具有高含量的1，25-二羟基维生素D₃糖苷和槲皮甙的粉绿叶茄植物提取物的制备及其应用的制作方法

专利名称：具有高含量的1，25-二羟基维生素D₃糖苷和槲皮甙的粉绿叶茄植物提取物的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉 及具有高含量1，25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇，尤其是槲皮甙 的粉绿叶茄植物浓缩的且平衡的植物提取物的制备。本发明具体记载了一种既适用于工 业规模又适用于实验室规模的制备这种植物提取物的方法。此外，本发明还记载了该植 物提取物或类似的(合成的)组合物的用途，其可以用于预防和治疗骨量减少相关的疾 病，例如骨质减少或骨质疏松，其还可以用于预防和治疗胫骨软骨发育异常，尤其是家 禽胫骨软骨发育异常，其还可用于治疗产乳热，此外其还可以用作人体或动物的食品补 充剂。在个体的整个生命周期，健康的骨都处于骨吸收和骨形成的微妙平衡中，以使 骨骼适应需求的变化。这种平衡使得骨骼在童年期生长，这可以通过头骨的生长直观地 看出，头骨生长时矿物质沉积在头骨外侧而骨质则被吸收到头骨内侧进而为脑部生长提 供空间。成年期时，骨可以自行加强以适应体育运动或者负担重物时负重的变化。骨重 建过程具有一个典型的顺序骨吸收破骨细胞进入到特定区域的表面并开始吸收骨质材 料。该过程的结果是形成陷窝或突起。骨形成成骨细胞进入到突起位置，并沉积新的骨 质材料。这种循环周期结束后会留下更坚固的骨结构。然而，在老年人或绝经后女性 中，这种平衡会朝向骨质净流失方向发展。长期卧床休养或者处于低重力状态下也会发 生骨质流失。如

图1所示，骨量峰值出现在中年期，然后就缓慢下降。对于女性，在雌 性激素停止分泌的绝经期之后骨量流失会加速发展。骨量流失通常被诊断为骨质疏松或 骨质减少(骨质疏松的早期形式)，其中骨质疏松症已经成为预期寿命较长人群的主要健 康问题，特别是在西方社会。不仅人体，年老的动物或者正处在快速成长期的年幼动物也会遭受到与骨形成 受损相关的疾病。例如，动物(尤其是处在快速成长期的食用动物，例如家禽)的腿衰 弱以及由此造成的胫骨软骨发育异常(简称“TD”)是导致肉质流失和肉品质下降的 主要原因。此外，出于动物福利方面的考虑，也必须要避免胫骨软骨发育异常(参见 publication Tibial Dyschondroplasia, a Poultry Leg Problem.Rath NC, USDA/ARS，Poultry Production and Product Safety Research, Poultry Science Center, University of Arkansas, USA(09/04/2003))。此外，因为生产蛋壳的原因，产卵鸡具有大量的钙质代谢。产卵 鸡每天需要从营养物中补充吸收将近为动物钙质储量十分之一的钙质，并将这些钙质储 存到骨质中然后在生产蛋壳期间的数小时内通过代谢方式来利用这些钙质。因此，未适 当的补充维生素D也可能导致产卵鸡的骨质疏松。现有技术已经建议了许多方法来用于防止年龄相关的骨质流失和女性绝经后的 骨质流失，例如通过体育锻炼和药物治疗方式来治疗骨质疏松。目前，药物治疗通常是 根据治疗方法进行，其中治疗是在已经诊断出病理症状后才开始进行，例如骨质量或者 骨密度已经下降到它们必要的最小水平时，或者最坏的情形，骨折时。因此，预防出现 骨质量或者骨密度低于必要的最小量将是优选的治疗方式，但应该在骨密度仍处于较高水平时就开始治疗并且该治疗应该持续较长时间，例如，如图1所示的。因此，可以维 持生理机制并采用天然来源的药物进行治疗的方式是对于采用合成药物进行治疗的方式 的有价值的替换方案。到目前为止，抗 骨质疏松药根据不同的作用机制通常可以分为抗吸收剂，同 化激素类或者激素留类，骨形成剂以及其它药物。此外，抗骨质疏松药也可以根据化学 结构进行分类，但这些化学结构通常与上面列出的一个作用机制相对应。已知的抗骨质 疏松药例如包括，双磷酸盐类、合成的雌激素、维生素D以及它的代谢产物等。目前，大部分的处方药都属于双磷酸盐类，这类药物作用于骨吸收破骨 细胞从而减少骨吸收(参见例如Fleisch H.等人，Endocrine Reviews(1998) 19(1) 80-100Bisphosphonates Mechanisms of Action)。