专利名称：一种人流感-禽流感联合疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种人流感-禽流感联合疫苗及其制备方法，尤其是一种包含H1N1型、H3N2型、B型流感和H5N1型禽流感疫苗的联合疫苗及其制备方法。
背景技术：
2005年10月14日WHO向世界呼吁“目前全世界正处在另一次流感大流行的边缘，一旦发生，传播迅速，不到3个月所有国家将受到感染，低估死亡人数在200万至740万，经济和社会破坏巨大，全世界每个国家都必须有所准备”。
2003年至2008年9月10日，世界各地共发生H5N1禽流感病例387人，死亡245人，病死率高达63.3％，潜在危害性超过SARS，威胁着全世界人民的健康，人用禽流感疫苗的研制已经引起各国政府的高度重视。
根据国际制药企业协会联合会(IFPMA)2006年1月对全球禽流感疫苗人体观察的统计，包括法、美、英、德、日、澳大利亚、俄罗斯、比利时、(中国)等国的12个(14个)单位开展了人用H5N1疫苗的研究。07年4月，美国在世界上第一个批准巴斯德公司的H5N1疫苗上市，该公司宣布，将在3年内向世界卫生组织捐赠6千万剂H5N1疫苗用于全球储备。我国08年6月也批准科兴公司生产禽流感疫苗，作为奥运会期间应急的贮备疫苗。
目前禽流感疫苗生产厂家遇到的难题是市场问题。一般认为禽流感病人周围人群及密切接触禽类者应当接种此疫苗，而对于广大人民群众是否需要进行预防接种？这个问题回答是否定的，因为H5N1病毒能否引发人传人，是一个未知数，普遍接种，成本太高，因而目前仅作为技术贮备，或物资贮备，由于产品没有市场，影响了生产厂家投资开发禽流感疫苗的积极性。
当今，人群接种季节性流感疫苗不断扩大，尤其发达国家较为普遍，如美国接种率达27％，欧洲国家接种率在7.8％～17.7％不等。我国也不断扩大，如果在人流感疫苗中加入人用禽流感疫苗，成本不高又易被人们接受。
发明内容
本发明目的是提供一种人流感-禽流感联合疫苗，在人流感疫苗中加入人用禽流感疫苗，成本不高又易被人们接受，并且解决了禽流感疫苗接种困难的问题。
本发明采用的技术方案是 一种人流感-禽流感联合疫苗，主要包括H1N1型人流感疫苗、H3N2型人流感疫苗、B型人流感疫苗和H5N1型人禽流感疫苗，各疫苗以血凝素计浓度为H1N1型人流感疫苗20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗20～40μg/mL、B型人流感疫苗20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗20～40μg/mL。以上为联合疫苗的主要有效成分，其辅助成分，如溶剂缓冲液、稳定剂、防腐剂等可按照本领域常规方法进行选择。
研究人-禽流感联合疫苗的目的是通过此疫苗的接种，使人群获得抗禽流感病毒的基础免疫，一旦感染，可能不发病或病情减轻，如目前的H1N1流感，虽仍在人群中流行，但不像1918年H1N1病毒引发的“西班牙流感”大流行时病死数千万人那样可怕了，因此人流感-人用禽流感联合疫苗，可解决禽流感疫苗接种困难的问题，在预防人流感的同时，也解决了禽流感的预防。因此本发明改变了目前对禽流感被动预防的局面，转为积极预防的策略，由于流感传播速度之快居病毒病之首，一旦H5N1禽流感病毒获得人传人的能力，1～2月内，即可传遍全球，故被动预防往往效果不理想，因为要在短时间内生产出能满足全球需求的禽流感疫苗，几乎不可能。
所述联合疫苗中还可含有防腐剂苯氧乙醇4～6mg/mL。硫柳汞，在我国传统疫苗中广泛地被用作防腐剂。硫柳汞中的49.6％是乙基汞，它具有很高的神经毒性。1986年前，2岁幼儿接受乙基汞的总量为100微克。到1991年，由于含硫柳汞的乙肝和流感疫苗的接种，汞的总量增为246微克，为原来的2.5倍。汞主要从尿中排出，由于儿童肾脏尚未完全发育，年龄越小排汞能力越差，如果儿童不断接种含汞的流感、乙脑和和流脑等疫苗，可能引起汞的积蓄中毒，现在认为，儿童的孤独症的发病与汞中毒有关。因而含硫柳汞的疫苗已被美国的爱荷华州、加利福尼亚州、和英国及其他欧洲国家禁用。本发明选用苯氧乙醇作为防腐剂，它毒性低，属非危险品，安全性高。另外本发明推荐所述联合疫苗中含有体积终浓度为0.004％～0.007％的吐温-80作为稳定剂。
各疫苗以血凝素计浓度为H1N1型人流感疫苗30μg/mL、H3N2型人流感疫苗30μg/mL、B型人流感疫苗30μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗30μg/mL。
所述的人流感-禽流感联合疫苗以0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液为稀释剂配制。
