专利名称：一种可诱导癌细胞凋亡的载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可诱导癌细胞凋亡的载体及其应用。
背景技术：
caspase-3是参与细胞凋亡信号通路中众多半胱天冬酶的一种，正常情况下 caspase-3以无活性酶原的形式存在于细胞浆中。当细胞在一系列内源性基因的调 控下要发生凋亡时，处于细胞凋亡信号通路上游起始凋亡的半胱天冬酶便被激活， 而caspase-3正是被这些上游的caspases激活，生成活化的caspase-3 p17和p12 亚基，两种亚基再组装成活性形式的ca印ase-3，发挥其执行凋亡的功能。所以 caspase-3通常被认为是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。
目前，虽然双启动子载体可用于两个基因的协同表达,但是两个基因往往会转 录干扰和/或不同水平的表达，有时报告基因表达了但插入的目的基因不一定表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组表达载体，该载体可同时表达两个蛋白，这两个 蛋白可形成活性形式的caspase-3，进而激活细胞凋亡信号通路，促进肿瘤细胞凋 亡。
本发明提供了转录融合双基因片段K，自上游至下游依次为caspase-3 P17亚 基基因序列、IRES序列和caspase-3 P12亚基基因序列。
所述caspase-3 P17亚基基因序列是如下1)或2)或3)的DNA分子
1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
3) 与序列表中序列1限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
所述IRES序列是如下4)或5)或6)的DNA分子
4) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；
5) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
6) 与序列表中序列3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。所述caspase-3 P12亚基基因序列是如下7)或8)或9)的DNA分子
7) 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
8) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；
9) 与序列表中序列2限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
上述严格条件可为在6XSSC， 0.5。/。SDS的溶液中，在65。C下杂交，然后用2X SSC， 0. 1% SDS和1 XSSC， 0. 1% SDS各洗膜一次。
含有上述任一所述基因片段K的表达盒或重组表达载体均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为真核表达载体。
所述载体中还可包含PBR322复制起点和/或氨苄青霉素抗性基因。 所述重组表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建，如可按照如下方法构 建PCRC:
所述PCRC是将IRES序列插入质粒PC1的caspase-3 P17亚基基因序列和 caspase-3 P12亚基基因序列间得到的；
所述质粒PC1是将pcDNA3. 1 (-)的Jfel和^adH位点间的小片段取代为 caspase-3 P17和caspase-3 P12亚基基因序列得到的。
含有上述任一所述基因片段K的细胞系或重组菌也都属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体、表达盒、细胞系和重组菌均可应用于制备诱导癌细胞凋亡 的药物或抗癌药物。
本发明通过IRES将caspase-3 P17亚基基因和caspase-3 P12亚基基因融合 形成转录融合双基因，将该转录融合双基因插入真核表达载体得到的重组表达载体 可以在转染细胞中高效地表达活性形式的caspase-3，从而激活细胞凋亡信号通路， 促进细胞凋亡。将本发明的重组表达载体转入癌细胞，可以有效地诱导肿瘤细胞的 凋亡，为基因治疗提供新的手段。本发明的重组表达载体可以用于制备诱导癌细胞 凋亡的药物或抗癌药物。本发明将在生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作 用，应用前景广阔。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为针对PARP的western blot图
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W. ， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001， NY， Cold Spring Harbor)。所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
实施例l、载体PCRC的构建
一、 caspase-3全基因序列的克隆