用双磷酸盐类药物治疗的一个缺点是其 会阻碍骨代谢进而减少骨重建。绝经后出现骨质量大量流失这一现象可以证明雌性激素对于骨质也具有很强的 作用。因此，使用合成的雌激素进行激素替代疗法也是治疗骨质疏松的有效方法。但是 该治疗方法仅适用于女性，目前已经不推荐使用该方法，因为大量临床研究显示该方法 具有提高乳腺癌发生率的副作用。一种更符合生理机制从而更有前景的方法是通过维持患者的钙质调节从而维持 患者天然骨矿物存储来预防或者治疗上述疾病。钙质调节和正常的骨矿物存储涉及到许多因素。对钙质平衡起作用的药物包括 例如激素类，比如激素降钙素或者甲状旁腺激素以及它们的合成衍生物。但是这些肽激 素不能口服，而需要注射或者鼻腔吸入，因此会造成患者使用不便。动物和人体钙质调节(包括天然骨矿物的存储)最重要的因素是钙，所述钙通常 优选地以可溶性盐或者Ca2+的形式存在。除前面所说作用外，钙也是细胞内信号传导、 神经冲动传递和肌肉收缩的重要介质(Cashman等人，Novartis Found Symp.2007，282 123-38，discussion 138-42，212-8;禾Π Parfitt AM.Bone. 1987，8Suppl.l Sl-8)。人体或 动物体内钙供应不足可以导致钙聚集物从而使得骨质量或者骨密度低于最小的必要量。 另一方面，若没有进行有效调节，人体或动物体内的钙浓度可能达到过高浓度，这会干 扰细胞内信号的传导、神经冲动的传递和肌肉收缩，或者产生毒副作用。因此，所有的 温血动物都有一套严格的调节系统以预防体内出现有毒的钙聚集物。天然骨矿物存储钙调节的另外一个主要物质是维生素D。维生素D是促使骨质 良好发育所必须的营养素，这一点可以从它能防止和治愈佝偻病中得到证明，已知可以 使用维生素D代谢产物的天然和非天然的衍生物来防止和治疗佝偻病。但是，胆钙化 甾醇(维生素03)或者麦角钙化留醇(维生素D2)形式的天然存在的维生素D不具有生 物活性。因此，就如在共识会议(Osteoporosis Prevention, Diagnosis, and Therapy.NIH Consens Statement Online 2000March 27-29 ; 17(1) 1-36)中所说的，天然存在的维生素 D不能治疗缓慢发展的骨疾病，例如骨质疏松病。这是因为天然存在的维生素D需要经 过两个转化步骤才能转化成有活性的物质，其中第二个步骤受到严格调整。根据第一个 步骤，在皮肤中形成或者通过消化摄入后，胆钙化留醇(维生素D3)在人体或动物体的肝 脏中转化成它的存储形式25-羟基维生素D3(缩写“25(OH)D3”)。充分存储维生素込 可以保护人体在2-3个月内免遭佝偻病。但是，该存储形式的维生素D3仍然不具有生物活性，其需要在第二个步骤中通过肾脏酶活化成活化形式的维生素D3,也就是1，25-二 羟基维生素D3 (缩写“1，25 (OH)2D3"，骨化三醇)。活化形式的1，25-二羟基维生素 D3然后在敏感组织中激活基因产物。在肠中，该基因产物是钙结合蛋白，这种钙结合蛋 白最终可以从食物中吸收钙。所形成的具有活性的代谢产物1，25-二羟基维生素D3进 一步调控钙质在肠道中的吸收和沉积，以及骨质到钙质的代谢过程。
尽管如此，这种天然的调控机制经常无法在人体或动物体内产生足够浓度的具 有活性的代谢产物以预防缓慢发展的骨疾病，例如骨质疏松病，尤其是在老年人中，或 者不能预防动物体内的其它疾病，例如家禽中的胫骨软骨发育异常。从第一次发现该活性成分开始，已经尝试了利用各种方法来提供作为药品使用 的维生素D3,因为维生素D3在营养物中的含量并不高，只有海产品油中的含量较高。因 此，提供维生素D3或它的代谢产物是有效治疗前面所提到的疾病的关键基础，也是一种 挑战。例如，美国专利第US 5,508,392号公开了利用合成的维生素D3糖苷、维生素込原 酸酯苷、维生素込类似物的糖苷，以及维生素D3类似物的原酸酯苷用于治疗骨质疏松。使用维生素D3以及它的合成类似物所存在的一个缺点是其作为药物和引起高 血钙风险之间的治疗窗特别窄，所述高血钙也就是不正常的且具有毒性作用的高血钙浓 度，其最终会对软组织和肾脏产生严重损害。维生素D3 (维生素込过多)中毒可以引起 高血钙，例如当维生素D3的使用量超过推荐的每日允许量100倍时。