专利名称：：从酸枣仁中提取抗焦虑物质的方法
技术领域：
：本发明涉及医药，特别是一种从酸枣仁中提取抗焦虑物质的方法。二、
背景技术：
酸麥仁为鼠李禾斗植物酸麥[ZiziphusjujubaMill.Var,柳'/osa(Bunge)HuexH.F.Chou]的干燥成熟种子，其味酸性平，归肝、胆、心经，主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症，为中医常用安神药。随着科学技术的发展，对酸枣仁有了深入的研究，发现酸枣仁中主要含黄酮类和皂苷类成分，这两类成分可以通过乙醇回流提取获得，已经发现酸枣仁醇提物具有抗焦虑作用，从酸枣仁中提取抗焦虑物质是制备抗焦虑药物的有效途径，因此，如何从酸枣仁中提取黄酮和皂苷类抗焦虑物质为人们所重视。近年来，虽有多种从酸枣仁提取黄酮、皂苷类成分的方法，但由于提取率低，成本高，提取过程使用有毒试剂，不能达到工业生产要求而未得到有效应用，因此，研制新的方法势在必行。三、
发明内容针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种从酸枣仁中提取抗焦虑物质的方法，可有效解决提取率低，成本高，资源浪费大的问题，其解决的技术方案是，对树脂进行预处理，即用乙醇对树脂进行浸泡，使其充分溶胀，湿法装柱，用乙醇洗脱至流出液加水不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱至无醇味，将捣碎的酸枣仁用乙醇回流提取3次，合并滤液，减压回收，再将浓縮液经上述处理过的树脂进行纯化，减压干燥得固体物，即酸枣仁抗焦虑物质，本发明方法独特，特别是用D101大孔吸附树脂对酸枣仁醇提物中黄酮、皂苷类成分进行同步纯化，至今未见有任何报导，本发明为首创，该方法总黄酮得率高，纯化度高，有效保证了酸枣仁醇提物的质量和用于制备抗焦虑药物的疗效，为制备酸枣仁制备抗焦虑药物作出创造性贡献，造福于人类。四具体实施方式以下结合实施情况，对本发明的具体实施方式作详细说明。本发明在实际生产中，是由以下步骤实现的-1、对树脂进行预处理，方法是将D101大孔吸附树脂加其重量体积10倍的95%乙醇浸泡24h,使其充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇洗脱至流出液1份加5份水(体积比)不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱，至无醇味，流速为2ml/min，备用；2、对炒酸枣仁乙醇回流提取，方法是，对酸枣仁炒制后，将炒制的酸枣仁捣碎，用乙醇回流提取三次，每次2h,每次用药物重量体积(即炒酸枣仁用g计，乙醇用ml计)8倍量的80%乙醇，合并三次滤液，减压回收，得5倍原药物重量体积的浓縮药液，备用；3、用D101大孔吸附树脂对浓縮药液进行纯化，得纯化酸枣仁抗焦虑物质，方法是，对上述浓縮药液上预处理好的D101大孔吸附树脂进行纯化，流速为2.2mL/min，纯化后静置2h，用蒸馏水洗脱至无色，苯酚-硫酸显阴性为止，再用4倍量树脂床体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2ml/min，收集洗脱液，减压干燥得固形物，即为酸枣仁抗焦虑物质，测定固形物中含酸枣仁总黄酮38.96%。本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出的方法步骤实现实施例11、对树脂进行预处理，方法是称取D101大孔吸附树脂100g，加1000mL的95%乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇洗脱至流出液1份加5份水(体积比)不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱，至无醇味，流速为2ml/min，备用；2、对炒酸枣仁乙醇回流提取，方法是，对酸枣仁炒制后，将炒制的酸枣仁100g捣碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用800ml80%乙醇，合并三次滤液，减压回收，得500ml浓縮药液，备用；3、用D101大孔吸附树脂对浓縮药液进行纯化，得纯化酸枣仁抗焦虑物质，方法是，对上述浓縮药液上预处理好的D101大孔吸附树脂进行纯化，流速为2.2mL/min，纯化后静置2h，用蒸馏水洗脱至无色，苯酚-硫酸显阴性为止，再用4倍量树脂床体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2ml/min，收集洗脱液，减压干燥得固形物，即为酸枣仁抗焦虑物质，测定固形物中含酸枣仁总黄酮38.96%。