根据文献调研，人慢性粒细胞白血病细胞株K562中caspase-3表达量远高于 其他癌细胞。根据GeneBank中公布的caspase-3全基因序列以及它的上下游序列， 设计一对PCR引物PI和P2。以K562细胞的cDNA为模板克隆caspase-3。
PI: 5， -ACCTGTGGCTGTGTATCCG-3，；
P2: 5， -ATGCCCACAGATGCCTAAG-3，。
PCR反应体系为19uLddH20， 5ixLDMS0， 10u L 5XPrimerstar buffer (含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5wLPl (4um/uL) ， 5 n L P2 (4 u m/u L) ， 2 u L K562 cDNA (Ing/tiU ， 0. 5tiL Primerstar。
PCR反应条件为98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 l分20秒，共40个循环。
反应产物记做C1，对(]1进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，获得了 1400bp的DNA片段，与预期结果相符。
根据CI的序列设计一对PCR引物P3和P4。以CI为模板进行PCR。
P3: 5' -AACGGATCCATGGAGAACACTGAAAACTCAG-3，；
P4: 5' - GTCGAATTCTTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTG-3，。
PCR反应体系为:20uLddH20， 5uLDMS0， 10u L 5XPrimerstar buffer(含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5 u L P3 (4 y m/u L) ， 5 u L P4 (4 y m/y L) ， luLCl， 0.5 u L Primerstar。
PCR反应条件为98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 50秒，共35个循环。
反应产物记做C2，对C2进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，获得了 800bp 的DNA片段，C2即为caspase-3的全基因序列。
二、 ca印ase-3 P17亚基和P12亚基的克隆 1、 caspase-3 P17亚基的克隆
设计一对引物P5和P6，并在序列两端分别添加限制性内切酶JZ^I和尸"I识别位点。P5中带下划线碱基为限制性内切酶Ztel识别位点，P6中带下划线碱基为 限制性内切酶尸WI识别位点。以C2为模板进行PCR。
P5: 5' - GAATCTAGAGCCACCATGTCAGGCTCTGGAATATCCCTGGACAAC-3，;
P6: 5， - CCTCTGCAGTTAGTCTGTCTCAATGCCACAGTCC-3，。
PCR反应体系为:20uLddH20， 5uLDMS0， 10 u L 5XPrimerstar buffer (含 Mg2+)， 4 u L dNTPs (2. 5mM) ， 5 u L P5 (4 u m/u L) ， 5 u L P6 (4 u m/u L) ， luLC2， 0.5 u L Primerstar。
PCR反应条件为98°C、 10秒，59°C、 10秒，72°C、 30秒，共30个循环。
所得反应产物即为P17，对其进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，获得 了 453bp的DNA片段。将得到的DNA片段进行测序，结果表明，该基因片段含有P17 亚基基因序列，P17亚基基因序列如序列表中的序列1所示，自序列1的5'末端 第1位脱氧核苷酸到第453位脱氧核苷酸为P17亚基基因序列。
按照TIANGEN公司提供的DNA产物纯化试剂盒说明书纯化获得的DNA片段，将 纯化所得的产物用限制性内切酶i^al和尸"I (均购自TaKaRa)进行双酶切，酶切 反应体系为5.4uLddH20， 20 u L (90ng/ix L) P17， 3 n L 10XM buffer, 0,8ixL Z力al， 0. 8 ix L尸WI。 37。C反应3小时后，用DNA产物纯化试剂盒回收经和尸"I 酶切的P17亚基片段。
将回收产物纯化、定量，记做M1， Ml浓度为50ng/yL。
2、 caspase-3 P12亚基的克隆
设计一对引物P7和P8，并在序列两端分别添加限制性内切酶和Sa/rfH
识别位点。P7中带下划线碱基为限制性内切酶尸WI识别位点，P8中带下划线碱基
为限制性内切酶53/dn识别位点。以C2为模板进行PCR。
P7: 5' -CGTCTGCAGGCCACCATGTCAGGCAGTGGTGTTGATGATGACATGG-3，;
P8: 5， - GTCGGATCCTTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTTTGTG-3，。
PCR反应体系为20iiLddH20， 5uLDMS0， 10 n L 5XPrimerstar buffer (含
Mg2+), 4 ii L dNTPs (2. 5mM) ， 5 n L P7 (4 u m/u L) ， 5 u L P8 (4 u m/y L) ， luLC2，