已知1，25-二羟 基维生素D3的这种缺点更为突出，因为其作为药物使用时的有效剂量和开始产生毒副作 用的剂量之间的范围较小，两者之间的比值只有2至5。例如，高剂量的1，25-二羟基 维生素D3所产生的一个可检测到的副作用就是导致饲养的家禽重量明显偏低。但是，尽 管存在上面所提到的缺点，维生素D3和它的类似物仍然是用于治疗前面所提到疾病的优 选化合物。至于判断治疗方式是否合适，这还取决于其它因素，例如制备治疗中使用的活 性成分所需的成本。因此，使用维生素D3或它的类似物经济有效地治疗前面提到的疾病 的瓶颈在于如何降低维生素D3代谢产物的供应和制备成本。一种可能是，通过化学立体选择合成方法来提供维生素D代谢产物。但不幸的 是，立体选择合成通常劳动量较大，并且这种方法还需要多个合成和纯化步骤才能获得 对映体浓缩的或者纯的维生素込或者它的代谢产物。因此，虽然许多合成的维生素込药 品被批准上市和使用，但是立体选择合成维生素D仍是一种高成本的方法，其在现阶段 不能实现对于前面提到疾病经济有效地治疗。此外，通过合成方法生产的1，25-二羟基 维生素D3高浓度给药时还具有药物治疗窗特别窄的缺点，和引起高血钙的风险。因此， 寻找维生素D3或者它的代谢产物的其它来源或许是优选的解决方案。已经发现很多植物都含有高浓度的维生素D代谢产物。这种类型的植物包括， 例如茄科(Solanacea)种的植物(茄属植物)，特别是粉绿叶茄(Solanum glaucophyllum) (也称作软木爺(Solanum malacoxylon)或 Solanium glaucum)、/K爺(Solanum torvum)、 Solanum esuriale、山烟草(Solanum verbascifolium)、洋丁香(Cestramdiurnum)等等， Nierembergia veichtii种植物，禾本科(Gramineae)种植物，特别是黄燕麦草(Trisetum flavescens)。最近十年的大量研究进一步揭示番茄植物(来自茄科的番茄(Lycopersicon esculentum))具有特定含量的25 (OH) D3和1，25 (OH) 2D3_糖苷形式的维生素D3 (Prema禾口 Rhagamulu，1996，Phytochem.42 (3), 617-620)。类似地，马铃薯植物(马铃薯)、 茄子植物(茄子)和小胡瓜植物(Cucurbita pepo L.ssp.pepo convar.Giromontina)(参见例如 Aburjaj 等人，I"8，Phytochem.46 (6), IOO5-IOl8)以及粉蓝烟草(Nicotiana glauca)(茄 科蓝绿烟草)(Skliar等人，2000，Plant Science 156, 193-199)也具有大量的维生素D。
因此，存在许多可以用来供应维生素D或者其代谢产物的潜在植物。上述发现的 基础是因为在用这些植物的叶子或者其它部位喂养动物时出现了许 多有益效果。已经公开了这些钙质沉积性植物的干燥叶具有多种有益效果(参见例如 Bohnd等人，Plant Science 00，1-13(2003))。此外，一些专利还公开了这些植物提取物 的用途。例如美国专利第US 5,776,461号公开了含有植物维生素D的化妆品组合物，特 别是植物来源的天然皮肤护理组合物，这种组合物含有特定基团被羟基化的维生素D化 合物或者它们的糖苷(植物维生素D)。维生素D含量最高的一种植物是粉绿叶茄。已经发现粉绿叶茄(以前称作 Solanum malacoxylon)含有维生素D。已经确定部分粉绿叶茄种植物的活性成分是维生素 D3代谢产物，1，25- 二羟基维生素D3 (参见例如De Vernejoul等人，La Nouvelle Presse medicale, 7，22，1941-43(1978))。很多文献报道都提到粉绿叶茄的活性成分是维生素D，很少有文献提到该植物 的其它成分。只有一篇文献提到了该植物中存在生物碱澳洲茄铵(solasodine)(参见Jain 和Sahoo，Pharmazie(1986)41 820-821),还有一篇文献提到了酚类化合物，但是并未 记载任何化合物定量的内容(Rappapport等人，Phytochemistry (1977) 16 1115-6)。 