一种具有抗菌抗病毒作用的莪术CO₂超临界萃取物及其制备方法

专利名称：：一种具有抗菌抗病毒作用的莪术CO₂超临界萃取物及其制备方法
技术领域：
：本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种具有抗菌抗病毒作用的莪术(A超临界萃取物及其制备方法。
背景技术：
：莪术为姜科植物蓬莪术(CurcumaphaeocaulisVal.)、广西莪术(CurcumaKwang-siensisS.G丄eeetC.F丄iang)或温郁金(CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling)的干燥根茎。莪术，别名有蓬术、速药、广茂等，始载于唐《甄权《药性本草》。《中华人民共和国药典》2005年版记载味辛、苦，性温，归肝、脾经，具行气破血、消积止痛之效，用于癥瘕痞块、瘀血经闭、食积胀痛、早期宫颈癌等。现代药理研究表明具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、消炎止痛、去腐生肌、抗早孕、降酶、增强免疫等药理作用。化学研究证明，莪术中含有两大类成分，即挥发油和姜黄素类。挥发油中的主要成分为莪术醇、榄香烯、蓬莪术环氧酮、蓬莪术酮、蓬莪术环二烯、姜黄醇酮、姜黄环氧奥烯醇等半萜烯类，具有抗病毒、抗肿瘤、抗菌、消炎止痛、去腐生肌、抗早孕、降酶、增强免疫等药理作用。莪术油制剂在宫颈癌、肝癌、胃部肿瘤等各种癌症及心血管疾病治疗方面均取得了令人满意的疗效，亦广泛用于病毒性肺炎、病毒性肠炎、病毒性结膜炎、病毒性心肌炎、柯萨奇CoxB病毒呼吸道感染、小儿秋季腹泻、急性型病毒性肝炎等。2005年版《中华人民共和国药典》一部已将莪术油收录为抗病毒药和抗癌药。温郁金(温莪术)系浙江产的名药材〃浙八味〃之一，以浙江温州产的为传统地道药材，历史悠久，知名度高。本实验研究人员通过动物实验研究发现，莪术C02超临界萃取物具有很好的抗菌抗病毒作用。
发明内容本发明的研究人员在动物试验中发现，莪术(A超临界萃取物具有很好的抗菌抗病毒作用。体外抗菌实验研究发现，莪术(A超临界萃取物体能明显抑制金黄色葡萄球菌的生长；体内抗菌实验显示，莪术(A超临界萃取物对金黄色葡萄球菌所致小鼠急性腹腔感染具有保护作用，并可使小鼠急性腹腔感染24h内致死率降低。抗病毒实验结果表明，莪术C02超临界萃取物具有一定的对抗A型流感病毒的作用，能降低感染小鼠的肺指数及感染小鼠的死亡率。本发明的目的是公开一种具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物。本发明的另一个目的是公开莪术C02超临界萃取物的制备方法。本发明通过以下方案实现—、制备方法1.取温莪术除去杂质，粉碎过筛，得到温莪术中粉(能全部通过四号筛，但混有能通过五号筛不超过60%的粉末)；2.取温莪术中粉，干燥去除水分；3.取一定重量的温莪术中粉，置于超临界萃取仪的萃取釜中，设置萃取参数，萃取温度4080。C，萃取压力1020MPa，C02动态流量1218kg/h，分离温度2040。C，分离压力2lOMPa;4.萃取1.04.Oh后，分别收集分离釜IIII中产物，合并得到C02超临界萃取物。温莪术药材经上述粉碎、干燥、超临界萃取，得到C02超临界萃取物。二、药理实施例为充分证明本发明莪术0)2超临界萃取物的药理作用，本发明研究人员以临床上治疗抗菌抗病毒效果好，并被认可的西药作为阳性对照药，进行了以下的药效学试验。本发明莪术由浙江中医药大学中药饮片厂提供，经鉴定为温郁金CurcumawenyujinY.H.ChenetC.Ling的干燥块根。1.抗菌实验1.l体外抗菌实验配制牛肉膏蛋白胨固体/液体培养基，pH7.47.6，12rC，20min高压灭菌，固体培养基倾置于90mm的平皿中待用。将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，挑取单菌落于25mL液体培养基中放于摇床37。C，150rpm培养18h。将上述菌液各取100yL(含菌量约为1.5*108CFU)涂布于平板上，正放20min。取5片直径为6mm的灭菌滤纸片均匀贴在平板上，外周4片加不同浓度的药液5iiL，中间1片加10个单位抗生素。将平皿置37t:恒温培养箱内正放l小时，倒置培养24h，测量滤纸片的抑菌圈直径。平行试验3次。实验数据经统计，具体结果见表1，表2。