灶的快速生长[O， Reilly MS， Holmgren L, Shing Y, et al. Angiostatin: anovel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma.Cell. 1994; 79:315 - 328.; Kaya M， Wada T, Nagoya S, Yamashita T. Prevention of postoperativeprogression of pulmonary metastases in osteosarcoma by antiangiogenic therapy using endostatin. JOrthop Sci. 2007;12(6》562-7 ; Shepherd KE. Postoperative metastasis risk: more thanimmunosuppression. Anesthesiology. 92(5):1498-1499]。 Xu等研究发现，将不同人源肿瘤细胞株移植到裸鼠皮下，生长至一定时间后切除皮下原发灶，继续饲养一定时间后，肺转移灶数目明显高于原发肿瘤灶未切除小鼠，表明切除原发灶可增强大多恶性肿瘤的转移潜能[徐冰，姚明，顾为望，等.人癌术后转移动物模型的建立及其生物学特性研究.南方医科大学学报.2007;27(7):1009-n.;i。
以上研究表明，尽管手术切除作为早期恶性肿瘤最佳治疗选择，许多肿瘤根治切除后仍会发生转移， 一方面局限于目前的诊断手段，不能发现微转移灶，另一方面也在于手术切除原发灶促进了肿瘤转移及已有转移灶的生长，这也正是大多恶性肿瘤患者最终死于肿瘤的原因之一。目前恶性肿瘤切除后，除手术后采用几个周期常规化疗方式來防止肿瘤的复发或转移外，尚未有更合适的治疗药物或方法，而采用常规化疗可产生较为严重的不良反应， 一方面常规化疗药多为静脉给药制剂，难于长期用药，另一方面细胞毒类化疗药物可产生骨髓抑制、胃肠道反应等严重不良反应，导致患者免疫功能低下，反而有可能造成肿瘤的复发和转移。因此，开发一类具有预防恶性肿瘤术后复发或转移作用，无严重不良反应的药物，适于患者长期应用的恶性肿瘤术后的辅助治疗药物势在必行。
早在20世纪50年代就有科学家通过肿瘤细胞自体移植实验发现肿瘤组织中极少数细胞能诱发新的肿瘤组织，由此科学家们提出了肿瘤干细胞的假设。早期研究通过软琼脂克隆形成以及动物体内成瘤实验发现白血病和一些实体肿瘤组织中都存在少量特殊细胞，在体外它们可以单独形成克隆，在体内它们能够形成肿瘤组织，而大部分肿瘤细胞不具备这种能力。更深入的研究表明这些细胞有着成体干细胞的表面标志和千细胞的特性，担当着肿瘤组织起始细胞功能，它们被称为肿瘤干细胞。目前己经在骨髓性白血症、恶性脑肿瘤、乳腺癌等多种恶性肿瘤中发现有干细胞存在。这些发现促成了人们重新认识癌变机理，从而提出了肿瘤干细胞癌变假说，该假说提出肿瘤的恶性表型是由肿瘤组织内一小群肿瘤干细胞维持的，肿瘤的转移和复发是肿瘤干细胞更新和增殖的结果，各种治疗手段的失败也是因这种治疗手段对肿瘤干细胞自我更新和增殖无效的结果[耿春霞，陈玉，冯晓刚，李世杰.肿瘤干细胞研究进展.世界中西医结合杂志.2008;3(4):244-246]。因此，寻找到对肿瘤干细胞自我更新和增殖有效的药物，对临床治疗肿瘤术后的复发和转移有重要意义。异甘草素(2，4,4-trihydroxychalcone， isoliquiritigenin)是从甘草属植物(Glycyrrhiza)分离、纯化的异黄酮类化合物，它可通过超临界二氧化碳萃取技术萃取、氯仿萃取等方法提取，再经大孔吸附树脂技术和柱层析技术分离纯化异甘草素(东北林业大学，异甘草素和甘草酸提取纯化工艺研究，2005)。中科院上海药物研究所植化研究室对异甘草素的化学结构和理化性质已有详细的叙述。(黄酮体化合物鉴定手册[M]，北京:科学出版社,1981)。异甘草素的分子式为Cl5H1204，结构式如下
异甘草素是甘草中的一种异黄酮化合物，它有着很强的药理活性，具有抑制肿瘤绅胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抗病毒、抗自由基、松弛血管、抑制脂质过氧化等生物活性，其中抗肿瘤作用是近年来的研究热点。文献报道了[Yamazaki S, Morita T, Endo H， et al.