所述H1N1型人流感疫苗来自WHO推荐或认可的人流感H1N1/IVR-145毒种。所述H3N2型人流感疫苗来自WHO推荐或认可的人流感H3N2/NYMC X-161B毒种。所述B型人流感疫苗来自WHO推荐或认可的人流感B/Malysia-2506-2004毒种。所述H5N1人禽流感疫苗来自WHO推荐或认可的禽流感H5N1减毒株毒种。
所述联合疫苗可按本领域常规方法方便的获得，主要路线如下病毒种鸡胚→培养收获→离心去沉淀→超滤浓缩→丙内脂灭活→区带离心→超滤去糖→柱层析→裂解→区带离心→超滤去糖→过滤→单价原液，按照上述方法分别制得单价病毒原液混合后经稀释，即可得到联合疫苗。所述联合疫苗可不添加佐剂，也可添加氢氧化铝作为佐剂。
本发明联合疫苗制备方法优选按如下步骤进行 (1)人流感H1N1/IVR-145毒种、人流感H3N2/NYMC X-161B毒种、人流感B/Malysia-2506-2004毒种和禽流感H5N1减毒株毒种分别按下述步骤制取单价疫苗原液 ①毒种经传代、稀释后接种于鸡胚尿囊腔内，33～35℃培养48～72小时； ②筛选活鸡胚置2～8℃冷胚12～20小时，吸取外观澄清的尿囊液加入甲醛溶液，置2～8℃下18～20小时，收集病毒液，超滤浓缩40～50倍；需取样进行无菌检查及血凝效价测定，要求收获液无菌检查合格，血凝效价不小于1:320。
③浓缩后的病毒液加入病毒液体积1/4000的β-丙内脂，2～8℃下灭活18～20小时； ④灭活后的病毒液经纯化后，加入终浓度为0.4％的Triton X-100或/和终浓度0.4％脱氧胆酸钠作为裂解剂，混合后用600W～700W功率的超声波细胞粉碎机处理2～4min，再置20～30℃下作用90～120分钟，得到病毒裂解物； ⑤病毒裂解物经纯化后，加入体积为纯化后裂解物体积0.006％的吐温80作为稳定剂，滤膜过滤，得到单价疫苗原液； (2)将制得单价疫苗原液按比例混合，以0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液按血凝素含量稀释至H1N1型人流感疫苗浓度20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗浓度20～40μg/mL、B型人流感疫苗浓度20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗浓度20～40μg/mL，并加入终浓为4～6mg/mL的苯氧乙醇作为防腐剂，滤膜过滤，得到所述人流感-禽流感联合疫苗。
具体的，所述联合疫苗可按如下步骤获得 (1)病毒接种与培养取工作种子批毒种，融化后用0.01mol/L的PBS稀释103-105倍，并加入500μg/ml的卡那霉素。将稀释后的病毒接种于鸡胚尿囊腔内，每胚0.2ml，接种后置33～35℃培养，48～72小时。工作种子批毒种融化后若一次未用完，不得再冻结使用。疫苗生产过程中不得加入青霉素或其他β-内酰胺类抗生素。
(2)病毒收获筛选活鸡胚置2～8℃冷胚12～20小时，吸取外观澄清的尿囊液于无菌容器中，加入终浓度为0.04％的比例加入甲醛溶液，置2～8℃下8～20小时。取样进行无菌检查及血凝效价测定，要求收获液无菌检查合格，血凝效价不小于1:320。
(3)病毒收获液浓缩灭活后的收获液以13000～15000rpm/min的转速，和不超过1500ml/min的流量进行连续流离心澄清，然后用孔径为100万分子量的超滤膜超滤浓缩40～50倍，超滤时进口压力不超过0.2Mpa。
(4)病毒灭活浓缩后的病毒液内加入1/4000(v/v)的β-丙内脂，置2～8℃灭活18～20小时。
(5)病毒纯化蔗糖密度区带离心浓缩后的病毒液以不超过离心腔容积50％的量上样，在0～55％的蔗糖溶液中以30000rpm/min的转速梯度离心3小时，在280nm波长的紫外监测下收集第三峰(蔗糖浓度为30％～42％的液段)，以提取病毒，然后在超滤器上用PBS进行超滤清洗，以去除蔗糖。
超滤清洗方法为将提取的病毒液用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀释2～4倍，再用100万分子量的超滤膜进行超滤浓缩，且边超滤边补加PBS，使超滤期间的液量保持恒定，并使超滤清洗的PBS总液量不少于所提病毒液的4倍。
(6)柱层析用Sephrose-4FF凝胶进行层析纯化，层析的上样量不超过凝胶体积的8％，洗脱液为0.01mol/L的PBS(pH7.2)，洗脱流速为5-6mm/min，在280nm波长的紫外监测下收集第一峰。
(7)病毒裂解纯化后的病毒液加入终浓度为0.4％Triton X-100或/和0.4％脱氧胆酸钠作为裂解剂，混合后用600W～700W功率的超声波细胞粉碎机处理2～4min，再置20～30℃下作用90～120分钟。
(8)病毒裂解后的纯化病毒裂解物以不超过离心腔容积50％的量上样，在0～55％的蔗糖溶液中以30000r/min的转速梯度离心2小时，然后在280nm波长的紫外监测下去除第一峰和最后一峰，收集蔗糖浓度为2％～42％的液段，再在超滤器上用PBS进行超滤清洗，以去除蔗糖。