表1莪术C02超临界萃取物体外抑制金黄色葡萄球菌作用(n=10)Table1Out-of-bodyinhibitoryactionofC02superfluidextractionofcurcumazedoarytoSA(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>注+表示有抑菌圈形成-表示抑菌圈形成不明显X表示未进行实验莪术C02超临界萃取物体外抑制金黄色葡萄球菌实验结果见表1，青霉素对金黄色葡萄球菌有明显抑制作用，抑菌圈达1.65cm，庆大霉素对金黄色葡萄球菌亦有抑制作用，抑菌圈为O.67cm;莪术0)2超临界萃取物原液及其1/2稀释液对金黄色葡萄球菌有抑制作用，抑菌圈达到1.07cm、1.03cm。随着浓度降低，1/4稀释液及1/8稀释液抑菌作用不明显，没有抑菌圈形成。莪术C02超临界萃取物体外抑制大肠杆菌实验结果见表2，萃取物对大肠杆菌抑制作用不明显。阳性对照庆大霉素对大肠杆菌抑制作用，抑菌圈达O.70cm，而萃取物原液及稀释液对金黄色葡萄球菌无抑制作用。上述结果表明，莪术(A超临界萃取物对革兰氏阳性菌的抑菌效果较为明显，而对大肠杆菌为代表的革兰氏阴性菌效果并不明显，其主要抑菌机制有待进一步阐明。表2莪术C02超临界萃取物体外抑制大肠杆菌作用(n=10)Table2Out-of-bodyinhibitoryactionofC02superfluidextractionofcurcumazedoarytoBacilluscoli(n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注+表示有抑菌圈形成-表示抑菌圈形成不明显X表示未进行实验1.2.体内抗菌试验体内抗菌实验法是采用感染致病菌的动物模型(即模拟临床细菌感染疾病)进行抗菌药物实验治疗或预防，对抗菌药效作定量的评价。1.2.1细菌致小鼠最小100%MLD的测定将甘油保种的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别接于牛肉膏蛋白胨液体培养基，37t:，150rpm培养18h，划平板，37。C恒温培养箱内培养20h，挑取单菌落于新的培养基，37°C，150rpm培养4h，调节合适浓度。再将上述菌液用生理盐水稀释成含金黄色葡萄球菌菌体约为9.8X108、4.8X108、2.4X108、6X107个/mL四个浓度的菌液，含大肠杆菌约为2X109、1.0X109、9.8X108、4.8X108、6.0Xl()7个/mL四个浓度的菌液。备用。ICR小鼠80只，雌雄各半，随机分8组，标记。腹腔注射不同浓度的菌液，0.5mL/22g体重。观察动物的死亡情况。结果表明，48h内感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌小鼠的最小100%致死率(100%MLD)分别为4.8X108、1.0X109。以100%MLD的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌液供实验。1.2.2对细菌所致小鼠急性腹腔感染24h内致死率测定ICR小鼠40只，雌雄各半，随机分4组，标记。给药组为高、中、低剂组(剂量分别为102、68、34mgkg—0，模型组给予中剂量组相同体积的生理盐水，每组10只。各组小鼠腹腔注射金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，O.5mL/22g体重。注射菌液后，1，6，12h后各给药一次，尾静脉注射。观察指标为24h后小鼠死亡只数，计算死亡率。实验结果用f检验。细菌所致小鼠急性腹腔感染24h内致死率结果见表3，注射菌液后，动物发病明显。与模型性组比较，莪术(A超临界萃取物三个剂量组(剂量分别为102、68、34mg'kg一1)的感染小鼠的死亡率在绝对值上都降低。其中，中剂量组的死亡率最低，达到50%，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。表3对细菌所致小鼠急性腹腔感染24h内致死率测定(n=10)Table3Protectiveeffectofacuteabdominalcavityinfectedbybacterium(n=10)菌种组别剂量/(mg'kg—1)感染菌量/(MLD/CFU)死亡数死亡率％i3金葡模型组4.8X10810100齒萃取物组344.8X1088800.47萃取物组68U4.8X1085*500.03萃取物组1024.8X1087700.21大肠模型组4.8X10810100杆齒萃取物组344.8X10810100萃取物组684.8X10810100萃取物组1024.8X1089卯注与模型组比较*P<0.05**P<0.011.2.3对细菌所致小鼠急性腹腔感染的保护作用ICR小鼠144只，雌雄各半，随机分12组，标记。给药组尾静脉给予高、中、低剂量(剂量分别为102、68、34mgkg—0，模型组静脉给予中剂量组相同体积的生理盐水，阳性对照组分别为青霉素组(160U*kg—"，庆大霉素组(40U*kg—0。