一种桂花降血糖有效部位及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：：一种桂花降血糖有效部位及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种桂花降血糖有效部位及其制备方法以及由该有效部位提取得到的有效成分及其制备方法，同时，还涉及该有效部位及有效成分的应用。
背景技术：
：糖尿病是一种以高血糖为特征，代谢紊乱为表现，与胰岛素分泌密切相关的全身性疾病，是由于遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。糖尿病主要分为两种类型I型糖尿病(即胰岛素依赖型糖尿病)和n型糖尿病(即非胰岛素依赖型糖尿病)，后者约占患者总数的99%_95%。糖尿病的临床表现为三多(多食、多饮、多尿)、一少(体重下降)及高血糖症状。糖尿病引起的并发症(如心血管、肾、视网膜和神经系统的慢性并发症、糖尿病酮症酸中毒、高渗性非酮症糖尿病昏迷等急性并发症)是导致患者死亡的主要原因，所有的糖尿病并发症可以通过严格血糖控制，从最大程度上进行预防，如果糖尿患者能将自己的血糖水平控制在接近正常的血糖范围内，则糖尿病并发症就不会出现，或者出现得比较晚并且程度也较轻。目前，我国糖尿病患者约1200万，全球约1.5亿，已成为威胁人类的第3号"健康杀手"，因此预防和治疗糖尿病已成为全球性的问题。多年来糖尿病的治疗主要以控制空腹血糖为目标，治疗药物长期以来主要集中于磺脲类与双胍类药物。近年来研究发现，餐后血糖也是糖尿病并发症发生的主要危险因子，餐后血糖是一天中血糖水平最高的阶段，其持续时间可达8小时之久或更长，长时间高水平的餐后血糖可加重糖尿病本身，使血糖进一步升高，如果在进餐时就能很好的控制高血糖，则可以避免其餐后血循环中的糖分堆积，因此，控制餐后血糖是控制高血糖、防治糖尿病的重要举措。现有的治疗糖尿病药物中，磺脲类药物通过刺激胰岛素的分泌而降低血糖；双胍类药物则是通过增加外周组织对葡萄糖的利用而降低血糖，两者对降低II型糖尿病病人空腹血糖均有较好疗效，但对降低餐后血糖的作用却非常有限。食物中的绝大多数碳水化合物为淀粉与蔗糖等，淀粉先后经唾液及胰液中oc-淀粉酶分解为寡糖，寡糖在小肠上皮细胞刷状缘处被ct-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖而被吸收后，导致餐后血糖高峰，因此，抑制a-葡萄糖苷酶的活性成为降低餐后血糖的一个有效途径。a-葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代后期研究开发出的一类新型口服降血糖药物，已三次被亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物。其作用机理在于竞争性的抑制CC-葡萄糖苷酶，延缓和阻碍碳水化合物的消化，延迟来自双糖、低聚糖及多糖的葡萄糖的吸收，有效推迟并减轻餐后血糖升高的时间及程度，长期服用还可以降低空腹血糖水平，此类药物对I、II型糖尿病均适用。《-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对糖尿病有确切的疗效，而且对于肥胖症、慢性乙肝、艾滋病及肿瘤都有一定的治疗作用。目前用于临床的此类药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。糖尿病是慢性疾病，在药物治疗的同时积极的养生、保健对患者病情的控制和生命质量的提高尤为重要，因而开发药品及具有特定功能的保健食品是糖尿病预防和辅助治疗的重要途径。现有的用于治疗糖尿病的药物成本较高，并具有明显的副作用如肠鸣、腹胀、恶心、呕吐等。传统中药及天然植物药具有相对安全和价格低廉的特点，开发中药及天然植物药作为a-葡萄糖酶抑制剂可以提供更广泛的糖尿病治疗药物来源；同时，我国大部分中药都具有药食两用之功效，可开发为保健食品对糖尿病进行预防和辅助治疗。桂花又名木犀、九里香、金粟，为木犀科常绿乔木。民间俗称的"桂花"泛指木犀科木犀属的多种植物。中国是该属植物的世界分布中心。据《中国植物志》统计，我国木犀属植物共25种，占全世界30种的80%以上，在我国已有2500年栽培历史，分布在南岭以北至秦岭淮河流域以南，北至山东半岛等地，形成了江苏苏州、湖北咸宁、四川成都、浙江杭州和广西桂林等历史上著名的五大桂花产区，年产干花100万公斤。