专利名称：：一种产挥发油的滇重楼内生粘鞭霉及其抗菌活性的制作方法
技术领域：
：本发明涉及微生物
技术领域：
，涉及一种具抗菌活性内生真菌的应用，特别是涉及一种其代谢产物为挥发油的微生物一滇重楼内生粘鞭霉。技术背景植物内生真菌(plantendophyticfungi)是指那些在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部，宿主植物不表现外在病害症状的真菌。植物内生真菌是一种新的微生物资源，能产生生物碱类、肽类、甾体类、萜类、酚类、醌类、脂肪族类、异香豆素类等多种结构类型的代谢产物，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗虫、调节植物生长等多种生物活性。由于植物内生真菌能产生结构新颖、功能独特的代谢产物而成为新化合物、新药物的潜在资源，它们在农业、医药、工业、食品等领域具有重要的应用前景。近年来发现一些植物内生真菌能产生易挥发的成分(volatilecomponents),这些易挥发成分具有抗菌和杀虫活性，能作为熏蒸剂应用于仓储和果蔬种植园的病虫害防治。f真重楼(尸an'sj3o(yp/y/Z,avar.;ywj"a"e"w'sHand.-Mazz.)在分类上属于单子叶纟H(Monocotyledoneae)百合目(Liliales)延龄草科(Trilliaceae)重楼属，是我国特有的一种珍稀药用植物，又叫七叶一枝花、独角莲，主要分布在云南、四川、贵州等省区，是著名的"云南白药"、"宫血宁"、"季胜德蛇药片"、"热毒清"等中成药的主要原料。滇重楼是一种多年生草本植物，其根状茎多年生长在地下，对土传病原菌具有强的抵抗能力，这很可能与其共生的内生菌有关，这些内生真菌能够产生抗菌活性物质来协助滇重楼抵抗病原物的侵袭，促进其健康生长。目前尚未见从滇重楼内生真菌中提取挥发性成分的报道。本发明着重于内生真菌挥发油的提取、化学组成分析和抗菌活性的研究，为探讨内生真菌的生理生态功能(如提高宿主的抗病性等)和新型杀菌剂的开发提供依据。本发明的目的是提供一种经发酵培养能产生挥发油的微生物，即滇重楼内生粘鞭霉。
发明内容—本发明涉及一种粘鞭霉(G//owW/;csp.),菌株代号为Ppf8,现保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2008年4月29日，登记入册编号为2474。本发明涉及粘鞭霉的分离和分类鉴定、挥发油的制备方法和组成分析，以及挥发油对病原真菌和细菌的抑制活性，提供如下的技术方法。1、内生粘鞭霉Ppf8的分离采集新鲜的滇重楼根状茎，采用内生真菌的分离和纯化技术，获得一株内生真菌，编号为Ppf8。2、内生粘鞭霉Pp仿的形态特征()无性世代内生真菌PpfS菌株在PDA培养基上25。C培养，初期菌落边缘花瓣状，灰绿色，后期菌丝长绒毛状稍直立，中间凸起，菌丝无色至暗色，分生孢子梗细长，分隔，分枝或不分枝，分生抱子在分生孢子梗末端由粘液聚成头状，分生孢子暗色，单胞，孢子卵圆形，直径为2.4nm3.3nm。内生真菌Ppf8的形态特征(见图l、图2、图3和图4)符合粘鞭霉属(G//owoy"x)真菌的形态特征。(2)有性世代未发现。3、内生粘鞭霉Ppf8的分子生物学特征运用PCR技术，扩增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。将Ppf8菌株的ITS序列提交到GenBank核酸序列库中注册获得序列号(accessionnumber)EF495243。同时将Ppf8菌株的ITS序列与GenBank中其他真菌的ITS序列进行比对，找出相似性最高，亲缘关系最近的真菌，Ppf8菌株的ITS序列与墙粘鞭霉(G/!'owa幼'xvar./wwn^)EF029216的ITS序列相似度为99%,聚在一个分支上的可信度为100%。其同源性的系统发育树图见图5。4、内生粘鞭霉Pp仿的发酵培养特征培养基液体马铃薯-葡萄糖(PD)培养基。培养温度25±1°C。是否光照否。培养时间7天。摇床转速150rpm。培养特征培养第3天，菌液白色；培养第7天，菌液为淡灰色，菌丝白色。