Isoliquiritigenin suppresses pulmonary metastasis of mouse renal cell carcinoma. Cancer Lett. 2002
Sep8;183(l):23-30.]异甘草素可以抑制小鼠肾细胞癌的人工肺转移，与异甘草素的细胞毒作用及活化细胞毒性淋巴细胞有关。所谓人工肺转移，是指直接将小鼠肾细胞癌自尾静脉注射至小鼠体内，观察癌细胞在小鼠肺内肿瘤灶的形成，这一过程仅仅模拟了肿瘤细胞侵入血管后的肿瘤转移过程，不能反映肿瘤细胞自原发灶脱离，再侵入血管或淋巴管，随血流或淋巴液到达远处器官，形成新转移灶的过程，因此本研究结果不能说明异甘草素对于切除原发灶肿瘤复发和转移具有抑制作用。文献[张晶，杨静，汤宏斌.异甘草素对人宫颈癌细胞增殖的抑制作用.中国药理学与毒理学杂志.2005;19(6):436-442;王艾丽，郑航，郑新民，等.异甘草素对人前列腺癌细胞体外增殖的抑制作用.临床泌尿外科杂志.2007; 22(11):867-868]报道了异甘草素对于宫颈癌和前列腺癌细胞的增殖具有抑制作用，也未涉及异甘草素具有预防肿瘤术后复发和转移的作用。专利[一种抗肿瘤的异甘草素片剂，申请号200710053147.7]仅公开了以异甘草素制备抗肿瘤药物片剂的工艺方法，并未涉及异甘草素用于制备预防或治疗手术切除原发灶后抑制肿瘤复发和转移的药物中的应用。
本发明提供了一种异甘草素的新用途，即异甘草素用于制备防止恶性肿瘤手术后复发和转移的药物中的应用，可用于多种恶性肿瘤手术后的辅助治疗，可防止或延缓肿瘤的复发以
发明内容及转移，从而改善患者的预后，提高其生活质量。
本发明所述的恶性肿瘤包括常见的肺癌、肝癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤、颅脑肿瘤等各种适于手术切除的恶性肿瘤。
本发明提供的异甘草素可以在手术切除原发灶后长期应用，具有明显的抑制肿瘤复发和转移的功效，无明显不良反应，成本低廉，明显优于采用常规化疗药物治疗。
本发明所述的异甘草素可以根据临床需要，加入相应辅料，以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、悬浮液、溶液、糖桨、注射剂、霜剂、软膏、凝胶剂、喷雾剂、口嚼剂或贴剂等制剂形式存在。
本发明所述的异甘草素可根据临床需要，采用口服或非口服方式用药，优选口服和药方式。
本发明所述的异甘草素制剂采用口服方式用药时，人用剂量优选lmg/人/闩至1000mg/人/日，其中更优选为10mg/人/日至500mg/人/日，最优选为100 mg/人/日。
本发明所述的异甘草素是从中药甘草中提取分离获得或人工方式合成，可采用任何已公开文献或专利方法提取制备。如可采用文献[付玉杰，刘晓娜，王微，等.酸水解法提取甘草中异甘草素工艺研究.中国药学杂志.2007; (ll)];付玉杰，侯春莲，刘威，等.超临界C02萃取异甘草素的提取工艺.应用化学.2007;;]等方法由甘草中分离提取，也可采用文献[杨立，沈凤嘉.甘草素与异甘草素的合成.药学学报.1994;29(ll):877-880]，或采用已公开的专利[一种异甘草素的合成方法，申请号200410065383.7]等方法制备。采用各种不同方法制备的异甘草素对本发明的用途没有影响。
以下结合实施例和实验例对本发明进行说明，但本发明并不受限于该实施例。实验例1异甘草素对手术切除黑色素瘤后复发和转移的影响
异甘草素购自江西本草天工科技有限公司，HPLC法测定纯度为99.8%。小鼠B16F10黑色瘤高转移细胞株购自中国典型培养物保藏中心，细胞以含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 y g/ml链霉素的DMEM培养基，于37。C， 5% (302条件下培养，每24小时换培养液一次，每3天传代一次。 .