除 了主要成分1，25-二羟基维生素D3外，粉绿叶茄的丁醇提取物中还发现了一系列酚 苷，包括氢醌、山萘酚(kaempferol)和槲皮素(quercetin)以及下面这些已知的苷熊果 苷，O-甲基熊果苷，异槲皮素，篇蓄苷(vicularin)，芸香苷，山萘酚-3_0_芸香糖苷以 及异鼠李素-3-0-芸香糖苷。在粉绿叶茄中还发现了一种新的槲皮素三糖苷(quercetin trioside),该槲皮素化合物是3-0-[2G-b_D-芹菜糖基]芸香糖苷。这些酚类化合物中 的大部分都是所有植物的成分，但是Rappaport等人的文献(1977，supra)并未提到任何 定量的内容。此外，植物酚的子类别黄酮化合物通常被作为抗氧化剂进行讨论，但是并 未提到这些化合物在骨形成中的活性。此外，只记载了(植物酚的子类别)黄酮醇(槲 皮素和山萘酚)对于骨细胞的作用。例如，最近，体外实验显示槲皮素和芸香苷可以抑 制破骨细胞的形成和分化破骨细胞的前体细胞。Yamaguchi发现槲皮素和山萘酚在体外 对于破骨细胞形成和骨吸收(而非骨形成)具有很强的抑制作用(Yamaguchi等人，MoI Cell Biochem.2007Jun 1)。在染色体水平上，槲皮素和它的葡萄糖苷酸可以提高骨唾液蛋 白(bone sialoprotein)的 mRNA 水平(Kim 等人，J Cell Biochem.2007Jun 1)。其它的破 骨性谱系细胞(osteoclastic lineage)的体外细胞研究证实其对于破骨细胞分化具有抑制作 用，但对于骨形成并未显示出积极的作用，所述破骨细胞分化是骨吸收过程中的关键步 骤(Wattel 等人，J Cell Biochem.2004May 15 ； 92(2) 285-95)。 更高水平的研究，在小骨组织培养物中进行的实验(Sziklai和Ribari，Acta Otolaryngol. 1995Mar ； 115(2) 296-9)以及在大鼠颅盖造骨细胞中进行的实验(Yang 等人，Zhong Yao Cai.2006May ； 29(5) 467-70)也显示槲皮素对于成骨细胞具有抑制
作用。此外，在两个用正常动物中进行的研究发现，槲皮素在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中对于骨矿物代谢、生物力学强度以及骨结构具有促进作用(Kanter等人，Cell Biochem Funct.2007Jan 31)，芸香苷在卵巢切除诱导的骨质减少的大鼠中也是有用的 (Horcajada-Molteni 等人，J Bone Miner Res.2000Nov ； 15(11) 2251-8.Comment in J Bone Miner Res.200IMay ； 16(5) 970-1)。尽管如此，即使已经证实了这些化合物存在
于粉绿叶茄植物中，但是 现有技术仍认为维生素D是治疗前面提到的疾病的唯一活性成 分。发现粉绿叶茄中含有高浓度维生素D代谢产物1，25-二羟基维生素D3时，已 经开始推测该植物是否可以用作治疗男性和动物的骨疾病，并且已经在实验动物中对提 取物的生物活性进行了实验。这些实验使用维生素D耗竭的动物以证明维生素D的活 性(参见例如 De Vernejoul 等人，(1978)，supra)。Azcona (Azcona 等人，Zootechnica Intern.February 1982p. 12-13)。 Morris (Morris KML, The Veterinary Record，101， 502-504(1977))发现在喂食了粉绿叶茄干燥叶后蛋壳强度变强。Norrdin (Norrdin et al.， Calcified Tissue International(1979) 28 (1) 239-243)提到在喂食粉绿叶茄干燥叶后小鸡 骨骼的骨质量和断裂强度都得到了提高。在使用牛或羊的瘤胃液(rumen fluid)进行培 养后，叶子的水提取物显示出更高的维生素D活性(MeIIo和Habermehl，Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1992Sep ； 99(9) 371-6)。