5、内生粘鞭霉Ppf8挥发袖的制备采用水蒸馏法制备内生粘鞭霉挥发油，得率为0.23%(g/g鲜重)6、内生粘鞭霉Ppf8挥发油的化学组成分析采用气相色谱-质谱(GC-MS)联用的方法，从内生粘鞭霉Ppf8挥发油中一共鉴定出40个化合物(表1)，占总含量的98.447%,其中含量较高的化学成分分别为棕榈酸(Palmiticacid,15.505%)、(￡>9-十八烯酸(C￡>9-Octadecenoicacid，11.5卯％)、6-戊基-5,6-二氢吡喃-2-酮(6-Pentyl-5，6-dihydropyran-2-one,9.729%)、(7Z,10Z)-7,10-十六碳二烯酸((7Z，10Z)-7,10-Hexadecadienoicacid,8.289%)、亚油酸乙酯(Ethyllinoleate,4.810%)、(7Z，10Z，132)-7,10,13-十六碳三烯酸((7Z，10Z,132)-7，10,13-Hexadecatrienoicacid,4.566%)、油酸乙酯(Ethyloleate，3.437%)、二十四烷(Tetracosane，3.263%)和二十五烷(Pentacosane,2.820%)。7、内生粘鞭霉Ppf8挥发油的对细菌生长的抑制作用采用多孔板-MTT显色法，测定内生粘鞭霉Ppf8挥发油对四种革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、根癌土壤杆菌、番茄细菌斑点病菌、黄瓜角斑病菌)和两种革兰氏阳性细菌(枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌)的抑制活性。PpfB挥发油对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、番茄细菌斑点病菌、黄瓜角斑病菌、枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌的最低抑制浓度(MIC)分别为0.40mg/mL、0.80mg/mL、0.20mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL和1.00mg/mL,而阳性对照硫酸链霉素对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、番茄细菌斑点病菌、黄瓜角斑病菌、枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌的最低抑制浓度(MIC)分别为0.080mg/mL、0.060mg/mL、0.040mg/mL、0.060mg/mL、0.10mg/mL禾卩0.125mg/mL。8、内生粘鞭霉Ppf8挥发油对稻瘟菌孢子萌发的抑制作用内生粘鞭霉Ppf8挥发油对稻瘟菌孢子萌发的半抑制浓度(IQo)为0.843mg/mL，阳性对照多菌灵对对稻瘟菌孢子萌发的半抑制浓度为0.00211mg/mL。图1:内生真菌Ppf8菌落正面。图2:内生真菌Ppf8菌落背面。图3:内生真菌Ppf8的分生孢子在分生孢子梗末端由粘液聚成头状。图4:内生真菌Ppf8的菌丝、分子孢子梗和分生孢子。图5:内生真菌Ppf8同源性的系统发育树图。图6:内生真菌Ppf8挥发油的气相色谱图。图7:正烷烃CsC40的气相色谱图。本发明的优点本发明首次明确了具有广谱抗菌活性的内生粘鞭霉Ppf8菌株的微生物学分类地位，同时发现该菌挥发油对大肠杆菌、根癌土壤杆菌、番茄细菌斑点病菌、黄瓜角斑病菌、枯草芽孢杆菌和溶血葡萄球菌的生长具有明显的抑制作用，对稻瘟菌孢子萌发具有明显的抑制作用。本发明的目的是利用植物内生真菌资源，以求获得天然抗菌活性成分，为真菌源农药的研究与开发，为探讨内生真菌的生理生态功能提供依据。为了更好地理解本发明，下面结合本发明的实施例进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容并不局限于此。具体实施方式实施例l:内生真菌Ppf8的分离采集新鲜的滇重楼根状茎，表面先用70%乙醇处理30s,然后用0.2%氯化汞处理20min以进行彻底的表面灭菌，无菌条件下去除表皮，将根状茎分成约0.5cmx0.5cmx0.5cm大小的块段，摆放在PDA培养基上，每皿1块，在25。C,光照条件下培养至第720天，从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到PDA培养基上进行纯化，连续纯化45次，至菌落形态一致。