超滤清洗方法为将离心后的裂解物用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀释2～4倍，再用10万分子量的超滤膜进行超滤浓缩，且边浓缩边补加PBS，使超滤期间的液量保持恒定，并使超滤清洗的PBS总液量不少于裂解物的6倍。
纯化后的裂解物加入0.006％(v/v)的吐温-80，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为单价原液，应置于2～8℃保存。
(9)联合疫苗配制将各型单价原液按血凝素含量稀释成分别为20～40μg/ml，稀释剂为0.01mol/L的PBS(pH7.2)，并加入终浓为4～6mg/ml的苯氧乙醇作为防腐剂，0.22μm孔径的滤膜过滤即为所述联合疫苗。
人流感疫苗原本是由甲型流感病毒A1(H1N1)、A3(H3N2)和B型病毒组成的3价联合疫苗，而H5N1与它们同属同种，与A1(H1N1)、A3(H3N2)同属于A型，较B型更近，因而在人流感疫苗中加入H5N1成份，理论上相互之间不会有不良的影响。根据对流感病毒纯化技术的掌握，可以做到联合疫苗中与副反应密切相关的4项指标(卵蛋白、内毒素、总蛋白的含量、总蛋白与血凝素之比)远比国家的流感生产规程低，这是保证联合疫苗安全性的物质基础。
本发明的有益效果主要体现在提供了一种包含H1N1型、H3N2型、B型流感和H5N1型禽流感疫苗的4价联合疫苗及其制备方法，将本发明人流感-人用禽流感联合疫苗，可解决禽流感疫苗接种困难的问题，在预防人流感的同时，也解决了禽流感的预防；按照本发明方法，制得合疫苗中与副反应密切相关的4项指标(卵蛋白、内毒素、总蛋白的含量、总蛋白与血凝素之比)远比国家的流感生产规程低，安全性高。
图1为测得的R1194株血凝素核苷酸序列； 图2为R1194株血凝素核苷酸序列与原始毒株核苷酸序列差异； 图3为R1194株血凝素核苷酸序列与原始毒株氨基酸序列变化； 图4为R1194病毒裂解前的电镜照片(×60K)； 图5为R1194病毒裂解后的电镜照片(×60K)； 图6为R1194病毒裂解前后的SDS-PAGE电泳结果；Mmark；1裂解前；2裂解后-A；3～7裂解后-B； 图7为用确诊H5N1禽流感病毒的引物扩增疫苗的结果图；MMark；1疫苗。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此 实施例1 联合疫苗的获得 1.1 生产用鸡胚 毒种传代和制备用鸡胚应来源于SPF鸡群；疫苗生产用鸡胚应来源于封闭式房舍内饲养的健康鸡群。
1.2 毒种 1.2.1 名称及来源 禽流感毒种NIBRG-14株，来源于英国国家生物制品检定所(NIBSC)；由A/VietNam/1194/2004 H5N1株经反相遗传的方法改造而成，简称R1194株。
流感毒种WHO推荐用于2007-2008年流感疫苗生产的毒株——A1/IVR-145、A3/NYMC X-161B、B/Malysia-2506-2004。
1.2.2 种子批的建立 应符合现行版《中国药典》三部通则“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的要求。
1.2.3 种子批毒种的检定 主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行1.2.3.1～1.2.3.5项检定。
1.2.3.1 鉴别试验 用相应(亚)型特异性免疫血清按3.1.4进行单向免疫扩散试验，应产生特异性沉淀反应，证明样品的抗原性与推荐病毒株一致。
1.2.3.2 血凝效价 采用直接血凝法进行检测，血凝效价应不低于1:320。。
取样品25uL于96孔血凝板中用生理盐水进行倍比稀释，每个稀释度加等量1％鸡红细胞悬液，充分混匀于4～8℃放置30～60分钟判定，以50％的鸡红细胞被凝集的最高稀释度判为血凝效价。
1.2.3.3 病毒滴定 用鸡胚感染法测定病毒滴度，应不低于7.0Log EID50/mL。
将毒种样品用普通肉汤培养基作10倍系列稀释(冻干毒种先溶解并稀释至1ml，其稀释度为10-1)，选择10-4～10-9稀释度各接种4只9～11日龄鸡胚尿囊腔，每胚接种量0.2ml，置34～35℃培养72小时，24小时内死亡的鸡胚应废弃，每胚分别取样做直接血凝试验，根据血凝阳性的鸡胚数计算病毒滴度EID50，以半数鸡胚感染最高稀释度的负对数为病毒滴度。
1.2.3.4 无菌检查 依法检查，应符合规定。
1.2.3.5 支原体检查 依法检查，应符合规定。
1.2.3.6 外源性禽白血病病毒检测 流感毒种与相应(亚)型的抗血清等量混合，37℃中和1小时后接种9日龄SPF鸡胚的成纤维细胞，置5％CO2培养箱37℃连续培养4代，每代7天，同时设阳性及阴性对照。采用ELISA法检测培养物，检测结果应为阴性。