实施例21、对树脂进行预处理，方法是称取D101大孔吸附树脂200g，加2000mL95呢乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇洗脱至流出液1份加5份水(体积比)不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱，至无醇味，流速为2ml/min，2、对炒酸枣仁乙醇回流提取，方法是，对酸枣仁炒制后，将炒制的酸枣仁200g捣碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用1600ml80%乙醇，合并三次滤液，减压回收，得1000ml浓縮药液，备用；3、用D101大孔吸附树脂对浓縮药液进行纯化，得纯化酸枣仁抗焦虑物质，方法是，对上述浓縮药液上预处理好的D101大孔吸附树脂进行纯化，流速为2.2mL/min，纯化后静置2h，用蒸馏水洗脱至无色，苯酚-硫酸显阴性为止，再用4倍量树脂床体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2ml/min，收集洗脱液，减压干燥得固形物，即为酸枣仁抗焦虑物质，测定固形物中含酸枣仁总黄酮38.96%。实施例31、对树脂进行预处理，方法是称取D101大孔吸附树脂300g，加3000mL的95。/。乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇洗脱至流出液1份加5份水(体积比)不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱，至无醇味，流速均为2ml/min，备用；2、对炒酸枣仁乙醇回流提取，方法是，对酸枣仁炒制后，将炒制的酸枣仁300g捣碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用2400ml80%乙醇，合并三次滤液，减压回收，得1500ml浓縮药液，备用；3、用D101大孔吸附树脂对浓縮药液进行纯化，得纯化酸枣仁抗焦虑物质，方法是，对上述浓縮药液上预处理好的D101大孔吸附树脂进行纯化，流速为2.2mL/min,纯化后静置2h，用蒸馏水洗脱至无色，苯酚-硫酸显阴性为止，再用4倍量树脂床体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2ml/min，收集洗脱液，减压干燥得固形物，即为酸枣仁抗焦虑物质，测定固形物中含酸枣仁总黄酮38.96%。根据上述方法和比例关系，可以制得任意量的酸枣仁抗焦虑物质，本发明酸枣仁醇提物可有效用于制备治疗抗焦虑药物的应用，其方法科学，节约资源，得率高、纯度高，治疗焦虑症效果好，并经试验取得了满意的效果，有关试验资料如下一、正交实验优选酸枣仁纯化工艺吸取按1项操作所得酸枣仁浓縮药液100mL，按照正交表中条件上柱(预处理好的树脂)，穿透树脂吸附2次，吸附完，静止2h后，再用蒸馏水洗脱，除糖类成分，接流份，没有颜色且苯酚-硫酸反应检识，显阴性为止。再按正交表中条件用乙醇液洗脱，收集洗脱液，减压干燥，恒重，得总黄酮和总皂苷纯化物。测定纯化物中总黄酮含量(以卢丁计)、酸枣仁皂苷A的含量，综合优选工艺。因素水平见下表l:表l"(34)因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>二、含量测定2.1总黄酮含量测定2.1.l标准曲线的绘制精密称定芦丁对照品10.42mg，力口70%乙醇配成0.2084mg/mL的标准品溶液。吸取芦丁溶液l.5mL和样品溶液5.0mL，分别置于25mL量瓶中，加入O.2mo1'L三氯化铝溶液2.5mL和lmolL醋酸钾溶液5.0mL,力口70%乙醇至刻度，摇匀，放置10min。用紫外一可见分光光度在200550nm处扫描，结果标准品和样品液均在272nm处有最大吸收波长(272±1)nm。再精密吸取O.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL芦丁对照品液按以上操作，在272nm处测定吸光度。