专利名称：一种具有促缺血心肌血管生成作用的中药组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗心血管疾病的中药组合物，该组合物具有通过促进缺 血心肌血管生成发挥心脏保护作用，具体地说该组合物涉及从黄芪、丹参、三 七和降香药材饮片中提取的有效组分的组合。
背景技术：
心血管疾病是常见病，也是严重危害中老年群体的病种之一。近年来，由 于社会的发展，工作、生活、饮食结构及环境等的变化，心血管疾病患者呈上
升。据有关资料统计，中年以上心血管疾病患者的发病率达2.47%—3.18%。目 前治疗心血管疾病的西药主要是硝酸酯类化合物、卩受体阻滞剂及钙拮抗剂等， 这些药物只能缓解症状，难以治本，且有一定的毒副作用。中药虽然单一耙点 的作用强度低于西药，但其多途径、多靶点、动态整体治疗、毒副作用小的特 性则远非西药所能及，疗效确切的中成药的综合治疗效应要超过西药。
目前治疗心血管疾病的临床处方和中成药很多，例如，由黄芪、党参、当 归、丹参、红花组成的益气活血方；由黄芪、党参、麦冬、丹参、川芎、降香 组成的冠心病基本方；由三七、黄芪、葛根组成的付方三七口服液；由丹参、 延胡索、黄芪、赤芍、川芎、当归组成的舒心通脉片等等。以上临床处方和中 成药均有一定的不足之处，或偏于益气，或偏于通阳，或偏于活血，或剂型不 够理想，临床上未得到全面推广。而由黄芪、丹参、三七、降香组成的芪参益 气方正是一种新的有效治疗气虚血瘀型冠心病的中药方剂，它在临床上对各种 心血管疾病的症状都有一定程度的缓解作用。
芪参益气方由黄芪、丹参、三七和降香组成，益气通脉，活血止痛。用于 气虚血瘀型胸痹，症见胸闷胸痛，气短乏力、心悸、面色少华、自汗，舌体胖 有齿痕、舌质暗或紫暗或有瘀斑，脉沉或沉弦。方中重用黄芪，取其大补元气， 使气旺以促血行，祛瘀而不伤正；气旺以促津行，行津利尿，则水肿自消，黄 芪帅诸药之力，为君药。丹参活血祛瘀，通经止痛。三七活血祛瘀，通络 止痛，与丹参共为臣药。降香气香辛散，温通行滞。诸药合用益气活血，利
3水消肿，通络止痛，得以气血运行正常，诸证自愈。
从现代药理学层面分析芪参益气方黄芪对缺血心肌保护作用的机制是多
重性的，能够增加CAMP的含量，从而发挥正性肌力作用，通过稳定心肌细
胞膜，减少乳酸脱氢酶的产生、保护线粒体及溶酶体的功能、降低心肌耗氧量，
增加心肌抗缺氧能力；丹参通过清除氧自由基、保护线粒体、改善能量代谢及 对钙离子调控，达到改善心肌缺血再灌注损伤作用；三七主要药效成分三七总 皂苷具有降低心肌耗氧量，改善心肌缺血，减慢心率、扩血管降血压、调节血 糖作用；降香具有行气止痛作用，能抑制血栓形成。基础实验研究还表明芪参 益气方可以明显增加冠脉血流量，扩张冠脉血管、增加冠状静脉窦血氧含量， 改善心肌的供血供氧；改善左室做功，增加心输出量，调整心脏血管的顺应性， 对心血管系统起到调节和改善作用；还能使心肌梗塞程度明显减轻，血清CK 值降低，SOD活性增加，对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。
本实验从血管生成出发，对中药组合物进行深入的机制探讨，为中药机制 研究提供新的方法，同时也为临床提供更确切的实验依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有促缺血心肌血管生成作用的组合物，由黄 芪、丹参、三七和降香的提取物组成，其原料组成的重量百分含量为黄茛
30~50%，丹参20 30%，三七2 10%，降香20~30%。
优选的组合物原料组成的重量百分含量为黄芪45%，丹参25%，三七 5%，降香25%。
将四种提取物按比例溶于水配成组合物，其比例为每毫升水溶液中黄芪提 取物为10.56mg，丹参提取物为8.48mg，三七提取物为0.932mg，降香提取物 为0.468|_il。
本发明的组合物中原料提取物的制备方法通过以下步骤实现