将纯化后的菌株在PDA斜面上保存，其中一株内生真菌的编号为Ppf8。实施例2:内生真菌Pp仿菌株的形态特征观察内生真菌Ppf8菌株在PDA培养基上25。C培养，初期菌落边缘花瓣状，灰绿色，后期菌丝长绒毛状稍直立，中间凸起，菌丝无色至暗色，分生孢子梗细长，分隔，分枝或不分枝，分生孢子在分生孢子梗末端由粘液聚成头状，分生孢子暗色，单胞，孢子卵圆形，直径为2.4nm3.3nm。内生真菌Ppf8的形态特征见图1图4。在培养条件下，未发现Ppf8的有性世代。实施例3:内生真菌Pp仿菌株ITS序列分析与分子鉴定首先将在平板上活化的Ppf8菌株的菌丝转移到PDA液体培养基中，悬浮培养5天后获得新鲜的菌丝，采用常规的分子生物学方法提取基因组DNA。运用PCR技术，DNA扩增采用ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。DNA测序所用的引物分别为ITS1和ITS4，采用ABIPRISM3730测序仪，分别进行正向(5'—3')和反向(3'—5')双向测序。反向序列经DNAMAN软件反向互补后与正向序列拼接形成5'—3'完整序列。把所得的ITSrDNA序列提交至!jGenBank数据库(NationalCenterforBiotechnologyInformationWebsite,http:〃www.ncbi.nlm,nih,gov),获得序列号(accessionnumber)EF495243。利用Blast工具进行序列比对，找出与该序列相似度最高的菌的序列信息。Ppf8菌株的ITS序列与墙粘鞭霉(G/i'07naW:x;nMron/mvar.w"rarww)EF029216的ITS序列相似度为99%,其同源性的系统发育树图见图5。根据Blast比对结果，从中抽取与所分离的内生真菌Ppf8菌株序列相^l性高的菌株的序列，采用ClustalX1.8软件进行序列对准，再用MEGA软件计算遗传距离，然后利用距离依靠法中的邻位tiMii(Neighbor-joining,NJ)构建进化树，计算Bootstrap值来评价系统发育树的可靠性。Ppf8同源性的系统发育树图见图5,Ppf8菌株与墙粘鞭霉(6//0/必故//"0/^加var.附w,'oraw)聚在一个分支上的可信度为100%。实施例4:内生真菌Pp仿菌株的发酵工艺本发明采用的是摇床发酵，500mL体积的三角瓶中盛马铃薯-葡萄糖(PD)培养基200mL,将预先培养好的Ppf8菌丝接种到已灭菌的培养基中，在25。C、150rpm下暗培养7天，得总发酵液10L,采用高速离心(离心力为8000g，离心时间10min)的方法将菌丝和菌液分开，得菌丝体186.0g，于-20。C保存备用。实施例5:内生真菌Ppf8挥发油的制备内生真菌Ppf8挥发油采用水蒸馏法制备。按实施例2中的发酵工艺获得新鲜菌丝体186.0g,进行水蒸馏，温度为100。C,连续蒸馏4h后收集挥发油，于4。C避光保存。在油水混合的流出液(6.0mL)中加入一定量的氯化钠(NaCl)(12.0mg)，用乙醚进行萃取(重复3次，每次10mL)，然后用无水硫酸钠(4.0g)干燥后浓縮萃取液(让乙醚自然挥发)，获得的纯挥发油于4。C密封避光保存。计算得油率(g/g鲜重)得油率(％)=纯化挥发油的质量(g)_xl00得/H丰t/"新鲜菌丝体的质量(g)实施例6:内生真菌Ppffi挥发油的化学组成分析GC条件色谱柱为安捷伦公司(Agilent)HP-5石英毛细管柱[30mx0.25mmx0.25)am(5%苯基)-甲基聚硅氧烷]。进样口温度250。C，传输线温度240。C。程序升温如下起始柱温5(TC,停留1.50min;以10。C/min升至180。C,停留2min;然后以6。C/min升至280。C,停留10min。载气为高纯氦(99.999。/o);柱流量lmL/min。用实施例3所述的方法制备内生真菌Ppf8挥发油，挥发油进样量每次为1.0pL(分流比1:20)。内生真菌Pp仿挥发油的气相色谱图见图6。GC-MS分析釆用Agilent6890GC-5973MSD气质联用仪完成。GC条件如上所述。MS条件如下离子源温度28(TC;电离方式EI,电离能量70eV;质量扫描范围m/z:50500。