桂花作为我国的名贵花木，其花香清雅，沁人心脾，除具有很高的观赏价值外，尚能食用、药用。明代李时珍《本草纲目》载"桂花生津、辟臭、化痰，治风火牙痛。"现代研究表明，桂花尚含有较高的营养价值，其总氨基酸含量高达3.78%，也常用于美容和食疗。桂花主要用于传统桂花食品和高档香料的生产，而桂花药用价值方面的应用尚没有报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种桂花降血糖有效部位。同时，本发明的目的还在于提供一种该降血糖有效部位的制备方法。本发明的目的还在于提供一种从桂花降血糖有效部位提取的降血糖有效成分；同时，还涉及了该有效成分的提取方法。更进一步地，本发明的目的还在于提供一种桂花及其有效部位及有效成分在降血糖方面的应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种桂花降血糖有效部位，该有效部位为由桂花(泛指木犀科木犀属桂花的花，包括四个品种群银桂类、金桂类、丹桂类、四季桂类内的金桂、丹桂、四季桂、佛顶珠等桂花的部位花)为原料，经粉碎、冷浸、过滤并经减压回收得浓縮物，浓縮物萃取后得到的乙酸乙酯部位和/或正丁醇部位。所述的有效部位优选为乙酸乙酯部位。本发明的技术方案还采用了一种桂花降血糖有效部位的制备方法，具体包括以及下步骤取干燥桂花0,fl"^n^/mgra朋Lour.(泛指木犀科木犀属桂花的花，包括四个品种群银桂类、金桂类、丹桂类、四季桂类内的金桂、丹桂、四季桂、佛顶珠等桂花的部位花)，粉碎，用丙酮与水或醇冷浸2—4次，每次5—9天，过滤，合并滤液，减压回收溶剂得浓縮物，将浓縮的提取物分散在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2—4次，得相应石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位。所述的丙酮与水的体积比为丙酮水=(6—8):(2—4)。所述的醇为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任意一种。另外，本发明的技术方案还采用了一种桂花降血糖有效成分及其制备方法，该有效成分为将有效部位——乙酸乙酯部位经过200300目硅胶柱色谱，以氯仿:甲醇(100:1—8:2)进行梯度洗脱，得到具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的部分；将该部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(20:l)洗脱，以TLC检测合并，经SephadexLH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物1熊果酸及化合物2齐墩果酸即为降血糖有效成分。更进一步地讲，本发明的技术方案还采用了一种桂花在降血糖方面的应用。本发明的技术方案还采用了一种桂花降血糖有效部位在降血糖方面的应用。本发明的技术方案还采用了一种桂花降血糖有效成分在降血糖方面的应用。本发明从桂花(包括木犀属的其他桂花品种)中提取具有cx-葡萄糖苷酶抑制活性物质的方法，并公开了桂花提取物及从中得到的化合物用于抑制cx-葡萄糖苷酶活性这种新的用途，为扩大降糖类药物的筛选范围，开发植物类降糖药品提供了新的途径。本发明的降血糖有效部位一乙酸乙酯提取物，具有明显的抑制a-葡萄糖苷酶的活性;从该有效部位得到的降血糖有效成分——熊果酸和齐墩果酸也具有很高的a-葡萄糖苷酶抑制活性，IQ。值(半数抑制率)为0.003吗mL'1，在相同条件下比临床常用的降糖药阿卡波糖(IC5o为1081.27吗.mU1)的a-葡萄糖苷酶抑制活性要好的多。桂花有效成分经结构鉴定为熊果酸和齐墩果酸，来自任何含有熊果酸和齐墩果酸的原料药。齐墩果酸和熊果酸在植物中分布广泛且易得，这就使得本发明的原料易得，成本很低。桂花作为我国特有的植物，具有药食两用之功效，实验研究表明桂花提取物具有良好的a—葡萄糖苷酶抑制活性，其本身既可作为保健品对糖尿病进行辅助治疗，又可对其进行进一步研究开发，制备天然的a-葡萄糖苷酶抑制剂。