(1)黄芪提取物的制备方法是，取黄芪药材饮片500g，粉碎至易于提取 的程度。在500g黄芪中加入3L水，提取两次，分别回流2小时和1小时，合 并两次提取的提取液，将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪浓縮至500ml，加 入95%乙醇，使得醇浓度达到约70% (约加入1200ml)，将乙醇加入的过程应 尽可能地放慢速度，使得水提醇沉得尽可能充分，将溶液放冷2小时，然后在 4"C的冰箱中静置12~24小时，将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪回收滤液 中的乙醇，最后将浓縮液在冷冻干燥器上冻干。得到约81g黄甚提取物。(2) 丹参提取物的制备方法是，取丹参药材饮片500g，粉碎至易于提取 的程度。在500g丹参中加入3.5L水，提取两次，各回流2小时，合并两次提 取的提取液，将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪浓縮至500ml，加入95%乙 醇，使得醇浓度达到约70% (约加入1200mO，将乙醇加入的过程应尽可能地 放慢速度，使得水提醇沉得尽可能充分，将溶液放冷2小时，然后在4'C的冰 箱中静置12 24小时，将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇， 最后将浓縮液在冷冻干燥器上冻干。得到约118g丹参提取物。
(3) 三七提取物的制备方法是，取三七药材饮片500g，粉碎至易于提取 的程度。在500g三七中加入3.5L水，提取两次，各回流2小时，合并两次提 取的提取液，将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪浓縮至500ml，加入95%乙 醇，使得醇浓度达到约70% (约加入1200ml)，将乙醇加入的过程应尽可能地 放慢速度，使得水提醇沉得尽可能充分，将溶液放冷2小时，然后在4'C的冰 箱中静置12 24小时，将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇， 最后将浓縮液在冷冻干燥器上冻干。得到约67g三七提取物。
(4) 降香提取物的制备方法是，取降香药材饮片500g，粉碎至易于提取 的程度。在500g降香中加入3L水，用挥发油提取装置提取挥发油约7ml。
本发明的另一个目的在于提供所述组合物在制备促缺血心肌血管生成作 用的药物中的应用。
尤其在制备促缺血心肌血管生成从而达到治疗和预防心血管疾病的药物 中的应用。
所述药物还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。
本发明提供的组合物，可以制成药剂学上任何一种制剂形式，包括针剂和 口服制剂。其中针剂包括注射液、滴注液、粉针剂；口服制剂包括颗粒剂、片 剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬 胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、 崩解剂、口崩片、微丸等。
本发明的有益之处是本发明提供的中药组合物，对心肌缺血有保护作用， 并从血管生成出发，在分子水平上对中药组合物的作用机制进行了深入的阐 述。
图l是HE及vWF染色观察血管生成。图2是相对于假手术组VEGF-A的mRNA的表达。 图3相对于假手术组bFGF的mRNA的表达。 图4相对于假手术组PDGF-B的mRNA的表达。 图5相对于假手术组HIF-la的mRNA的表达。 图6各生长因子蛋白水平的改变。 图7相对于假手术组VEGF蛋白的表达。 图8相对于假手术组bFGF蛋白的表达。 图9相对于假手术组PDGF-B蛋白的表达。
具体实施例方式
下面将结合本发明的实施例进一步详细说明本发明的实质内容，该实施例 仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。
实施例一
取黄芪药材饮片500g，粉碎至易于提取的程度。在500g黄萬中加入3L 水，提取两次，分别回流2小时和1小时，合并两次提取的提取液，将滤液在 纱布上滤过，用旋转蒸发仪浓縮至500ml，加入95%乙醇，使得醇浓度达到约 70% (约加入1200ml)，将乙醇加入的过程应尽可能地放慢速度，使得水提醇 沉得尽可能充分，将溶液放冷2小时，然后在4。C的冰箱中静置12 24小时， 将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇，最后将浓縮液在冷冻 干燥器上冻干。得到约81g黄芪提取物。