取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化，以上述完全培养液调成浓度为1X10々ml的单细胞悬液，于C57BL/6小鼠左腋部皮下注射瘤细胞悬液0.1 ml，共接种小鼠150只。2周后，选取瘤块长径大于0.5 cm小鼠120只，随机分为6组，每组20只。随机取一组作为荷瘤对照组，其余5组水合氯醛麻醉后消毒局部皮肤，剥除瘤块，注意血管的剥离和肿瘤包膜的剔除，避免因出血过多而造成动物死亡，'同时保证尽量剥除千净，要把肿瘤全部切除，缝合伤口后继续饲养。荷瘤对照组给予麻醉并切开皮肤，但不剥除瘤块，缝合皮肤后继续饲养，每日观察小鼠状态。剥除瘤块的5组中随机选一组作为切除肿瘤对照组，其余4组给予不同剂量异甘草素，分别为0.1mg/kg， 1.0mg/kg， 10.0 mg/kg和100 mg/kg，异甘草素以0.5%羧甲基纤维素钠混悬，给药体积20ml/kg，每R给药一次。切除肿瘤对照组和每円给予0.5%羧甲基纤维素钠20 ml/kg。连续给药2周后，各组小鼠摘眼球取血，分离血清，作生化测定。处死各组小鼠，剥离双肺，解剖显微镜下观察计数双肺转移灶数目。以单因素方差分析作肺转移灶数目组间统计学比较，以xZ分析作组间复发数量比较。
实验结束时，荷瘤对照组3只小鼠死亡，其余各组均全部存活。结果表明(表l)，手术切除肿瘤原发灶后，小鼠生活状态优于荷瘤组，至实验结束时未现明显衰竭状态，而荷瘤对照组除3只死亡外，另有4只生活状态差，因瘤块影响，自发活动减少，出现进食进水困难等现象。切除肿瘤对照组肺转移灶数目较荷瘤对照组明显增加(尸O.Ol)，另有8只小鼠原发部位发现肿瘤灶，表明有复发现象，这一结果说明手术切除原发灶促进了肿瘤新的肺转移灶的形成。给予异甘草素，可剂量依赖性地抑制肿瘤转移灶的形成和原发部位的复发，表明异甘草素对切除黑色素瘤原发灶而造成的肿瘤转移有明显抑制作用，对肿瘤复发也有明显抑制作用。
表1异甘草素对切除原发灶后B16F10黑色素瘤复发和转移的影响
剂量 出现复发鼠数 肺转移灶数
组别 n a
(mg/kg) (只) (个)
荷瘤对照组179.06±2.47
切除肿瘤对照组20829.1 ±6. 48"
给药组0.12024. 5±5. 61*
给药组1.02015.6士4.38"
给药组10.020『11.9土3.39"
给药组1002010.3±3.18**
与荷瘤对照组比较"代O. 01;与切除肿瘤对照组比较:*代0.05， **代0. 01
实验例2异甘草素对手术切除肺癌原发灶后复发和转移的影响
小鼠Lewis肺癌细胞株购自中国医学科学院北京药物研究所，细胞接种于C57BL/6小鼠
腋部皮下保种。传代时取己接种肿瘤两周、肿瘤生长状态良好无溃破的荷瘤小鼠，断颈处死，
75%酒精浸泡消毒后无菌剥取瘤块，剪成lmr^大小瘤块，以20#穿刺针接种于C57BL/6小
鼠腋部皮下，共接种小鼠150只。2周后，选取瘤块长径大于0.5 cm小鼠120只，随机分为
6组，每组20只。随机取一组作为荷瘤对照组，其余5组水合氯醛麻醉后消毒局部皮肤，剥
除瘤块，注意血管的剥离和肿瘤包膜的剔除，避免因出血过多而造成动物死亡，同时保证尽
量剥除干净，要把肿瘤全部切除，缝合伤口后继续饲养。荷瘤对照组给予麻醉并切开皮肤，
但不剥除瘤块，缝合皮肤后继续饲养，每R观察小鼠状态。剥除瘤块的5组中随机选一组作
为切除肿瘤对照组，其余4组给予不同剂量异甘草素，分别为0.1 mg/kg， 1.0 mg/kg， 10.0 mg/kg和100mg/kg，异甘草素以0.5%羧甲基纤维素钠混悬，给药体积20 ml/kg，每闩给药一次。切除肿瘤对照组和每闩给予0.5%羧甲基纤维素钠20 ml/kg。连续给药2周后，各组小鼠摘眼球取血，分离血清，作生化测定。处死各组小鼠，剥离双肺，解剖显微镜下观察计数双肺转移灶数目。以单因素方差分析作肺转移灶数目组间统计学比较，以)^分析作组间复发数量比较。