1.2.3.7 外源性禽腺病毒检测 流感毒种与相应(亚)型的抗血清等量混合，37℃中和1小时后接种于用13日龄SPF鸡胚肝制备的单层细胞，置5％CO2培养箱37℃连续培养4代，每代7天，同时设阳性及阴性对照。分别用血清学的方法检查培养物中的I型和III型外源性禽腺病毒，检测结果应为阴性。
1.2.4 毒种传代 取毒种复溶至1mL，稀释至103～105后接种9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔，接种量0.2mL/胚，33～35℃培养72小时后收获尿囊液并混合，加等量脱脂牛乳后分装(0.2mL/支)冻干后保存于-70℃以下，经检定合格即为主代种子批。从主种子批取出的毒种按上述方法传代，收获液分装并冻存于-20℃以下即为工作种子批。毒株自分离起至生产出的疫苗代次不得超过15代，生产企业自获得毒种到制成工作种子批传代不得超过4代。
1.2.5 毒种保存 冻干毒种在-70℃以下保存；液体毒种在-20℃以下保存。
1.3 单价原液的获得 1.3.1 鸡胚准备 选用9～11日龄的无畸形、血管清晰、有活性的鸡胚。
1.3.2 病毒接种与培养 取工作种子批毒种，融化后用0.01mol/L的PBS稀释105倍，并加入500μg/mL的卡那霉素。将稀释后的病毒接种于鸡胚尿囊腔内，每胚0.2mL，接种后置33～35℃培养72小时。工作种子批毒种融化后若一次未用完，不得再冻结使用。疫苗生产过程中不得加入青霉素或其他β-内酰胺类抗生素。
1.3.3 病毒收获 筛选活鸡胚置2～4℃冷胚18小时，吸取外观澄清的尿囊液于无菌容器中，加入终浓度为0.04％的比例加入甲醛溶液，置2～8℃下20小时。取样进行无菌检查及血凝效价测定，要求收获液无菌检查合格，血凝效价不小于1:320。
1.3.4 病毒收获液浓缩 灭活后的收获液以15000rpm/min的转速，和不超过1500mL/min的流量进行连续流离心澄清，然后用孔径为100万分子量的超滤膜超滤浓缩50倍，超滤时进口压力不超过0.2Mpa。
1.3.5 病毒灭活 浓缩后的病毒液内加入1/4000(v/v)的β-丙内脂，置2～8℃灭活20小时。
1.3.6 病毒纯化 1.3.6.1 蔗糖密度区带离心 浓缩后的病毒液以不超过离心腔容积50％的量上样，在0～55％的蔗糖溶液中以30000rpm/min的转速梯度离心3小时，在280nm波长的紫外监测下收集第三峰(蔗糖浓度为30％～42％的液段)，以提取病毒，然后在超滤器上用PBS进行超滤清洗，以去除蔗糖。
超滤清洗方法为将提取的病毒液用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀释4倍，再用100万分子量的超滤膜进行超滤浓缩，且边超滤边补加PBS，使超滤期间的液量保持恒定，并使超滤清洗的PBS总液量不少于所提病毒液的4倍。
1.3.7.2 柱层析 用Sephrose-4FF凝胶进行层析纯化，层析的上样量不超过凝胶体积的8％，洗脱液为0.01mol/L的PBS(pH7.2)，洗脱流速为5～6mm/min，在280nm波长的紫外监测下收集第一峰。
1.3.8 病毒裂解 纯化后的病毒液加入终浓度为0.4％Triton X-100和0.4％脱氧胆酸钠作为裂解剂，混合后用600W～700W功率的超声波细胞粉碎机处理4min，再置20～30℃下作用120分钟。
1.3.9 病毒裂解后的纯化 病毒裂解物以不超过离心腔容积50％的量上样，在0～55％的蔗糖溶液中以30000r/min的转速梯度离心2小时，然后在280nm波长的紫外监测下去除第一峰和最后一峰，收集蔗糖浓度为2％～42％的液段，再在超滤器上用PBS进行超滤清洗，以去除蔗糖。
超滤清洗方法为将离心后的裂解物用0.01mol/L(pH7.2)的PBS稀释2～4倍，再用10万分子量的超滤膜进行超滤浓缩，且边浓缩边补加PBS，使超滤期间的液量保持恒定，并使超滤清洗的PBS总液量不少于裂解物的6倍。
1.3.10 过滤 纯化后的裂解物加入0.006％(v/v)的吐温80，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为单价原液。
1.3.11 原液保存 应置于2～8℃保存。
1.4 联合疫苗半成品 1.4.1 联合疫苗配制 将各型单价原液按血凝素含量稀释成30μg/mL，稀释液剂为0.01mol/L的PBS(pH7.2)，并加入终浓为5mg/mL的苯氧乙醇作为防腐剂，0.22μm孔径的滤膜过滤即为联合疫苗半成品。
1.5 联合疫苗成品 1.5.1 分批 应符合现行版《中国药典》三部通则“生物制品分批规程”的要求。
1.5.2 分装 应符合现行版《中国药典》三部通则“生物制品分装和冻干规程”的规定。
1.5.3 规格 每瓶(支)0.5mL。每1人用剂量为0.5mL，含各流感病毒株血凝素应不低于15μg。