其中青霉素尾静脉给药，每天l次，连续给药7天。给药第四天，腹腔注射金黄色葡萄球菌菌液，0.5mL/22g体重。庆大霉素肌肉注射给药，每天1次，连续给药7天。给药第四天，腹腔注射大肠杆菌菌液，0.5mL/22g体重。每组停药后，观察14天，记录动物死亡情况。实验结果用f检验。感染后每天记录动物的发病情况。动物发病的定义拉稀便；肛周黏附有稀便、黏液或血液；毛松，活动少；进食少或不进食，出现以上症状的任一项即为发病。表4表明与模型性组比较，莪术油静脉乳剂三个剂量组(剂量分别为102、68、34mg*kg—0的感染小鼠的死亡率在绝对值上都降低。其中，高剂量组的死亡率最低，达到58.33%，与模型组比较具有显著性差异(P<0.05)。本实验中，体外抗菌与体内抗菌的实验结果一致。实验表明莪术(A超临界萃取物对金黄色葡萄球菌所致小鼠急性腹腔感染小鼠有治疗作用，可降低其死亡率。在对细菌所致小鼠急性腹腔感染24h内致死率彭响的实验中，莪术0)2超临界萃取物中剂量(68mgkg—1)对感染小鼠的治疗作用最显著，而在对细菌所致小鼠急性腹腔感染的保护作用的实验中，高剂量组(102mgkg—1)的治疗作用最显著。表4对细菌所致小鼠急性腹腔感染的保护作用(n=12)Table4Protectiveeffectofacuteabdominalcavityinfectedbybacterium(n=12)菌种__剂量感染菌量/(MLD/CFU)死亡数死亡率％尸金葡模型组1.QX10912100菌萃取物组34mg.kg"1.0X10912100萃取物组68mg-kg-i1.0X1091083.330.48萃取物组102mg'kg-11.0X109"58.330.22青霉素160U-kg-11.0X1097*58.330.04大肠模型组1.0X10912100杆菌萃取物组34mg.kg"1U)X10912100萃取物组68mg-kg-i1.0X10912100萃取物组102mg.kg-11.0X10912100庆大霉素组備-kg-11.0X109758.330.04注与模型组比较*P<0.05**P<0.01从上述结果表明，体内外抗菌实验结果均表明莪术0)2超临界萃取物具有抗金黄色葡萄球菌的作用。2.抗病毒实验2.1流感病毒致小鼠半数致死量的测定流感病毒经10日龄鸡胚传代，测定尿囊液中病毒效价为1:512，以10倍递减稀释成10—110—5，分别20iiL/只，滴鼻感染小鼠，每组10只，逐日观察，记录动物死亡数，24h内死亡者不计；死亡小鼠解剖观察肺脏病理变化，以确定其死亡是由流感病毒感染所致。用Muench法计算其LD5。为2.82，实验用10LD5。病毒量。2.2对小鼠体内感染流感病毒的保护作用ICR小鼠60只，雌雄各半，随机分6组，标记。给药组为高、中、低剂组(剂量分别为102、68、34mgkg—0，模型组给与中剂量给药组相同体积的生理盐水，阳性对照组为利巴韦林组(100mgkg—"，每组动物10只。模型组、给药组先给药3天，于第4天给药后在乙醚轻度麻醉下以10LD5。病毒量滴鼻感染小鼠，20i！L/只，正常对照组在同一条件下，用生理盐水代替病毒液滴鼻，再连续尾静脉给药3天，共给药7天。记录感染后14天内小鼠死亡数，并计算死亡率及平均存活天数。表5结果显示，与病毒对照组相比，对A型流感病毒感染小鼠引起的病毒性肺炎，萃取物组低、中剂量组在绝对数值上能降低感染小鼠的死亡率，低剂量组存在显著性差异(P<0.05)。表明莪术C02超临界萃取物具有一定的对抗A型流感病毒的作用。表5莪术C02超临界萃取物对小鼠体内感染流感病毒的保护作用Table5ProtectiveeffectofC02superfluidextractionofcurcumazedoarytomiceinfectedinfluenzabyvirus组别'"'-齐糧/mg-kg-1"动物死亡数死亡率/%尸正常组1000.病毒组1070利巴韦林1001000乳剂组34105承500.03乳剂组68io6600.09乳剂组102106600.09注与病毒组相比，*P<0.052.3对小鼠肺指数的影响ICR小鼠60只，雌雄各半，随机分6组，标记。给药组为高、中、低剂组(剂量分别为102、68、34mgkg—0，模型组给与中剂量给药组相同体积的生理盐水，阳性对照组为利巴韦林组(100mgkg—"，每组动物10只。模型组、给药组先给药2天，于第4天给药后在乙醚轻度麻醉下以10LD50病毒量滴鼻感染小鼠，20iiL/只，正常对照组在同一条件下，用生理盐水代替病毒液滴鼻，再连续尾静脉给药3天，共给药6天。观察指标逐日观察小鼠活动及进食死亡情况，并记录死亡动物数目。死亡动物立即称体重后解剖取肺，用生理盐水清洗后再用滤纸吸干后称重，逐个计算肺指数，并求出肺指数抑制率。给病毒后第7天禁食，8小时。