实验结束时，各组小鼠均未出现死亡，荷瘤对照组小鼠中5只因肿瘤块太大出现行动困难，自发活动减少等衰竭现象。实验结束后手术切除原发灶肿瘤后复发和肺转移灶计数结果表明(表2)，手术切除肿瘤原发灶后，小鼠生活状态优于荷瘤组，至实验结束时各切除原发灶组未现明显衰竭状态。切除肿瘤对照组有5只接种部位出现复发，肿瘤肺转移灶数目较荷瘤对照组明显增加(PO.Ol)，表明手术切除原发灶可促进肿瘤新转移灶的形成。给予异甘草素，可剂量依赖性地抑制肿瘤转移灶的形成和原发部位的复发，表明异甘草素对切除肺癌原发灶而造成的肿瘤转移有明显抑制作用，对肿瘤复发也有明显抑制作用。
表2异甘草素对切除肺癌原发灶后肿瘤复发和转移的影响组别剂量 mg/kg)n出现复发鼠数 (只)肺转移灶数 (个)
荷瘤对照组206.85 ±1.48
切除肿瘤对照组2018.95士4.77"
给药组0.1200**17.9±3.81
给药组1.0200 14.7±3.16**
给药组10.0200 10.55 ±2.98"
给药组100200 8.70±2.4广
与荷瘤对照组比较与切除肿瘤对照组比较:*代0.05，"代O. 01
实验例3异甘草素对人肝癌手术切除原发灶后复发和转移的影响
实验方法参照文献[徐冰，姚明，顾为望，等.人癌术后转移动物模型的建立及其生物学特性研究.南方医科大学学报.2007;27(7):1009-11.]。
人肝癌高转移细胞株LCI-D20购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，接种于SPF级BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下传代保存。
取出皮下传代的荷瘤裸小鼠皮下移植瘤，浸入含青霉素和链霉素各100 U/ml的生理盐水中，选择生长良好、无坏死、呈鱼肉状的瘤组织，剪切成约lmn^的小块，用20号套管针移植至BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下，建模后观察小鼠一般活动，营养状态及移植瘤的潜伏期、成瘤率和生长情况。
接种肿瘤三周后，选取瘤块直径大于1 cm且肿瘤生长状态良好无溃破的荷瘤小鼠90只，
9随机分为6组，每组15只。随机取一组作为荷瘤对照组，其余5组水合氯醛麻醉后消毒局部 皮肤，剥除瘤块，注意血管的剥离和肿瘤包膜的剔除，避免因出血过多而造成动物死亡，同 时保证尽量剥除干净，要把肿瘤全部切除，缝合伤口后继续饲养。荷瘤对照组仅给予麻醉并 切开皮肤，但不剥除瘤块，缝合皮肤后继续饲养，每R观察小鼠状态。剥除瘤块的5组中随 机选一组作为切除肿瘤对照组，其余4组给予不同剂量异甘草素，分别为0.1mg/kg，1.0 mg/kg， 10.0 mg/kg和100 mg/kg，异甘草素以0.5%羧甲基纤维素钠混悬，给药体积20 ml/kg，每日给 药一次。切除肿瘤对照组和每日给予0.5。/。羧甲基纤维素钠20ml/kg。连续给药4周后。处死 各组小鼠，剥离双肺，解剖显微镜下观察计数双肺转移灶数目。以单因素方差分析作肺转移 灶数目组间统计学比较，以xS分析作组间复发数量比较。
实验结束时，各组小鼠均未出现死亡，荷瘤对照组小鼠中8只因肿瘤块太大出现行动困 难，自发活动减少等现象。实验结果表明(表3)，手术切除肿瘤原发灶后，小鼠生活状态优 于荷瘤组，至实验结束时各切除原发灶组未现明显衰竭状态。切除肿瘤对照组有6只接种部 位出现复发，肿瘤肺转移灶数目较荷瘤对照组明显增加(尸O.Ol)，表明手术切除原发灶可促 进肿瘤新转移灶的形成。给予异甘草素，可剂量依赖性地抑制肿瘤转移灶的形成和原发部位 的复发，表明异甘草素对切除肝癌原发灶而造成的肿瘤转移有明显抑制作用，对肿瘤复发也 有明显抑制作用。