1.5.4 包装 应符合现行版《中国药典》三部通则“生物制品包装规程”规定。
2、检定 2.1 单价原液检定 2.1.1 无菌检查 依法检查，应符合规定。
2.1.2 病毒灭活验证试验 将灭活后样品按原倍及1:10和1:100稀释后分组接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔中，每胚接种0.2mL，每个稀释度接种10个鸡胚，置33～35℃培养72小时。24小时内死亡的不计数，每组鸡胚至少存活80％。自存活鸡胚中每胚取0.5mL尿囊液，按组混合后，再盲传一代，每组接种于9～11日龄鸡胚尿囊腔中，每胚0.2mL，每个稀释度接种10个鸡胚，置33～35℃培72小时，取尿囊液进行直接血凝试验，结果应不出现血凝反应。
2.1.3 鉴别试验 用相应(亚)型特异性免疫血清按3.1.4进行单向免疫扩散试验，应产生特异性沉淀反应，证明样品的抗原性与推荐病毒株一致。
2.1.4 血凝素含量 采用单向免疫扩散法。
制备含病毒标准血清的1％琼脂糖凝胶板，打孔(孔径为2.5～3mm)，将标准抗原和待检样品分别以每孔10μL的量加入，置20～25℃扩散至少21小时，用PBS浸泡1小时后干燥、染色、脱色。准确测量标准抗原和待检样品所形成的沉淀环直径，以标准抗原形成的沉淀环的直径及相应抗原含量进行直线回归，求出直线回归方程，代入检品的沉淀环直径，即可得到原液的血凝素的含量。
2.2 联合疫苗半成品检定 2.2.1 无菌检查 依法检查，应符合规定。
2.2.2 血凝素含量 按2.1.4项进行，要求为24～36μg/株/mL。
2.2.3 总蛋白含 按“Lowry法”测定，应不高于(420μg/mL)，且不超过疫苗血凝素含量的4.2倍。
2.2.4 卵清蛋白含量 采用对流免疫电泳法进行检测，应不高于250ng/mL。
将抗卵清蛋白免疫血清加入1％琼脂糖凝胶板上阴极孔、待测样品加入1％琼脂糖凝胶板上阳极孔，每孔10uL(孔径2.5mm，孔间距约1cm)，在电泳仪上以120V～150V电压电泳35～40min，然后在水中浸泡1小时，再进行干燥、染色和脱色。同时做0～1000ng/mL的标准系列，将样品测定孔与标准系列进行对照，观察和判断样品中卵清蛋白含量。
2.2.5 Triton X100残留量测定 残留量应不高于100μg/mL。
2.2.5 吐温80含量的测定 含量应不高于60μg/mL。
2.2.6 苯氧乙醇含量的测定 含量应为4～6m g/mL。
2.2.7 脱氧胆酸钠含量的测定 含量应不高于100μg/mL。
2.3 成品检定 2.3.1 外观检查 疫苗外观为无色或微乳白色液体，无异物。
2.3.2 装量 依法检查，应不低于标示量。
2.3.3 无菌检查 依法检查，应符合规定。
2.3.4 鉴别试验 按2.1.3项进行，结果证明其抗原性与推荐的病毒株相一致。
2.3.5 血凝素含量 按2.1.4项进行，血凝素(HA)含量应为(30±6μg/mL)。
2.3.6 pH 依法检查，pH应为7.0～7.6。
2.3.7 游离甲醛含量 依法检查，应不高于20μg/mL。
2.3.8 苯氧乙醇含量 含量应为4～6mg/mL。
2.3.9 总蛋白含量 用Lowry法测定，应不超过420μg/mL，且不超过疫苗血凝素含量的4.2倍。
2.3.10 卵清蛋白含量 按2.2.4项进行，卵清蛋白含量应不高于250ng/mL。
2.3.11 细菌内毒素含量测定 依法检查，应不高于50EU/mL。
2.3.12 异常毒性检查 依法检查，应符合规定。
实施例2 一、实验材料及步骤 1、疫苗免疫动物试验 按实施例1方法制得的联合疫苗，经对多种动物免疫试验证明，鸡和小鼠敏感性很差，大鼠又太敏感，而家兔较理想，表现在抗体反应相对稳定、量-效反应明显、强度适中接近于人体，血量大和采血容易等特点。
试验用的家兔为新西兰种，2公斤左右，雌雄不分，来自浙江省农科院。
2、疫苗免疫家兔试验 1)剂量与分组(按实施例1方法制得的各单价疫苗原液，以0.01mol/L的PBS(pH7.2)稀释，配制成下述组成的单价或多价疫苗，含佐剂疫苗添加氢氧化铝为佐剂，其用量为0.5mg/mL) ①各15μg HA/0.5mL无佐剂人流感3价疫苗。
②各15μg HA/0.5mL佐剂人流感3价疫苗。
③15μg HA/0.5mL无佐剂禽流感单价疫苗。
④15μg HA/0.5mL佐剂禽流感单价疫苗。
⑤各15μg HA/0.5mL无佐剂人流感-禽流感4价苗。
⑥各15μg HA/0.5mL佐剂人流感-禽流感4价疫苗。
⑦各15μg HA/0.5mL无佐剂人流感-禽流感4价苗。
⑧各15μg HA/0.5mL佐剂人流感-禽流感4价疫苗。
⑨空白对照(不接种任何疫苗)。
2)免疫方法每只家兔大腿肌肉分别接种各组疫苗0.5mL，每组5只，15天后同样方法加强一针，共2针，(7)(8)2组不加强。