第8天小鼠称重、解剖取肺，用生理盐水清洗后再用滤纸吸干称重，逐个计算肺指数，并求出肺指数抑制率。肺指数=肺湿重(g)/体重(g)X100%。肺指数值越大，表示肺部病变越严重。肺指数抑制率=(病毒对照组肺指数均值_试验组肺指数均值)/病毒对照组肺指数均值X100%表6的结果显示，与病毒对照组相比，对A型流感病毒感染小鼠引起的病毒性肺炎，莪术C02超临界萃取物三个剂量组在绝对数值上均能降低感染小鼠的肺指数；其中，低、中剂量组能显著降低感染小鼠的死亡率。具体结果见图1。表6莪术油静脉乳剂给药6天对小鼠肺指数的影响(S±s)Table6EffectofCZEOEonUmgIndexofmiceinfectedbyinfluenzavirus(x±s)组别齐U量/mg.kg—1死亡率/°/0P平均存活天数/d肺指数/gJ00g—1肺抑制率/%正常组09.0±0.00.662±0.111模型组68607.8±1.1BB2.183士0.732M利巴韦林100"'、.:0'9.0±0.0*1.475±0.408**32.44乳剂组3430**0.0048.2±1.51.823±0.45016.49乳剂组6840*0.0128.2±1.21.996±0.6468.58乳剂组10240*0.0127.6±1.82.077±0.6194.85注与病毒对照组相比JP<0.05，**P<0.01;与正常对照组相比，■<().05，P<0.018图1为莪术油静脉乳剂给药6天对小鼠肺指数的影响三、制备实施例1.取温莪术除去杂质，粉碎过筛，得到莪术中粉(能全部通过四号筛，但混有能通过五号筛不超过60%的粉末)；2.取温莪术中粉，干燥去除水分；3.称取3kg温莪术中粉，置于超临界萃取仪的萃取釜中，设置萃取参数，萃取温度5(TC，萃取压力16Mpa，C02动态流量16_18kg/h，分离温度35。C，分离压力为6MPa;4.萃取3.0h后，分别收集分离釜I分离釜III中产物，合并得到莪术C02超临界萃取物72.9g，其中P-榄香烯含量为11.09%。权利要求一种具有抗菌抗病毒作用的莪术CO2超临界萃取物及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤(1)取温莪术除去杂质，粉碎过筛，得到温莪术中粉(能全部通过四号筛，但混有能通过五号筛不超过60％的粉末)；(2)取温莪术中粉，干燥去除水分；(3)取一定重量的温莪术中粉，置于超临界萃取仪的萃取釜中，设置萃取参数，萃取温度40～80℃，萃取压力10～20MPa，CO2动态流量12～18kg/h，分离温度20～40℃，分离压力2～10MPa；(4)萃取1.0～4.0h后，分别收集分离釜I～HI中产物，合并得到CO2超临界萃取物。2.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于所用莪术品种为温莪术。3.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于莪术粉碎的颗粒为中粉(能全部通过四号筛，但混有能通过五号筛不超过60%的粉末)。4.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于萃取温度为4080°C。5.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于萃取压力为1020Mpa。6.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于C02动态流量为1218kg/h。7.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于分离温度为2040°C。8.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于分离压力为2lOMPa。9.根据权利要求1所述的具有抗菌抗病毒作用的莪术C02超临界萃取物的制备方法，其特征在于萃取时间为1.04.Oh。全文摘要本发明涉及一种具有抗菌抗病毒作用的莪术CO2超临界萃取物及其制备方法。莪术CO2超临界萃取物经过体外抗菌实验研究发现，莪术CO2超临界萃取物体能明显抑制金黄色葡萄球菌的生长；体内抗菌实验发现，其对金黄色葡萄球菌所致小鼠急性腹腔感染具有保护作用，并可使小鼠急性腹腔感染24h内致死率降低。抗病毒实验结果表明，莪术CO2超临界萃取物具有显著对抗A型流感病毒的作用，能降低感染小鼠的肺指数及死亡率。文档编号A61P31/00GK101745062SQ20081018196公开日2010年6月23日申请日期2008年11月28日优先权日2008年11月28日发明者吕圭源,吴素香,张园,林丽娅,赵丽珊,陈素红申请人:温州医学院