从 WO 85/051 10 可以知道，南美植物粉绿叶茄 (South-American plant Solanum glaucophyllum)叶子的提取物含有 1, 25- 二羟基维生素 D3 以及一种水溶性成分，该水溶性成分不同于1，25-二羟基维生素D3,其在用瘤胃液处理 后可以获得1，25-二羟基维生素D3和一种水溶性糖。该专利文件进一步提到粉绿叶茄 的水溶性提取物具有与1，25-二羟基维生素D3相似的生物活性。从奥地利专利说明书 AT 398372B(该专利说明书公开时间大约晚于WO 85/051109年)中可以获知，粉绿叶茄 的干燥叶确实具有声称的活性，但同时也具有前面提到的高毒性这一缺点。此后，Cheng 等人(2004) (Cheng 等人，Poult Sci.2004Mar ； 83(3) 406-13.)发现喂食粉绿叶茄叶子 可以提高肉鸡中磷的利用。此外，Foote等人(2004) (Foote等人，JAnim Sci.2004Jan ； 82(1) 242-9)发现在斩杀动物前喂食维生素D和它的代谢产物可以提高肉的嫩度。但 是，所有的这些尝试都具有上面提到过的高毒性缺点。此外，让甲状腺机能亢进和肾功能不全的患者服用植物干燥叶7天后可以观察 到血钙浓度恢复正常(参见例如Mautalen等人，CalcifTissue Res.l977May ； 22Suppl 534-7.；以及 Herrath 等人，Vitamin D, Chemical and Clinical Aspects related to Calcium Metabolism.Pp.703-708.W.de Gruyter, Berlin, Germany, 1977)。这种方式受到的限制是 要使用未知活性的未纯化提取物，而这样的提取物通常含有有毒的生物碱。这些实验的共同特点是没有对所用的材料进行表征，没有测量活性成分。此 夕卜，除维生素D-类似作用外，也都没有记载粉绿叶茄的其它作用。另一方面，有数篇文献都报道了尝试对粉绿叶茄的活性成分进行分析，以及尝 试制备植物提取物。例如，Peterlik 和 Wasserman(1975)(参见 Peterlik 和 Wasserman， FEBS Letters (1975) 56 16-19)使用氯仿/甲醇混合溶剂来提取干燥叶，而MeIIo禾口 Habermehl (1998)则使用热水来提取干燥植物材料(参见MeIIo和Habermehl，Dtsch Tierarztl Wochenschr. 1998Jan ； 105(1) 25-9) 然后使用 Sephadex Gl5 和 Sephadex LH20 进行色谱分离纯化(参见Vidal等人，Turrialba(1985) 35 65-70)，或者在采用硅胶和C18改良后的硅胶作为固定相的柱子上通过制备HPLC色谱进行分离纯化(Skliar等人，J Steroid Biochem MoI Biol.l992Dec ； 43(7) 677-82)。Von Rosenberg S.J.，2006 年的公开(Rosenberg S.J.，2006，PhD-thesis， Ludwigs-Maximilians-University, Munich, Germany)以及 Von Rosenberg S.J.等人 2007 的进一步公开(Rosenberg S.J.等人，The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, Volume 103, Issues 3-5, March 2007, Pages 596_600)揭露了利用粉绿叶茄
和黄燕麦草的植物提取物来作为食品补充剂或者用作人体治疗用途，尤其是治疗骨质疏 松。此处公开的植物提取物由HerbonisAG，Basel, Switzerland提供，这种植物提取物