表3异甘草素对切除原发灶后肝癌复发和转移的影响组别剂量 (mg/kg)n出现复发鼠数 (只)肺转移灶数 (个)
荷瘤对照组1511.8±2.13
切除肿瘤对照组15624.9土5.16"
给药组0.115221.0士4.7T
给药组1.0 15(T18.4 ±3.96"
给药组10.015(T12.1 ±3.78"
给药组100150**11. 7土3.17"
与荷瘤对照组比较"代0.01;与切除肿瘤对照组比较*代0. 05， **线01。
实验例4异甘草素对人结肠癌手术切除原发灶后复发和转移的影响
实验方法参照文献[徐冰，姚明，顾为望，等.人癌术后转移动物模型的建立及其生物学 特性研究.南方医科大学学报.2007;27(7):1009-11.]。
人结肠癌细胞株HCT-116购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，接种于SPF级 BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下传代保存。
取出皮下传代的荷瘤裸小鼠皮下移植瘤，浸入含青霉素和链霉素各100 U/ml的生理盐水
中，选择生长良好、无坏死、呈鱼肉状的瘤组织，剪切成约lmiV的小块，用20号套管针移植至BALB/c-nu/nu裸小鼠皮下，建模后观察小鼠一般活动，营养状态及移植瘤的潜伏期、成 瘤率和生长情况。
接种肿瘤三周后，选取瘤块直径大于1 cm且肿瘤生长状态良好无溃破的荷瘤小鼠90只， 随机分为6组，每组15只。随机取一组作为荷瘤对照组，其余5组水合氯醛麻醉后消毒局部 皮肤，剥除瘤块，注意血管的剥离和肿瘤包膜的剔除，避免因出血过多而造成动物死亡，同 时保证尽量剥除干净，要把肿瘤全部切除，缝合伤口后继续饲养。荷瘤对照组仅给予麻醉并 切丌皮肤，但不剥除瘤块，缝合皮肤后继续饲养，每日观察小鼠状态。剥除瘤块的5组中随 机选一组作为切除肿瘤对照组，其余4组给予不同剂量异甘草素，分别为0.1mg/kg，1.0 mg/kg， 10.0 mg/kg和100 mg/kg，异甘草素以0.5%羧甲基纤维素钠混悬，给药体积20ml/kg，每日给 药一次。切除肿瘤对照组和每日给予0.5y。羧甲基纤维素钠20ml/kg。连续给药4周后。处死 各组小鼠，剥离双肺，解剖显微镜下观察计数双肺转移灶数目。以单因素方差分析作肺转移 灶数目组间统计学比较，以xZ分析作组间复发数量比较。
实验结束时，各组小鼠均未出现死亡，荷瘤对照组小鼠中5只因肿瘤块太大出现行动困 难，自发活动减少等现象。实验结果表明(表4)，手术切除肿瘤原发灶后，小鼠生活状态优 于荷瘤组，至实验结束时各切除原发灶组未现明显衰竭状态。切除肿瘤对照组有7只接种部 位出现复发，肿瘤肺转移灶数目较荷瘤对照组明显增加(尸O.Ol)，表明手术切除原发灶可促 进肿瘤新转移灶的形成。给予异甘草素，可剂量依赖性地抑制肿瘤转移灶的形成和原发部位 的复发，表明异甘草素对切除结肠癌原发灶而造成的肿瘤转移有明显抑制作用，对肿瘤复发 也有明显抑制作用。
表4异甘草素对切除原发灶后结肠癌复发和转移的影响组别剂量 (mg/kg)n出现复发鼠数 (只)肺转移灶数 (个)
荷瘤对照组1514.2±3.46
切除肿瘤对照组15721.2土5.37"
给药组0.115r19.1 ±4.82
给药组1.0150 16.6土3.73'
给药组10.0150**15.9土3.1广
给药组10015(T14.9±3.06w
与荷瘤对照组比较:§§代0. 01;与切除肿瘤对照组比较*代0. 05，林代O. 01。
实验例5异甘草素对人乳腺癌手术切除原发灶后复发和淋巴结转移的影响
实验方法参照文献[杨毅，冯玉梅，魏熙胤，等.免疫双缺陷鼠人乳腺癌转移模型的生物
学特性研究.中华实验外科杂志.2002; 19(06):591-593]。