保留系数(Retentionindices,RI)的测定-系列正垸烃C8Cw(Sigma)用氯仿稀释50倍，然后与上述GC条件一样进样分离，记录CsQo各正烷烃保留时间。用线性升温公式计算各成分的RI值RI=100"+100(lg&-lg,)/(lg^+1-lg/),其中^、^和";分别为被分析的组分和碳原子数处于n和n+l之间的正烷烃(/义々+1)的流出峰保留时间(min)。正烷烃C8C卯的气相色谱图见图7。数据库的检索各组分峰相对含量(Relativeamounts,RA)的确定采用峰面积归一化法。各组分峰用MSTLibrary(2002版)质it1^检索，PItt与相关文献Rl傻进行比较，最后以质谱MSgS和RTfiE配度最高的化学结构为最佳鉴定结果；无RI值匹配性的以质谱匹配度最高的化学结构为鉴定结果。GC-MS分析结果见表1。从内生真菌Pp仿挥发油中一共鉴定出了40个化合物，占总含量的98.447%,其中含量较高的化学成分分别为棕榈酸(Palmiticacid，15.505%)、(￡)-9-十八烯酸(C￡)-9-Octadecenoicacid，11.590%)、6-戊基-5,6-二氢卩比喃-2-酮(6-Pentyl-5，6-dihydropyran-2-one，9.729%)、(7Z,10Z)-7,10-十六碳二烯酸((7Z,10Z)-7，10-Hexadecadienoicacid,8.289。/。)、亚油酸乙酯(Ethyllinoleate，4.810%)、(72，10Z,13Z)-7,10，13-十六碳三烯酸((7Z,10Z,132)-7，10，13-Hexadecatrienoicacid,4.566%)、油酸乙酯(Ethyloleate，3.437%)、二十四垸(Tetracosane,3.263%)和二十五烷(Pentacosane,2.820%)。表l内生真菌Ppf8挥发油的化学成分GC-MS分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>实施例7:内生真菌Pp仿挥发油的抗细菌活性(1)活性测定的细菌菌株枯草芽孢杆菌(5ac///iATCC11562)(革兰氏阳性)；溶血葡萄球菌(5top/7_y/ococcw/iaeOTo/_K//cwATCC29970)(革兰氏阳性)；黄瓜角斑病菌(heMtfowo"as/ac/joroimsATCC11921)(革兰氏阴性)；根癌土壤杆菌C4gro6acto7'WKftwje/ac/e"sATCC11158)(革兰氏阴性)；大肠杆菌(&cAmV;A/aco//ATCC25922)(革兰氏阴性)；番茄细菌斑点病菌Obw/Aowcwasv"/ca/onaATCC11633)(革兰氏阴性)。(2)培养基采用LB琼脂培养基(酵母浸膏5g/L,蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L,琼脂20g/L,pH7.0)和LB液体培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L,氯化钠5g/L,pH7.0)。(3)内生真菌Ppf8挥发油溶液的配制称取Ppf8挥发油40.0mg到Eppendorf管中，加入0.3mL的丙酮(100%),再加入0.7mL无菌水，振荡溶解，得到40.0mg/mL的PpfB挥发油母液。然后将挥发油母液配制成系列浓度为20.0mg/mL、17.5mg/mL、15.0mg/mL、2.5mg/mL、10.0mg/mL、8.0mg/mL、6.0mg/mL、4.0mg/mL、2.0mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL，溶剂为30%丙酮的溶液。阳性对照选用硫酸链霉素(Amresco)，称取硫酸链霉素4.0mg到Eppendorf管中，向其中加入1.0mL无菌水，振荡溶解，得到4.0mg/mL的硫酸链霉素母液。然后将硫酸链霉素母液配制成系列浓度为2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.25mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.01mg/mL的溶液。