0. 5" Primerstar。
PCR反应条件为98°C、 10秒，63°C、 10秒，72°C、 25秒，共30个循环。 所得反应产物即为P12，对其进行了 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果获得了
318bp的DNA片段。将得到的DNA片段进行测序，结果表明，该基因片段含有P12亚基基因序列，P12亚基基因序列如序列表中的序列2所示，自序列2的5'末端第l 位脱氧核苷酸到第318位脱氧核苷酸为P12亚基基因序列。
按照TIANGEN公司提供的DNA产物纯化试剂盒说明书纯化获得的DNA片段，将 纯化所得的产物用限制性内切酶尸^I和5a/rfil (均购自TaKaRa)进行双酶切，酶 切反应体系为45uL (40ng/uL) P12， 5. 2 u L 10XK buffer, 0.8uL尸Wl， 0.8 u L ^s/rfH。 37。C反应3小时后，用DNA产物纯化试剂盒回收经户"I和酶切 的P12亚基片段。
将回收产物纯化、定量，记做M2， M2浓度为40ng/yL。
三、 IRES序列的克隆
设计一对引物P9和PIO，并在序列两端都添加了限制性内切酶尸WI识别位点， P9和P10中，带下划线的为尸WI酶切位点。以pEGFP-IRES2质粒(购自BD bioscience 公司)为模板进行PCR。
P9: 5， -CCTCTGCAGGCCCCTCTCCCTCCCCC-3 ，;
P10: 5' - GCTCTGCAGTGTGGCCATATTATCATCGTGTTTTTC-3，。
PCR反应体系为:15uLddH20， 5uLDMS0， 10 u L 5XPrimerstar buffer (含 Mg2+)， 4u L d證s(2. 5raM) ， 5 u L P9 (4u m/u L) ， 5 u L P10(4u m/u U ， 5uL质 粒(lng/uO ， 0. 5uL Primerstar。
PCR反应条件为98°C、 10秒，64°C、 10秒，72°C、 35秒，共40个循环。
所得反应产物即为IRES,对其进行了 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。结果获得了 585bp的DNA片段。将得到的DNA片段进行测序，结果表明，该基因片段含有IRES 序列，IRES序列如序列表中的序列3所示，自序列3的5'末端第l位脱氧核苷酸 到第585位脱氧核苷酸为IRES序列。
按照TIANGEN公司提供的DNA产物纯化试剂盒说明书纯化获得的DNA片段，将 纯化所得的产物用限制性内切酶尸WI(购自TaKaRa)进行单酶切，酶切反应体系为 30uL IRES (70ng/uL) ， 4uL 10XH buffer, 4uL ddH20， 2uL尸stl。 37。C反 应3小时后，用DNA产物纯化试剂盒回收经尸WI单酶切后的IRES片段。
将回收产物纯化、定量，记做E1， El的浓度为70ng/uL。
四、 重组表达载体的获得
1、第一次连接反应(连接M1和M2) 1)酶切反应以pcDNA3. 1 (-)为出发载体，用J&I和5a/dn进行双酶切。 酶切反应体系5iiLpcDNA3.1 (-) (lyg/uL) ， 1 u L 10 XK buffer, 1 u L ifel， 1 u L Aa/dH， 0. 5 u L牛肠碱性磷酸酶(CIAP)。 37°C、 3-5h，产物记作P1并纯化、定量。 2)连接反应
连接反应体系为2uLPl (70ng/uL) ， luLMl (50ng/nL)， luLM2(40ng/ uL)， 6uL ddH20。 60°C、 2分钟，4。C保存。然后再加入6uL ddH20， 2uL 10X T4 ligase buffer, 1 P L T4 ligase (TaKaRa) ， 1 u L ATP (50mM) 。 16。C反应5 个小时。
反应结束后，用该连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化细胞涂布 于含有50mg/ml的氨苄青霉素的LB平板上，倒置培养12-24小时后，挑取长出的 单菌落接种于3ml含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37。C摇床中过夜 培养。待培养结束后，取出其中2ml进行质粒少量提取，然后用和^ayrfn进 行初步酶切鉴定，能切出760bp条带的为阳性克隆。将得到的阳性克隆质粒命名为 PC1。
2、第二次连接反应(连接E1)
1) 酶切反应
酶切反应体系为5uLPCl (lug/uU ， 2uL 10XH buffer, 12iiLddH20， lyL尸WI， 0. 5uL牛肠碱性磷酸酶(CIAP)。
在37"C下反应3小时后，用DNA产物纯化试剂盒回收经尸"I单酶切后的PC1 质粒。将回收产物纯化、定量，记做PC2， PC2的浓度为70ng/uL。
2) 连接反应
连接反应体系为2uL PC2 (70ng/uL) ， 2uL El(50ng/uL)， 6uL ddH20。 60°C、 2分钟，4。C保存。然后再加入6uL ddH20， 2y L 10XT4 ligase buffer, 1 uL T4 ligase (TaKaRa) ， 1 y L ATP (50mM) 。 16。C反应5个小时。