取丹参药材饮片500g，粉碎至易于提取的程度。在500g丹参中加入3.5L 水，提取两次，各回流2小时，合并两次提取的提取液，将滤液在纱布上滤过， 用旋转蒸发仪浓縮至500ml，加入95%乙醇，使得醇浓度达到约70% (约加入 1200ml)，将乙醇加入的过程应尽可能地放慢速度，使得水提醇沉得尽可能充 分，将溶液放冷2小时，然后在4"C的冰箱中静置12 24小时，将滤液在纱布 上滤过，用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇，最后将浓縮液在冷冻干燥器上冻千。 得到约118g丹参提取物。
取三七药材饮片500g，粉碎至易于提取的程度。在500g三七中加入3.5L 水，提取两次，各回流2小时，合并两次提取的提取液，将滤液在纱布上滤过， 用旋转蒸发仪浓縮至500ml，加入95%乙醇，使得醇浓度达到约70% (约加入 1200ml)，将乙醇加入的过程应尽可能地放慢速度，使得水提醇沉得尽可能充 分，将溶液放冷2小时，然后在^C的冰箱中静置12~24小时，将滤液在纱布上滤过，用旋转蒸发仪回收滤液中的乙醇，最后将浓缩液在冷冻干燥器上冻干。
得到约67g三七提取物。
取降香药材饮片500g，粉碎至易于提取的程度。在500g降香中加入3L 水，用挥发油提取装置提取挥发油约7ml。
实施例二
按实施例一的方法提取得到黄芪提取物、丹参提取物、三七提取物和降香 提取物，按如下配方组合lmL水溶液中含黄芪10.56mg，丹参8.48mg，三七 0.932mg，降香0.468^1。
实施例三
药理实验黄芪、丹参、三七、降香提取物的组合物促进冠脉结扎致心肌 缺血大鼠血管生成机制的研究。 模型建立
模型动物戊巴比妥麻醉(50mg/kgi.p.)，于第四肋间开胸，暴露心脏，结
扎冠脉左前降支，闭胸缝合。
假手术动物戊巴比妥麻醉(50mg/kgi.p.)，于第四肋间开胸，穿线但不结
扎冠脉左前降支，闭胸缝合。 给药方案
术后，将大鼠分为三组假手术组、模型组、给药组。待动物完全苏醒后， 按实施例二的方法得到的组合物进行灌胃给药，给药剂量为lmL/100g大鼠;
其他组给与相同剂量的蒸馏水，分别连续给药一天、三天及七天。 分别于第一天、第三天和第七天进行如下指标测定。 指标测定
(1) 于第一天、第三天和第七天，取血进行血清酶学肌酸激酶同功酶和乳 酸脱氢酶(CK-MB、 LDH)及血流变学测定。
(2) 分别于第三天和第七天，取出心脏，10%中性甲醛固定，进行HE染色 及通过免疫组化进行血管性假血友病因子(vWF)测定，观察血管生成；
(3) 于第一天、第三天和第七天，于结扎线以下，左心室区取大约100mg 心肌组织，提取总mRNA，并逆转录为cDNA，用realtime PCR对VEGF、 PDGF-B、 bFGF及HIF-la进行测定；
(4) 剩余大鼠分别于第一天、第三天和第七天在结扎线以下，左心室区获得
7心肌组织样品，进行蛋白定量，并用WesternBlot对VEGF、 PDGF-B、 bFGF
蛋白含量进行测定。
数据分析数据用均值±方差表示，n，为动物数，采用方差分析进行统计 学检验。 驢
(1)血清酶学结果
实验结果见表l，模型组大鼠第一，三和七天时，CK-MB显著升高，黄芪、 丹参、三七、降香提取物的组合物能显著降低CK-MB;在第一天和第三天时， 模型组LDH也显著升高，与模型组比，黄芪、丹参、三七、降香提取物的组 合物显著降低LDH的抬高，说明黄芪、丹参、三七、降香提取物的组合物对 心肌缺血大鼠具有保护作用。
表l芪参益气方对心肌缺血大鼠血清酶学的影响(n=10)
函一 ck-mb . E5ii
(u/l) (u/l)
l#P<0.01与假手术组相比具有非常显著差异；#P<0.05与假手术组相比具有显著差异; 'PO.05与模型组相比具有显著差异。
(2)血流变学结果
黄芪、丹参、三七、降香提取物的组合物能改善血液流变学。 表2芪参益气方对心肌缺血大鼠血流变的影响(n=10)
SHR10.0 (mpa s) 6.707±0.881 8.923士0.714' 8.423±1.113 7.175±0.007 9.164±1.968 6.951士1.063' 7.040±0.862 8.774土0.884'
SHR60.0 (mpa s) 4.120±0.425 5.103士0.014' 4.793±0.352 4.240±0.184 4.753±0.365 4.249土0.480' 4.490±0.431 5.151士0.380'