3)采血 1～6组于0、15、30天时采血共3次 ①首针前当天(观察免前抗体水平)； ②加强接种前当天(观察1针后15天的抗体水平)； ③加强接种后15天(观察2针后的抗体水平)； 7～8组于0、30天时采血共2次 ①首针前当天(观察免前抗体水平)； ②首针后30天(观察1针后30天的抗体水平)。
各静脉采血5～10mL，分离血清，-30℃以下冻存，用于测血抑抗体和中和抗体。
2、急性毒性试验 上述6种疫苗，按我国的生物制品规程要求，分别在小鼠和豚鼠中进行急性毒性安全性试验。
4、中和抗体检测 在蛋胚中测定，固定病毒(103EID50/mL)，稀释血清，病毒与血清等量混合，37℃中和90分钟，每只蛋胚接种0.2mL(含100EID50)，每稀释度接种4只蛋胚，4只全抑制的最高稀释度为中和效价。
5、血凝抑制试验 按常规方法，血凝素，用R1194毒种蛋胚培养液自制；霍乱滤液由中国国家流感中心提供。
二、实验结果及讨论 1、R1194病毒传代R1194各代病毒滴度的测定见表1 表1R1194各代病毒滴度的测定 2、R1194毒种的亚型鉴别 用A1、A3、B和H5N4种抗血清，与相应抗原进行交叉单向免疫扩散试验，以鉴别其亚型，结果(见表2)符合H5亚型。
表2各型流感病毒交叉单向免疫扩散试验
3、R1194株核苷酸序列测定 1)测得的R1194株血凝素核苷酸序列见图1 2)与原始毒株核苷酸序列差异见图2 从图2可知R1194株的核苷酸序列与原始毒株比较，去了1022至1033的12个碱基，在1015、1034和1036位置上的A由C取代。3)与原始毒株氨基酸序列变化见图3 从图3可知R1194株比原始毒株少RRRK四个氨基酸，下一个K由T取代。现已知含有R-R-R-K-K-R氨基酸序列的禽流感毒株属高致病力毒株。
4、接种滴度、温度及培养时间的确定 表3不同接种滴度、温度及培养时间病毒的效果比较
备注血凝滴度(1/)，病毒滴度(Lg) 确定培养温度为34.5℃，接种滴度为104，培养时间为72h。
5、疫苗的检定 1)单价疫苗原液检定结果见表4 表4单价疫苗原液检定结果 2)联合疫苗半成品检定结果见表5 表5联合疫苗半成品检定结果
3)R1194病毒裂解前后的电镜形态见图4和图5 4)R1194病毒裂解前后的SDS-PAGE电泳结果见图6 从图6可知，纯化病毒裂解前后，均可看到典型的核酸和血凝素条带。
5)免疫源性检查 丙内脂灭活病毒，纯化、裂解后，配成15μg/0.5ml，免疫家兔4只，每只肌肉接种0.5ml，15天后加强一针，首针后30天采血，测定血抑抗体和中和抗体，结果均大于1:40。
6)疫苗的核酸扩增 用国家流感中心提供确诊H5N1禽流感病毒的引物，扩增疫苗的电泳，结果扩增出378bp的禽流感病毒的基因片段(见图7))。此法也可用于对此疫苗的鉴别试验。
7、免疫家兔血清中和抗体检测结果干扰现象分析 1)无佐剂的禽流感单价疫苗和人流感-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生禽流感病毒抗体的情况(见表6) 表6无佐剂的2种苗产生禽流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
“-”表示<1:10；结果干扰现象不明显，抗体滴度均大于1:20。
2)含佐剂的禽流感单价疫苗和人流感-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生禽流感病毒抗体的情况(见表7) 表7含佐剂的2种苗产生禽流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
“-”表示<1:10；结果干扰现象明显(P<0.05)，但有1:76.9的抗体。
3)无佐剂的人流感3价疫苗和人-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生A1型流感病毒中和抗体的情况(见表8) 表8无佐剂的2种苗产生A1型流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
“-”表示<1:10；结果干扰现象一针不明显；二针明显(P<0.05)，但中和抗体滴度已高达1:615.1。
4)含佐剂的人流感3价疫苗和人-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生A1型流感病毒中和抗体的情况(见表9) 表9含佐剂的2种苗产生A1型流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
“-”表示<1:10；结果干扰现象一针不明显；二针明显(P<0.05)，但中和抗体滴度已高达1:637。