以浓度X对吸收度y进行直线回归，得回归方程Y二0.0426X-0.0017，r=0.9998，线性范围4,16825,008ug/mL。2.1.2精密度实验吸取对照品溶液1.0mL，按以上方法，连续测定5次，吸收度RSD。/cF0.32，表明仪器精密良好。2.1.3重现性试验称取同一样品5份，按样品处理方法平行制备，测定吸收度，RSD%=0.77。2.1.4回收率试验吸取已知含量同一样品液5份，等量加入对照品，平均回收率为100.06%，RSD%=2,43。2.1.5稳定性考察将样品每隔2h测定吸收度一次，结果12h内基本稳定，RSD%=2.1。2.1.6供试品溶液的测定精密称取已恒重的正交样品粉末，加70%乙醇配成0.2mg/mL溶液。按标准曲线方法测定，计算含量。2.2酸枣仁皂苷A含量测定2.2.1标准曲线的绘制精密称取酸枣仁皂苷A5.17mg，加甲醇配制成0.5170mg/ml溶液。精密吸取1、2、3、4、5、6ul点于硅胶G板上，以正丁醇—冰醋酸一水(4:1:5)上层展开，展距9cm，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液，105'C烘至显天蓝色斑点。稍冷，盖一干净玻璃板，在最大吸收波长631nm处扫描峰面积。以点样量对峰面积做回归方程，得Y=2057.4X-301.4，r=0.9967，线性范围0.51703.102mg/mL。2.2.2精密度试验精密吸取对照品3uL，6份，点于同一薄层板上，展开，晾干，显色，扫描峰面积，RSD%=4.88。2.2.3重现性试验取同一样品5份，按相同方法处理，扫描峰面积，RSD%=4.32。2.2.4回收率试验称取已知含量的样品粉末3份，50mg，精密加入对照品1.2mg，溶解，按样品处理方法制备，平均回收率98.72%，RSD%=3.45。2.2.5稳定性试验4h内基本稳定，峰面积RSD%=2.32。2.2.6供试品溶液的测定精密称取纯化物50mg，加甲醇超声溶解，定容得5mg/ml左右溶液。精密吸取标准品1nL、3uL与样品15uL交叉点于同一薄层板上，按标准曲线方法操作，测定峰面积，以外标两点法计算含量。三、实验结果见实验结果U(3)4表2和方差分析表3、4。实验号ABCD总黄酮含量酸枣仁皂苷A含量1iiii38.962122231.751.763133329.551.124212327.693.495223126.692.7862312'34.461.697313223.651.248321331.581.969332129.781.80H总黄酮方差分析表离差平方和自由度均值F值PA41.960867220.98043314.27〉0.05B107.3966600253.69830036.51<0.05C8.42206724.2110332.86>0.05D2.94126721.470633表4酸枣仁皂苷A方差分析表离差平方和自由度均值F值PA1.722220.86112.75〉0.05B1.167020.58351.86〉0.05C1.056320.52811.68〉0.05D0.627320.3136从总黄酮含量来看，因素影响顺序为B〉A〉C〉D,即吸附时间〉干树脂生药〉洗脱液浓度〉洗脱液用量，其中B因素有显著性影响。从正交表中结果，选择AACA最优。从酸枣仁皂苷A来看，因素影响顺序为A>B〉C〉D，即干树脂生药〉吸附时间〉洗脱液浓度〉洗脱液用量，最优选择A2BAD,。综合以上，考虑醇提物的纯度(总黄酮+酸枣仁皂苷A)，选择正交实验l纯化条件，即用相当于生药l倍量的干树脂，0.2g/mL药液上样流速为2.2mL/min，用4倍量树脂床体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥。四、结论酸枣仁抗焦虑物质最佳工艺为称取捣碎炒酸枣仁，加8倍量80%乙醇，回流三次，每次2h，滤液回收至相当于原药材0.2g/mL。将相当于生药l倍量的干树脂用95。/o乙醇浸泡24h，充分溶胀，湿法装柱，乙醇和水处理后，药液上样，流速为2.2mL/min，上样完静置2h，水洗至洗脱液无色，苯酚-硫酸显阴性为止，再用4倍量树脂床体积的50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压干燥即可。