人结肠癌细胞株MDA-MB-231购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，接种于雌性SPF级SCID联合免疫缺腺鼠腹部脂肪垫上传代保存。
取出皮下传代的荷瘤裸小鼠皮下移植瘤，浸入含青霉素和链霉素各100 U/ml的生理盐水 中，选择生长良好、无坏死、呈鱼肉状的瘤组织，剪切成约lmr^的小块，用20号套管针移 植至SCID小鼠腹部脂肪垫上，建模后观察小鼠一般活动，营养状态及移植瘤的潜伏期、成 瘤率和生长情况。
接种肿瘤4周后，选取瘤块直径大于1 cm且肿瘤生长状态良好无溃破的荷瘤小鼠90只， 随机分为6组，每组15只。随机取一组作为荷瘤对照组，其余5组水合氯酸麻醉后消毒局部 皮肤，剥除瘤块，注意血管的剥离和肿瘤包膜的剔除，避免因出血过多而造成动物死亡，同 时保证尽量剥除干净，要把肿瘤全部切除，缝合伤口后继续饲养。荷瘤对照组仅给予麻醉并 切开皮肤，但不剥除瘤块，缝合皮肤后继续饲养，每日观察小鼠状态。剥除瘤块的5组中随 机选一组作为切除肿瘤对照组，其余4组给予不同剂量异甘草素，分别为0.1 mg/kg， 1.0 mg/kg， 10.0 mg/kg和100 mg/kg，异甘草素以0.5%羧甲基纤维素钠混悬，给药体积20ml/kg，每日给 药一次。切除肿瘤对照组和每日给予0.5。/。羧甲基纤维素钠20ml/kg。连续给药4周后。处死 各组小鼠，解剖观察原发灶有无复发，并取各部位淋巴结，组织病理学检查有无转移发生， 计算各组发生淋巴结转移的百分率。以\2分析作组间复发和淋巴结转移的统计学比较。
实验结束时，各组小鼠均未出现死亡，荷瘤对照组小鼠屮9只因肿瘤块太大出现行动困 难，自发活动减少等现象。实验结果表明(表5)，手术切除肿瘤原发灶后，小鼠生活状态优 于荷瘤组，至实验结束时各切除原发灶组未现明显衰竭状态。切除肿瘤对照组有9只接种部 位出现复发，12只小鼠发生远处淋巴结转移，明显高于荷瘤对照组(尸<0.01)，表明手术切 除原发灶可促进肿瘤转移。给予异甘草素，可剂量依赖性地抑制肿瘤淋巴结转移灶的形成和 原发部位的复发，表明异甘草素对切除结肠癌原发灶而造成的肿瘤转移有明显抑制作用，对 肿瘤复发也有明显抑制作用。
表5异甘草素对切除原发灶后结肠癌复发和转移的影响
组别剂量 (mg/kg)n出现复发鼠数 (只)淋巴结转移鼠数 (只)
荷瘤对照组155
切除肿瘤对照组15912"
给药组0.1153*8
给药组1.015(T6*
给药组10.015(T6*
给药组10015(T;科
与荷瘤对照组比较:§§代0. 01;与切除肿瘤对照组比较*代0. 05， **代0.01。
实验例6异甘草素对肿瘤干细胞的治疗作用
12实验方f去参'照、文献[Guzman ML, Rossi RM， Kamischky L， W a/. The sesquiterpene lactone parthenlide induces apoptosis of human acute myelogenous leukemia stem and progenitor cells. Blood 105:4163-4169,2005],集落形成率是评价肿瘤干细胞自我更新和增殖能力的较为经典的 方法。
试验方法急性髓系白血病细胞(acute myeloid leukemia)和急变期慢性髓系白血病(blast chronic myeloid leukemia)病人的外周血或骨髓细胞。外周血细胞用白细胞分离液去除红细胞， 骨髓细胞用150mMNH4Cl禾卩10 mM NaHC03处理5分钟去除红细胞。细胞用无血清培养 基洗三遍，加入异甘草素(终浓度为O、 5、 10 Pg/ml)处理4小日寸，或加入阿糖胞苷(终浓 度为0、 5、 10 Pg/ml)。然后用无血清培养基洗三遍去除异甘草素，用甲基纤维素IMAM培 养液(1%甲基纤维素、30%牛血清白蛋白、0.2 mM巯基乙醇、2mM谷氨酰酰胺、50 ng/ml 重组人干细胞因子、10ng/ml重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子，10ng/ml重组人白介 素-3、 3单位/ml促红细胞生成素、50ng/ml粒细胞集落生成因子)配成50000细胞/ml，放 入二氧化碳培养箱，培养10-14天，观察细胞集落。