5)无佐剂的人流感3价疫苗和人-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生B型流感病毒中和抗体的情况(见表10) 表10无佐剂的2种苗产生B型流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
“-”表示<1:10；结果一针<1:10；二针均很高，干扰现象不明显。
6)含佐剂的人流感3价疫苗和人-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生B型流感病毒中和抗体的情况(见表11) 表11含佐剂的2种苗产生B型流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
“-”表示<1:10；结果一针<1:10；二针均很高，干扰现象不明显。
7)无佐剂的人流感3价疫苗和人-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生A3型流感病毒中和抗体的情况(见表12) 表12无佐剂的2种苗产生A3型流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
结果干扰现象不明显；4价苗免疫后滴度高些，可能与免疫前滴度高有关。
8)含佐剂的人流感3价疫苗和人-禽流感4价联合疫苗，分别免疫家兔，比较产生A3型流感病毒中和抗体的情况(见表13) 表13含佐剂的2种苗产生A3型流感病毒中和抗体的滴度比较(1/)
结果干扰现象不明显；4价苗免疫后滴度高些，可能与免疫前滴度高有关。
9)人-禽流感4价联合无佐剂疫苗，免疫家兔1针30天后，检查中和抗体的情况见表14 表14人-禽流感4价联合无佐剂苗1针30天的中和抗体滴度(1/) ()内的数字为免疫前的中和抗体，“-”表示<1:10；结果仅H5N1较低。
10)人-禽流感4价联合含佐剂疫苗，免疫家兔1针30天后，检查中和抗体的情况见表15 表15人-禽流感4价联合含佐剂苗1针30天的中和抗体滴度(1/) ()内的数字为免疫前的中和抗体，“-”表示<1:10；结果H5N1也大于1:20。
11)家兔免疫血清血抑抗体检测结果基本与中和抗体相似。
12)对照组家兔在实验期间，与实验家兔一样同时采血，结果除检出相似滴度的A3型流感中和抗体外，均未检出流感A1、B型和H5N1禽流感抗体，表明对照成立。
8、抗体检测结果总结 1)免前家兔抗体检查结果 (1)未查到禽流感H5N1和流感B型的中和抗体； (2)个别检出低滴度的流感A1型中和抗体； (3)普遍有很高的流感A3型中和抗体。
2)含有禽流感抗原疫苗的接种 (包括禽流感疫单价苗和人-禽流感联合4价疫苗) 1针后无佐剂或佐剂苗，均未检查到中和抗体。
2针后无佐剂或佐剂苗，均检查到中和抗体，均>1:20。
3)含有A型抗原疫苗的接种 (包括人流感3价疫苗和人-禽流感联合4价疫苗) 1针后无佐剂或佐剂苗，均检查均值>1:20的A型中和抗体； 2针后无佐剂或佐剂苗，均检查到很高的A型中和抗体， 4)含有B型抗原疫苗的接种 (包括人流感3价疫苗和人-禽流感联合4价疫苗) 1针后无佐剂苗未查到中和抗体；佐剂苗查到均数<1:20的中和抗体； 2针后无佐剂或佐剂苗，均检查较高的中和抗体。
5)含有A3型抗原疫苗的接种 (包括人流感3价疫苗和人-禽流感联合4价疫苗) 由于免前均有较高的中和抗体，均数已达1:800左右，1针和2针后，中和抗体高达1:5000以上，因而检测禽流A3型中和抗体已无必要。家兔免前具有较高的中和抗体，可能是A3型流感病毒在人群和兔群广泛传播有关，从上海动物中心购得的每只300元的SPF家兔，免前也检测到很高的中和抗体。
6)人-禽流感4价联合无佐剂苗1针后15天，A1型流感病毒中和抗体已达1:49.2，而B型中和抗体<1:10，但1针后30天A1型更高，达1:236.9，B型也达1:81.9，由此可知，接种1针人-禽流感4价联合无佐剂苗，对人流感的A1、A3、B型3种病毒与传统的流感疫苗一样，均能达到很好的预防效果，如果制成佐剂苗，则效果更好。
7)检测免疫家兔血清中血抑抗体的结果，与中和抗体相似，由于中和抗体直接反映杀毒的能力，实验结果又稳定、客观，而血抑抗体虽方法简便，但影响因素较多，可靠性不如中和抗体。
9、从上述结果可知人流感疫苗和禽流感疫苗的联合，基本没有发生干扰，特别是无佐剂苗，即使个别佐剂苗受一些干扰，但均已产生较高的中和抗体，提示2种疫苗的联合是完全可能的。
10、6种苗均通过小鼠和豚鼠的急性安全性试验。
11、制造人-禽流感联合疫苗的设想 工艺裂解疫苗—成人、儿童都适用。
剂型无佐剂苗—透明液体，同传统流感苗，易推广；或含氢氧化铝佐剂(0.5mg/0.5ml)疫苗，其免疫效果更好些。
剂量各15μg—已证实人流感1针，禽流感2针有效。
程序1针，用于预防人流感；并作为禽流感基础免疫，需突发预防禽流感时再加强1针。
2针，用于禽流感疫区居民，和接触禽类的重点人群。