反应结束后，用该连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化细胞涂布 于含有50mg/ml的氨苄青霉素的LB平板上，倒置培养12-24小时后，挑取长出的 单菌落接种于3ml含50mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37。C摇床中过夜 培养。待培养结束后，取出其中2ml进行质粒少量提取，然后用历V2dlI进行酶切 鉴定，能切出500bp左右条带的为阳性克隆。因为El两端都引入了尸WI的酶切位点，所以连接的时候，有正向连接和反向连接两种可能。根据IRES序列和caspase-3 小亚基序列上的HindIII酶切位点，IRES若正向插入后，历'"aail可以切出500bp 左右的带。
将酶切鉴定正确的阳性重组菌的菌液接种入200ml LB液体培养基中培养12小 时。培养结束后，取lml菌液送上海Invirogen公司进行测序，测序结果表明获得 了正确的基因序列，将上述质粒命名为PCRC。
实施例2、载体PCRC的抗肿瘤生物活性检测
1、 转染
以5X105细胞密度在6孔板上铺人鼻咽癌细胞CNE-2， 24小时后进行转染，方 法为在lipotamine2000 (Invitrogen)介导下，将PCRC质粒转染CNE-2细胞， 同时用pCDNA3. 1空质粒转染CNE-2细胞作为对照。转染36小时之后，收集6孔板 中的细胞，釆用RIPA蛋白裂解液提取细胞中的总蛋白。考马斯亮蓝定量法测定蛋 白的浓度。用4X上样缓冲液按1: 3的体积混合蛋白，IO(TC沸水浴加热10min， -20。C保存以备后续western blot实验。
RIPA蛋白裂解液的配方为50mM Tris-base, 1. OmM EDTA， 150mMNaCl， 0.1% SDS， 1% TritonX-100， 1% Sodium deoxycholate (去氧胆酸钠)，IraM PMSF (苯 甲基磺酰氟)(现加)。
2、 Western blot检测PCRC质粒对聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)的影响
PARP作为caspase-3的主要剪切对象，被称为caspase-3的死亡底物，因而 PARP被剪切是caspase-3激活的一个重要标志，也是细胞凋亡的一个重要指标。
Western blot试验中所用的一抗为抗PARP抗体(购自碧云天生物技术研究所)， 二抗为山羊抗兔抗体(购自碧云天生物技术研究所)。
Western blot实验结果如图1所示。图1中，1为转染PCRC质粒的细胞；2 为转染空质粒的细胞。结果表明，PCRC质粒能够表达出活性形式的caspase-3，促 进肿瘤细胞的凋亡。序列表
<110〉清华大学深圳研究生院
<120> —种可诱导癌细胞凋亡的载体及其应用
<130> CGGNARY81299
<160> 3
<210〉 1
<211〉 453
<212> DNA
<213〉 人属人(/fo/Z7d 5V3/3imS)
<400〉 1
atgtcaggct ctggaatatc cctggacaac agttataaaa tggattatcc tgagatgggt 60
ttatgtataa taattaataa taagaatttt cataaaagca ctggaatgac atctcggtct 120
ggtacagatg tcgatgcagc aaacctcagg gaaacattca gaaacttgaa atatgaagtc 180
aggaataaaa atgatcttac acgtgaagaa attgtggaat tgatgcgtga tgtttctaaa 240
gaagatcaca gcaaaaggag cagttttgtt tgtgtgcttc tgagccatgg tgaagaagga 300
ataatttttg gaacaaatgg acctgttgac ctgaaaaaaa taacaaactt tttcagaggg 360
gatcgttgta gaagtctaac tggaaaaccc aaacttttca ttattcaggc ctgccgtggt 420
ax:aga^ctgg sctgtggcat tgaigacsggic tsai 453
<210> 2
<211〉 318
<212> DNA
〈213〉 人属人(7%M70 5^J'e/LS)
<400> 2
11atgtcaggcagtggtgttgatga^gacatggCgtgtC3t3aaataccagtggsggccgac60
ttcttgtatgcatactccacagcacctggttattattcttggcgaaattcaaaggatggc120
tcctggttcatccagtcgctttgtgccatgctgaa^cagtatgccgacaagcttgaattt180
atgcacattcttacccgggtgtggC犯C3gaatttgagtccttttccttt240
gacgctacttttcatgcaaag犯gicagattccatgtattgtttccatgct300
ctctattttt318
〈210〉 3
〈211〉 585
<212> DNA
〈213〉人工序列
<400> 3
gcccctctccctcccccccccctaacgttactggccga^gccgcttggaat卿gccggt60
gtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggccc120