结果以上的细胞集落方法是观察肿瘤干细胞的一种公认的方法，能生成集落的细胞被 认为是肿瘤干细胞。阿糖胞苷是一个广泛用于治疗急性髓系白血病、慢性髓系白血病、急性 淋系白血病和淋巴瘤的一种抗癌药。从结果看，阿糖胞苷不能有效去除肿瘤千细胞，而异甘 草素去除肿瘤干细胞的药效显著比阿糖胞苷强(表6)。
表6异甘草素和阿糖胞苷抑制急性髓系白血病:F细胞的集落下生成率
异甘草素 阿糖胞苷
病人 对照
5 (ag/ml10 (ig/ml5吗/ml 10 |ig/ml
1100%46%27%65%39%
2100%48%25%71%42%
3100%43%23%63%38%
4100%45%24%68%40% '
5100%50%28%65%36%
表注对照为没有药物处理的细胞，表中的数据为对照的细胞集落数为100%，药物处理
组的细胞集落百分比为=(处理细胞组集落数/对照细胞组集落数)xioo%。
1权利要求
1.异甘草素作为制备预防或治疗手术切除肿瘤原发灶后肿瘤复发和转移的药物的应用。
2. 根据权利要求1所述药物，其特征在于可用于临床使用的制剂包括采用常规或特殊制剂工 艺制备而成的口服或非口服途径方式给药的制剂，优选为口服给药制剂。
3. 根据权利要求1或2所述药物，其特征在于用于临床，人用剂量为I一IOOO mg/人/天， 优选为10—500 mg/人/天，最优选为50 — 100 mg/人/天。
4. 如权利要求1至3所述的应用，其特征在于用于制备预防或治疗乳腺癌术后复发和转移的 药物中的应用。
5. 如权利要求1至3所述的应用，其特征在于用于制备预防或治疗乳腺癌术后复发和转移的 药物中的应用。
6. 如权利要求1至3所还的应用，其特征在f用于制备预防或治疗肝癌术后复发和转移的药 物中的应用。
7. 如权利要求1至3所述的应用，其特征在于用于制备预防或治疗肺癌术后复发和转移的药 物中的应用。
8. 如权利要求1至3所述的应用，其特征在于用于制备预防或治疗结直肠癌术后复发和转移 的药物中的应用。
9. 如权利要求1至3所述的应用，其特征在于用于制备预防或治疗其它任何恶性肿瘤手术切 除原发灶后复发和转移的药物中的应用。
10. 如权利要求1至3所述的应用，其特征在于用于制备预防或治疗肿瘤干细胞的药物中的应用。
全文摘要
异甘草素作为预防或治疗恶性肿瘤术后转移和复发的药物的应用。本发明属医药技术领域。本发明公开了异甘草素作为预防或治疗恶性肿瘤术后转移和复发的药物的应用。已有研究表明，手术切除原发灶可促进肿瘤转移，目前对于切除原发灶后恶性肿瘤的复发和转移尚未有理想的治疗方法或药物。发明人经过试验，证明异甘草素对手术切除多种恶性肿瘤原发灶后的转移和复发均具有明显的抑制作用，根据这一作用，异甘草素可被应用于临床预防或治疗包括肺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等各种恶性肿瘤手术切除原发灶后的复发和转移，具有安全性高、价格低廉、患者依从性好等明显优势。异甘草素的这一作用可能与其对肿瘤干细胞自我更新和增殖能力的抑制有关。
文档编号A61K31/122GK101658513SQ20081007294
公开日2010年3月3日 申请日期2008年8月26日 优先权日2008年8月26日
发明者刘军花, 超 孙, 娟 张, 忌 李, 婷 王, 王振华, 王祥飞, 露 甘, 郑秋生, 雷 郭 申请人:石河子大学