(4)抗菌活性测定抗细菌活性测定采用多孔板-MTT显色法测定其最低抑制浓度(Minimalinhibitoryconcentration,MIC),结果见表2。具体操作步骤如下在洁净无菌的96孔培养板中加入浓度为106cfu/mL的供试菌液90nL，不同浓度梯度的挥发油10这样得到Ppf8挥发油的检测终浓度为2.0mg/mL、1.75mg/mL、1.5mg/mL、1.25mg/mL、1.0mg/mL、0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL，溶剂终浓度为3.0%丙酮的溶液。而阳性对照硫酸链霉素的检测终浓度为0.2mg/mL、(Li5mg/mL、(U25mg/mL、0」0mg/mL、(L0—8mgZmL、(L06_mg/mL—、0.04mg/mL、0.02mg/mL、0.01mg/mL、0.005mg/mL、0.001mg/mL。同时设空白对照和溶剂对照(3.0%丙酮)，每个处理3个重复。将％孔板于37。C下培养24h后每孔中加入MTT(0.5mg/mU溶液10^L，继续培养4h后，加入10%DMSO100nL终止反应，振荡30min，以助其溶解。肉眼即可观察判断Ppf8挥发油的MIC值为了进一步验证MIC值，从多孔板每个孔中吸取10nL培养液涂布到LB平板上，在37。C下培养24h后观察统计平板菌落数即可。表2内生真菌PpfB挥发油的抗细菌活性_<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>实施例8:内生真菌Pp仿菌株挥发油对稻瘟菌孢子萌发的抑制作用(1)培养基采用燕麦西红柿培养基(Oat-tomatoagarmedium,OTA)。配制1L的燕麦西红柿培养基的步骤为将完全成熟的西红柿切碎，用搾汁机榨汁，汁液用四层纱布过滤，取已过滤的汁液150mL待用。同时，称取燕麦片30g,加入1000mL去离子水，煮沸30min，注意边煮边搅拌。煮好的燕麦片用两层纱布过滤。收集滤液，然后往滤液中加入已准备好的番茄汁150mL和20g琼脂，加热融化，趁热用纱布过滤，然后加去离子水定容至1000mL。分装后121。C湿热灭菌20min。该培养基用于稻瘟菌的培养。(2)供试的植物病原真菌稻瘟菌(Afegw/7oW力ewy2ae)。(3)稻瘟菌活化培养用灭菌的接种针从保存菌种的试管中挑取少量菌丝，接种到燕麦番茄汁i咅养基平板上，用封口膜封好，25。C下培养。(4)稻瘟菌继代培养倒燕麦番茄汁培养基平板，每皿倒约40mL。用移液枪在稻瘟菌菌落中央滴加无菌水lmL,然后用灭菌后的接种针轻轻擦洗菌落表面，注意用力要轻，以免擦破培养基表面。待无菌水变浑浊后，再用移液枪吸取100滴加到倒好的燕麦番茄汁培养基平板表面，然后用玻璃涂棒将其涂散均匀。待培养基表面干燥后，盖好倒置25。C下培养。(5)机械刺辯诱导产孢接种活化的稻瘟菌室温下培养48h后，在其表面滴加无菌水约3mL,然后用灭菌后的棉签轻轻擦洗菌丝，将菌丝机械擦断，连续擦洗两次，待灰色菌落变为黑色后即可，将表面的水倒掉，然后倒扣于灭菌后的吸水纸上，晾干水分，用三层灭菌后的纱布将皿口封住，置于干燥有光的条件下培养48h即可得到稻瘟菌孢子。(6)配制Ppf8挥发油溶液:称取Ppf8挥发油20.0mg到Eppendorf管中，加入0.3mL的丙酮(100%)，再加入0.7mL无菌水，振荡溶解，得到20.0mg/mL的Ppf8挥发油母液。然后将Ppf8挥发油母液配讳tl成系列浓度为4.0mg/mL、3.5mg/mL、3.0mg/mL、2.5mg/mL、2.0mg/mL、1.5mg/mL、1.0mg/mL、0.5mg/mL、0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL，稀释用的溶剂为30%丙酮溶液。阳性对照采用多菌灵(Aldrich),称取多菌灵1.0mg到Eppendorf管中，向其中加入30%的丙酮溶液1.0mL，振荡溶解，得到1.0mg./mL的多菌灵母液。然后将多菌灵母液配制成系列浓度为0.03mg/mL、0.02mg/mL、0.016mg/mL、0.010mg/mL、0.004mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL,溶剂为30%丙酮的溶液。