gg腿cctggccctgtcttcttgacgagca^ttcctaggggtctttcccctctcgccaaag180
gaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagac240
aaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcc300
tctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgcc360
acgttgtgagttggatagttgtggaa卿gtxaaatggctctcctcaagcgtattcaaca420
3"ggggctga3ggatgcccag肌ggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggt■
acacatgctttacatgtgttt^gtcgaggttaaaaaaacgtctaggccccccgaaccacg540
gggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataMa^tggCC3C358权利要求
1、一种转录融合双基因片段K，自上游至下游依次为caspase-3P17亚基基因序列、IRES序列和caspase-3P12亚基基因序列。
2、 如权利要求1所述的基因片段K，其特征在于所述caspase-3P17亚基基因 序列是如下l)或2)或3)的DNA分子1) 其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；2) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；3) 与序列表中序列l限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
3、 如权利要求1或2所述的基因片段K，其特征在于所述IRES序列是如下4) 或5)或6)的DNA分子4) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；5) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；6) 与序列表中序列3限定的DNA序列具有90。/。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
4、 如权利要求3所述的基因片段K，其特征在于所述caspase-3 P12亚基基因 序列是如下7)或8)或9)的DNA分子7) 其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；8) 在严格条件下与l)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；9) 与序列表中序列2限定的DNA序列具有90y。以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。
5、 含有权利要求1至4中任一所述基因片段K的表达盒或重组表达载体。
6、 如权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为真核 表达载体。
7、 如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述载体中包含有PBR322 复制起点和/或氨苄青霉素抗性基因。
8、 如权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体是PCRC; 所述PCRC是将IRES序列插入质粒PC1的caspase-3 P17亚基基因序列和caspase-3 P12亚基基因序列间得到的；所述质粒PC1是将pcDNA3. 1 (-)的i7^1和^a/dll位点间的小片段取代为 caspase-3 P17和caspase-3 P12亚基基因序列得到的。
9、 含有权利要求1至4中任一所述基因片段K的细胞系或重组菌。
10、 权利要求1至4中任一所述基因片段K、权利要求5至8中任一所述重组表 达载体或表达盒、权利要求9所述细胞系或重组菌在制备诱导癌细胞凋亡药物或抗癌 药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种可诱导癌细胞凋亡的载体及其应用。本发明通过IRES将caspase-3P17亚基基因和caspase-3P12亚基基因融合形成转录融合双基因，将该转录融合双基因插入真核表达载体得到的重组表达载体可以在转染细胞中高效地表达活性形式的caspase-3，从而激活细胞凋亡信号通路，促进细胞凋亡。将本发明的重组表达载体转入癌细胞，可以有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，为基因治疗提供新的手段。本发明的重组表达载体可以用于制备诱导癌细胞凋亡的药物或抗癌药物。本发明将生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A61K48/00GK101580845SQ20081011162
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者刘华臣, 董爱君, 蒋宇扬, 谢振华 申请人:清华大学深圳研究生院