实验研究表明桂花在医药领域中用于可用于抑制a-葡萄糖苷酶活性，桂花提取物具有cx-葡萄糖苷酶抑制活性，其提取物特别是脂溶性部位提取物及其从中得到的有效成分化合物的活性强度与目前广泛使用的降血糖药物阿卡波糖更高。具体实施方式实施例l本实施例为桂花各有效部位的提取方法及初步活性筛选有效部位的提取方法具体为取干燥金桂(1.9kg)，粉碎，用丙酮与水(体积比为7:3)/醇冷浸3次，每次7天，过滤，合并滤液，减压回收溶剂得浓縮物；将浓縮的提取物分散在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，得相应提取物10g、33.4g、400g。本实施例中提取所用的醇优选为乙醇。活性测定方法微孔板法原理a-D-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-oc-D-吡喃葡萄糖苷(PNP-G)，产生硝基苯酚(PNP，黄色物质，在400m左右有最大吸收)，a-糖苷酶抑制剂可抑制oc-葡萄糖苷酶与底物结合从而降低PNP的释放量。以一定时间内反应体系中PNP的含量变化来计算提取物的酶抑制活性。仪器MultiskanMK3酶标仪(热电上海仪器有限公司)，96微孔板，各种规格移液器，LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)。试齐U:a-葡萄糖苷酶(Sigma公司，EC3.2.1.20，frombaker'syeast，批号105K1313),对-硝基苯基-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Sigma公司，批号026K1516),磷酸盐缓冲液(PH6.8)，阿卡波糖(拜糖平，Sigma公司，批号16869)，其他试剂均为分析纯。112L磷酸钾缓冲液(pH6.8)，加入20fiL(浓度为0.2U/mL)cc-葡萄糖苷酶，8(iL样品溶液，37。C恒温15min，加入20(iL2.5mmol/LPNPG，37°C恒温反应15min。再加入80(iL(浓度为0.2mol/L)的终止剂Na2C03溶液，于405nm波长下测OD值。实验共设4个组，每组三孔，分别为a.阴性对照组；b.空白组；c.样品测定组；d.样品对照组。按下面方法计算抑制率，并用Origin软件求出相应IC50值。抑制率计算/o/o=l-(O"样品组—O"样品对照组)x，％((9D阴性对照组一0^空白组)实验结果如表1所示桂花乙酸乙酯和正丁醇提取物都比临床常用的降糖药阿卡波糖的a-葡萄糖苷酶抑制活性要好的多，且半数抑制率ICs()更确切显示乙酸乙酯提取物可作为滇丁香抑制d-葡萄糖苷酶的有效部位。表1桂花不同提取物的cx-葡萄糖苷酶抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注ND为未测定实施例2本实施例为在活性指导下，从桂花乙酸乙酯有效部位制备降血糖有效成分活性化合物的方法降血糖有效成分的制备方法具体如下将乙酸乙酯部分33.4g经过200300目硅胶柱色谱，以氯仿:甲醇(100:1—8:2)进行梯度洗脱，得到具有抑制cc-葡萄糖苷酶活性的部分；将该部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(20:l)洗脱，以TLC检测合并，经SephadexLH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物l(100.2mg)，2(11.2mg)。实施例3本实施例为从桂花中得到的化合物抑制cc-葡萄糖苷酶的活性测定。测定方法同实施例1。测定结果实验结果见表2。熊果酸和齐墩果酸的抑制CC-葡萄糖苷酶的活性高达107.0%，且半数抑制率仅为0.003吗mL—1，比临床常用的降糖药阿卡波糖的a-葡萄糖苷酶抑制活性要好的多，可作为桂花抑制《-葡萄糖苷酶活性的主要药效成分进行开发。并可进一步详细探讨活性组分的降糖活性与化学结构的关系，对发现高效、安全的降低餐后血糖新药物具有重要作用。表2桂花中化合物的a-葡萄糖苷酶抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注Acarbose的初筛终浓度为1.5mgmI/1实施例4本实施例为桂花中具有oc-葡萄糖苷酶抑制作用的活性成分的结构鉴定。