SHR150.0 (mpa s) 3.487±0.523 3.805±0.142 3.713±0.227 3.405±0.106 3.749土0.179' 3.463土0.308' 3.550±0.267 4.093±0.371
PV (mpa s) 1.028±0.034 1細±0.019 1.065±0.004 1.065±0.019 1細±0.015 1.104±0.028 1.102±0.038 U47土0.037
第一天 第三天 第七天
114.114±20.755 203.148土61.479' 118.712土30.739' 137.522±58.523 198.013土21.840' 155.735±46.292' 138.358±55.548 236.250土39.720' 151.130±56.024
22.137±3.757
63.747±9.309##
38.262±13.946*
111.916±4.058
216.290±40.952*
122.712土69.249'
83.220±33.046
169.924±45.297
80.350±58.682*
第一天 第三天 第七天
nTi rTTj rnj
绍 紹 自
1^经经1^经经TT经经
手型药手型药手型药
假模给假模给假模给
Bj 且 且
经 经 绍
、v 且且4^-且且忙且
1^T绍经1^经经TT经
手型药手型药手型
假模给假模给假模__给药组 7.505±0.596** 4.730士0.272'3.823±0.177 1.090土0.035"
#P<0.05与假手术组相比具有显著差异;"PO.Ol与模型组相比具有非常显著性差异;'P0.05 与模型组相比具有显著性差异。
(3) HE染色及免疫组化结果
该部分结果见图1。与模型组相比，给药三天及七天后，黄芪、丹参、三 七、降香提取物的组合物能显著促进新生血管的形成。图1中(A)为HE染 色；(B) vWF染色，图中箭头指向为血管；(C)血管计数，通过微血管计数 法进行计数，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇者均作为l个血管计数单 位，但肌层较厚及管腔面积大于8个红细胞直径的血管不计数。每张切片在400 倍视野下计数5个视野。11=4， * P < 0.05与模型组比具有显著性差异;** P < 0.01 与模型组比具有非常显著性差异。
(4) RT-PCR结果
该部分结果见图2—5。结果表明，黄芪、丹参、三七、降香提取物的组合 物能增加促进血管生成相关生长因子及缺氧诱导因子HIF-la mRNA的表达。
(5) Western Blot结果 该部分结果见图6—9。结果表明，黄芪、丹参、三七、降香提取物的组合物 在一天和七天时促进VEGF蛋白的表达，同时在七天时还促进bFGF蛋白的表 达，而PDGF-B蛋白表达无变化。
本发明选用冠脉结扎致SD大鼠心肌缺血模型，通过对SD大鼠心肌缺血 模型给药后的血清酶学、血流变学、免疫组化、RT-PCR及Western Blot结果， 验证本发明中药组合物的促血管生成作用。我们认为实施本发明将是从分子水 平阐述中药的机制，从而让中药走向世界、让中药现代产品能得到国际医学界 的认可，同时这也是我国目前实施中药现代化战略的需要。
9
权利要求
1. 一种中药组合物，其特征是该组合物由黄芪、丹参、三七和降香的提取物组成，其原料组成的重量百分含量为黄芪30～50％，丹参20～30％，三七2～10％，降香20～30％。
2. 根据权利要求1所述的一种中药组合物在制备促缺血心肌血管生成作 用的药物中的应用。
3. 根据权利要求2所述的一种中药组合物的应用，其特征是所述药物 还含有制剂允许的药物赋形剂或载体。
全文摘要
本发明提供一种具有促缺血心肌血管生成作用的组合物，由黄芪、丹参、三七和降香的提取物组成，其原料组成的重量百分含量为黄芪30～50％，丹参20～30％，三七2～10％，降香20～30％。本发明提供的中药组合物，对心肌缺血有保护作用，并从血管生成出发，在分子水平上对中药组合物的作用机制进行了深入的阐述。本发明的中药组合物可在制备促缺血心肌血管生成作用的药物中的应用。
文档编号A61K36/185GK101450106SQ20081016410
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者李云飞, 毅 王, 瞿海滨, 程翼宇 申请人:浙江大学