(7)配制孢子悬浮液在机械诱导产孢好的平板上滴加无菌水3.0mL，然后用无菌棉签轻轻擦洗菌落表面，洗下孢子，将孢子洗液装到1.0mL的离心管中，离心3次(离心力8000g,每次离心10min)。然后配制孢子悬液，利用血球记数板测定孢子浓度，将孢子浓度配制为2xl()S个/mL。(8)进行活性测定准备洁净培养皿，然后在每个培养皿中放上四层吸水纸，进行灭菌。灭菌后，往每皿中加无菌水5.0mL,在吸水纸上平行放置两根无菌牙签。另准备好凹玻片，用75。/。的乙醇浸泡24h，然后晾干。在每个凹洞上滴加25nL配制好的稻瘟菌孢子悬浮液(2xl06个/mL)和25pL系列浓度梯度的Pp仿挥发油溶液(滴加前应在振荡器上充分震荡，以保证孢子悬浮液和药剂溶液充分混匀)，这样得到Ppf8挥发油的检测终浓度为2.0mg/mL、1.75mg/mL、1.5mg/mL、1.25mg/mL、1.0mg/mL、0.75mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.10mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL。而阳性对照的检测终浓度为0.015mg/mL、0.01mg/mL、0.008mg/mL、0.005mg/mL、0.002mg/mL、0.001mg/mL、0.0005mg/mL。同时设空白对照和溶剂对照(15%丙酮)，每个处理3个重复。然后将凹玻片放在培养皿中的牙签上，室温下培养7h后进行观察。(9)观察记录实验结果和孢子萌发率的计算在显微镜10x10(目镜x物镜)倍下观测每一凹玻片上的孢子萌发情况，选择3个不同的视野，每个视野中100个以上孢子，共数300个孢子，用计数器记下萌发的孢子数，将3个重复合到一块计算孢子萌发率(％)。溶剂对照萌发率-处理萌发率孢子萌发抑制率(％)=_xi00溶剂对照萌发率(10)数据处理和半抑制浓度的计算试验结果采用MicrosoftExcel软件进行数据整理，在分析中，供试样品浓度取对数(力，抑制率换算成生物统计几率值(r),求得毒力回归方程(r=aZ+b),从而可以求得半抑制浓度(IC5())。实验设空白对照和溶剂对照(15%丙酮，v/v),每个处理两个重复。Ppf8挥发油对稻瘟菌孢子萌发的线性回归方程7=3.3863义+5.2518(相关系数R=0.9691);IC50=0.843mg/mL。阳性对照多菌灵对稻瘟菌孢子萌发的线性回归方程y=1.6113X+9.3123(相关系数/=0.9813);IC50=0.00211mg/mL。权利要求1.一株产挥发油的滇重楼内生真菌，其特征是命名为粘鞭霉(Gliomastixsp.)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNo.2474。2、一种按权利要求1所述的内生真菌的分离方法，通过严格的表面消毒，从植物内部分离出来的，并通过形态和分子鉴定，将ITSrDNA序列提交到GenBank数据库，获得序列号EF495243。3、一种从权利要求1所述的内生真菌中获得的挥发油，该挥发油具有抗菌活性。4、一种制备权利要求3中的内生真菌挥发油的方法将新鲜菌丝放入水蒸馏装置中，进行水蒸馏，收集挥发油。在油水混合的流出液中加入一定量的氯化钠，用乙醚进行萃取，然后用无水硫酸钠千燥后浓縮萃取液，获得挥发油。5、权利要求3中的挥发油用于制备抗细菌的药物，所属的细菌包括枯草芽孢杆菌、溶血葡萄球菌、黄瓜角斑病菌、根癌土壤杆菌、大肠杆菌和番茄细菌斑点病菌。6、权利要求3中的挥发油用于制备抗真菌的药物，所属的真菌包括稻瘟病菌。全文摘要本发明涉及一种产挥发油的滇重楼内生粘鞭霉。本发明所述的内生真菌Ppf8是从滇重楼中采用内生真菌分离技术分离获得的，经微生物分类鉴定为粘鞭霉(Gliomastixsp.)，该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNo.2474。本发明首次从滇重楼中分离出产挥发油的内生粘鞭霉，并明确了挥发油的化学组成和抗菌活性。目的是利用植物内生真菌资源，获得天然活性成分。文档编号A61P31/10GK101270338SQ200810112069公开日2008年9月24日申请日期2008年5月21日优先权日2008年5月21日发明者周立刚,迎张,王敬国,王明安,赵江林,马占鸿,黄永富申请人:中国农业大学