五、本发明的优势5.1工艺新颖酸枣仁中的有效成分为皂苷和黄酮类，研究表明，乙醇回流提取酸枣仁皂苷和黄酮类成分时，用60%的醇提取皂苷最佳，80%乙醇提取黄酮类含量最高。本发明中，酸枣仁中抗焦虑物质以黄酮类成分为获取目标。首次运用D101大孔吸附树脂对酸枣仁中黄酮、皂苷类成分同步纯化，实验测得，纯化前所得固形物中总黄酮含量为10.03%，纯化后含量为38.96%,纯度提高288.43%，纯化效率高。5.2药效值得肯定在本发明中，前期采用传统方法所得酸枣仁醇提物，给甲状腺所致阴虚小鼠，剂量55mg/kg"d—i才取得抗焦虑效果。而现采用本发明提取、纯化，所得醇提物，仅用12.5mg/kg，d—、就取得抗焦虑疗效，这大大减小在制剂中的用量，节约了原料，且提高了疗效。5.3工艺安全无毒关于酸枣仁中黄酮类成分提取、纯化工艺，传统多采用石油醚脱脂，乙醇提取、正丁醇萃取，此过程采用有毒试剂，造价高，大生产无法实现。而本发明不经过有毒试剂，安全，能满足工业生产，而且经济、高效，经济和社会效益巨大。权利要求1、一种从酸枣仁中提取抗焦虑物质的方法，其特征在于，由以下步骤实现的(1)、对树脂进行预处理，方法是将D101大孔吸附树脂加其重量体积10倍的95％乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装柱，用95％乙醇洗脱至流出液1份加5份水不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱，至无醇味，流速为2ml/min，备用；(2)、对炒酸枣仁乙醇回流提取，方法是，对酸枣仁炒制后，将炒制的酸枣仁捣碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用药物重量体积8倍量的80％乙醇，合并三次滤液，减压回收，得5倍原药物重量体积的浓缩药液，备用；(3)、用D101大孔吸附树脂对浓缩药液进行纯化，得纯化酸枣仁抗焦虑物质，方法是，对上述浓缩药液上预处理好的D101大孔吸附树脂进行纯化，流速为2.2mL/min，纯化后静置2h，用蒸馏水洗脱至无色，苯酚-硫酸显阴性为止，再用4倍量树脂床体积的50％乙醇洗脱，洗脱流速为2ml/min，收集洗脱液，减压干燥得固形物，即为酸枣仁抗焦虑物质，测定固形物中含酸枣仁总黄酮38.96％。2、根据权利要求1所述的从酸枣仁中提取抗焦虑物质的方法，其特征在于，由以下步骤实现(1)、对树脂进行预处理，方法是称取D101大孔吸附树脂100g，加1000mL的95。/。乙醇浸泡24h，使其充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇洗脱至流出液1份加5份水不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱，至无醇味，流速为2ml/min，备用；(2)、对炒酸枣仁乙醇回流提取，方法是，对酸枣仁炒制后，将炒制的酸枣仁100g捣碎，用乙醇回流提取三次，每次2h，每次用800ml80%乙醇，合并三次滤液，减压回收，得500ml浓縮药液，备用；(3)、用D101大孔吸附树脂对浓縮药液进行纯化，得纯化酸枣仁抗焦虑物质，方法是，对上述浓縮药液上预处理好的D101大孔吸附树脂进行纯化，流速为2.2mL/min，纯化后静置2h，用蒸馏水洗脱至无色，苯酚-硫酸显阴性为止，再用4倍量树脂床体积的50%乙醇洗脱，洗脱流速为2ml/min，收集洗脱液，减压干燥得固形物，即为酸枣仁抗焦虑物质，测定固形物中含酸枣仁总黄酮38.96%。全文摘要本发明涉及从酸枣仁中提取抗焦虑物质的方法，可有效解决提取率低，成本高，资源浪费大的问题，其解决的技术方案是，对树脂进行预处理，即用乙醇对树脂进行浸泡，使其充分溶胀，湿法装柱，用乙醇洗脱至流出液加水不出现混浊为止，再用蒸馏水洗脱至无醇味，将捣碎的酸枣仁用乙醇回流提取3次，合并滤液，减压回收，再将浓缩液经上述处理过的树脂进行纯化，减压干燥得固体物，即酸枣仁抗焦虑物质，本发明方法独特，特别是用D101大孔吸附树脂对酸枣仁醇提物中黄酮、皂苷类成分进行同步纯化，至今未见有任何报导，该方法总黄酮得率高，纯化度高，有效保证了酸枣仁醇提物的质量和用于制备抗焦虑药物的疗效，为制备酸枣仁制备抗焦虑药物作出创造性贡献，造福于人类。文档编号A61K36/185GK101401855SQ200810230920公开日2009年4月8日申请日期2008年11月17日优先权日2008年11月17日发明者菊刘,瑛崔申请人:河南中医学院