化合物l:白色粉末，mp305308。C。EIMSw/z(%):456[M]+(20)，410(8)，248(100)，233(30)，213(75)，175(33)，131(30)，119(40)，105(45)，91(35)。雇R(400MHz,C5D5N)和13CNMR(100MHz，C5D5N)数据与文献报道一致，确定化合物l为熊果酸(ursolicacid)化合物2:白色粉末，'H-NMR(400MHz，C5DsN)图谱中存在55.49(lH，brs)烯键质子信号；50.88(3H，s)、0.95(3H，s)、0.98(3H，s)、1.05(3H，s)、1.22(3H，s)、1.24(3H，s)7个甲基信号。13C-NMR(400MHz，C5D5N)图谱中存在30个碳信号，显示出五环三萜结构类型。其中，1个羰基信号(S179.9)，1对双键碳信号(5144.7和122.4)，该双键化学位移显示该化合物为齐墩果酸类型三萜骨架。其波普数据与文献一致，鉴定化合物为齐墩果酸(Oleanolicacid)。权利要求1、一种桂花降血糖有效部位，其特征在于该有效部位为由桂花为原料，经粉碎、冷浸、过滤并经减压回收得浓缩物，浓缩物萃取后得到的乙酸乙酯部位和/或正丁醇部位。2、根据权利要求l所述的桂花降血糖有效部位，其特征在于所述的有效部位优选为乙酸乙酯部位。3、一种如权利要求l所述的桂花降血糖有效部位的制备方法，其特征在于包括以及下步骤取干燥桂花，粉碎，用丙酮与水或醇冷浸2—4次，每次5—9天，过滤，合并滤液，减压回收溶剂得浓縮物，将浓縮的提取物分散在水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取2—4次，得相应石油醚部位、乙酸乙酯部位及正丁醇部位。4、根据权利要求3所述的桂花降血糖有效部位的制备方法，其特征在于所述的丙酮与水的体积比为，丙酮水=(6—8):(2—4)。5、根据权利要求4所述的桂花降血糖有效部位的制备方法，其特征在于所述的醇为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任意一种。6、一种桂花降血糖有效成分，其特征在于该有效成分为将有效部位一—乙酸乙酯部位经过200300目硅胶柱色谱，以氯仿:甲醇(100:1—8:2)进行梯度洗脱，得到具有抑制cc-葡萄糖苷酶活性的部分；将该部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(20:1)洗脱，以TLC检测合并，经SephadexLH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物1熊果酸及化合物2齐墩果酸即为降血糖有效成分。7、一种如权利要求6所述的桂花降血糖有效成分的制备方法，其特征在于该有效成分的制备方法具体包括以下步骤将有效部位——乙酸乙酯部位经过200300目硅胶柱色谱，以氯仿:甲醇(100:1—8:2)进行梯度洗脱，得到具有抑制a-葡萄糖苷酶活性的部分；将该部分经硅胶H柱色谱，石油醚-丙酮(20:1)洗脱，以TLC检测合并，经SephadexLH-20柱色谱，丙酮洗脱，得到化合物1熊果酸及化合物2齐墩果酸即为降血糖有效成分。8、一种桂花在降血糖方面的应用。9、一种由桂花所制备的桂花降血糖有效部位在降血糖方面的应用。10、一种由桂花降血糖有效部位制备的桂花降血糖有效成分在降血糖方面的应用。全文摘要本发明公开了一种桂花降血糖有效部位及其制备方法和应用，该有效部位为由桂花为原料，经粉碎、冷浸、过滤并经减压回收得浓缩物，浓缩物萃取后得到的乙酸乙酯部位和/或正丁醇部位。本发明的降血糖有效部位—乙酸乙酯提取物，具有明显的抑制α-葡萄糖苷酶的活性；从该有效部位得到的降血糖有效成分——熊果酸和齐墩果酸也具有很高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC₅₀值(半数抑制率)为0.003μg·mL^-1，在相同条件下比临床常用的降糖药阿卡波糖(IC₅₀为1081.27μg·mL^-1)的α-葡萄糖苷酶抑制活性要好的多。文档编号A61K31/56GK101406498SQ20081023096公开日2009年4月15日申请日期2008年11月20日优先权日2008年11月20日发明者宋艳丽,康文艺,王金梅申请人:河南大学