12、与流感疫苗一样，随着全社会每年不断的重复接种和推广，使H5N1禽流感抗体在人群中不断地加强和扩大，这样可能达到和目前的H1N1流感一样，即使H5N1病毒获得人传人的能力，也不可怕了。
权利要求
1.一种人流感-禽流感联合疫苗，主要包括H1N1型人流感疫苗、H3N2型人流感疫苗、B型人流感疫苗和H5N1型人禽流感疫苗，各疫苗以血凝素计浓度为H1N1型人流感疫苗20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗20～40μg/mL、B型人流感疫苗20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗20～40μg/mL。
2.如权利要求1所述的人流感-禽流感联合疫苗，其特征在于所述联合疫苗中还含有防腐剂苯氧乙醇4～6mg/mL。
3.如权利要求1所述的人流感-禽流感联合疫苗，其特征在于所述联合疫苗中还含有终浓度为0.004％～0.007％的吐温-80。
4.如权利要求2所述的人流感-禽流感联合疫苗，其特征在于各疫苗以血凝素计浓度为H1N1型人流感疫苗30μg/mL、H3N2型人流感疫苗30μg/mL、B型人流感疫苗30μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗30μg/mL。
5.如权利要求1～4之一所述的人流感-禽流感联合疫苗以0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液为稀释剂制成。
6.如权利要求1～4之一所述的人流感-禽流感联合疫苗，其特征在于所述H1N1型人流感疫苗来自人流感H1N1毒种。
7.如权利要求1～4之一所述的人流感-禽流感联合疫苗，其特征在于所述H3N2型人流感疫苗来自人流感H3N2毒种。
8.如权利要求1～4之一所述的人流感-禽流感联合疫苗，其特征在于所述B型人流感疫苗来自人流感B毒种。
9.如权利要求1～4之一所述的人流感-禽流感联合疫苗，其特征在于所述H5N1人禽流感疫苗来自禽流感H5N1减毒株毒种。
10.如权利要求1所述人流感-禽流感联合疫苗的制备方法，所述方法包括
(1)人流感H1N1/IVR-145毒种、人流感H3N2/NYMC X-161B毒种、人流感B/Malysia-2506-2004毒种和禽流感H5N1减毒株毒种分别按下述步骤制取单价疫苗原液
①毒种经传代、稀释后接种于鸡胚尿囊腔内，33～35℃培养48～72小时；
②筛选活鸡胚置2～8℃冷胚12～20小时，吸取外观澄清的尿囊液加入甲醛溶液，置2～8℃下18～20小时，收集病毒液，超滤浓缩40～50倍；
③浓缩后的病毒液加入体积为病毒液体积1/4000的β-丙内脂，2～8℃下灭活18～20小时；
④灭活后的病毒液经纯化后，加入终浓度为0.4％的Triton X-100或/和终浓度0.4％脱氧胆酸钠作为裂解剂，混合后用600W～700W功率的超声波细胞粉碎机处理2～4min，再置20～30℃下作用90～120分钟，得到病毒裂解物；
⑤病毒裂解物经纯化后，加入体积为纯化后裂解物体积0.006％的吐温-80作为稳定剂，滤膜过滤，得到单价疫苗原液；
(2)将制得单价疫苗原液按比例混合，以0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液按血凝素含量稀释至H1N1型人流感疫苗浓度20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗浓度20～40μg/mL、B型人流感疫苗浓度20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗浓度20～40μg/mL，并加入终浓为4～6mg/mL的苯氧乙醇作为防腐剂，滤膜过滤，得到所述人流感-禽流感联合疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种包含H1N1型、H3N2型、B型流感和H5N1型禽流感疫苗的4价联合疫苗及其制备方法，各疫苗以血凝素计浓度为H1N1型人流感疫苗20～40μg/mL、H3N2型人流感疫苗20～40μg/mL、B型人流感疫苗20～40μg/mL和H5N1型人禽流感疫苗20～40μg/mL。将本发明人流感-人用禽流感联合疫苗，可解决禽流感疫苗接种困难的问题，在预防人流感的同时，也解决了禽流感的预防；按照本发明方法，制得联合疫苗中与副反应密切相关的4项指标(卵蛋白、内毒素、总蛋白的含量、总蛋白与血凝素之比)远比国家的流感生产规程低，安全性高。
文档编号A61K39/295GK101450207SQ20081016376
公开日2009年6月10日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者朱智勇 申请人:浙江省疾病预防控制中心, 浙江天元生物药业股份有限公司