先是用水从干燥植物(叶子)中提取，然后以Sephadex作为基质材料进行高效液相色谱 (HPLC)来纯化提取物。所述提取物只含有有活性的维生素D代谢产物1，25-二羟基维 生素D3作为活性成分。虽然已经公开了一些实验室提取方法，但是上述文献似乎都没有公开具有足够 高产率的，即适于工业应用的，用于制备含有维生素D化合物的植物提取物的提取/纯 化方法。这些文献公开的方法都是在于寻找活性成分1，25-二羟基维生素D3,但都没 有尝试对产率进行优化也没有尝试降低有毒副产物的含量。已经尝试使用纯水或者水性 溶剂进行提取从而将游离的1，25-二羟基维生素D3从其结合形式分离出来，或者使用本 身有毒的溶剂氯仿从水溶性成分中分离出游离的1，25-二羟基维生素D3。已经报道了 数种使用硅胶材料或者交联葡聚糖凝胶(Sephadex gels)进行柱色谱分离进而纯化活性成 分1，25-二羟基维生素03的方法，但是这些方法都不适用于提取物的大规模生产。尤 其是，在硅胶材料上进行色谱分离所获得的维生素D代谢产物的产率都比较低，从而不 能使含有植物提取物的维生素D实现工业化生产，所述工业化生产是指维生素D的大规 模生产。此外，上面提到的方法都没能提供一种植物提取物，其至少部分克服前面提到 的当高浓度用药时产生高毒性这一缺点。因此，本发明的一个目的是克服前面提到的缺点，提供一种具有更好耐受性的 粉绿叶茄提取物，该提取物可以通过低成本方式进行大规模生产。尤其是不受高浓度时 维生素D毒性这一缺点限制的提取物。为解决上述问题，本发明提供了如下文及所附权利要求书所记载的技术方案。本发明通过提供一种新的从粉绿叶茄中制备浓缩的(以及均衡的)植物提取物的 方法来解决上述问题，本发明方法具有产率高且适于工业化生产的特点，本发明方法获 得的植物提取物同时含有1，25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇，尤其含有槲皮苷。本发明发明人惊奇地发现，具有浓缩含量的1，25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮 醇(尤其是槲皮苷)的粉绿叶茄植物提取物没有显示出上面提到的高毒性缺点，也就是说 维生素D代谢产物的使用浓度可以比现有技术中提到的更高，同时又不会有引发高血钙 的风险。此外，本发明发明人还发现，以低浓度1，25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇 (尤其是槲皮苷)给药时，本发明植物提取物也可以产生可检测到的良好效果。换言之， 本发明发明人惊奇地发现，与现有技术中提 到的只含有高含量维生素D3化合物的提取物 不同，粉绿叶茄植物提取物同时含有高含量的1，25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇(尤 其是槲皮苷)时能够明显扩大维生素D的治疗窗。但是，现有技术即未公开这种浓缩的 植物提取物的制备方法，也没有公开具有这种性能的植物提取物。
膽剝繼咖·旅____诚根据第一个实施方式，本发明提供了一种从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的(以及 均衡的)植物提取物的方法，该植物提取物含有浓缩含量的1，25-二羟基维生素D3糖苷 和黄酮醇，尤其是槲皮苷，所述方法优选包括以下步骤a)使用醇类溶剂提取粉绿叶茄种的植物或植物部分；b)纯化步骤a)获得的提取物，优选用以下步骤bl)将步骤a)获得的植 物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中；b2)可选地，用水和/或此处定义的醇类溶剂冲洗柱子；b3)从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物；以及b4)可选地，浓缩和/或干燥所述浓缩的植物提取物。根据本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步 骤a)，其使用了醇类溶剂对粉绿叶茄种的植物或植物部分进行提取，这种方法优于现有 技术公开的方法而且该方法还适用于工业规模的生产。与此相反，现有技术公开的方法 都只关注分析工作，这些方法都不适用于工业规模的生产。此外，现有公开的方法只是 为了获得纯的维生素D3活性化合物。此外，现有技术公开的有些方法也不适用于人体 或动物，因为这些方法所用的溶剂具有毒性。例如，现有技术公开的使用氯仿-甲醇提 取粉绿叶茄的方法最为有效，但该方法不适用于大规模生产而且该方法还使用了有毒试 齐U。此外，现有技术公开的只使用水进行提取的方法所获得的维生素D活性太低。根据 申请人:自己的发现，使用醇类溶剂提取可以取得最佳效果。因此，适用于本发明制备和 提取方法提取步骤a)的醇类溶剂优选自水和醇的混合物，或者只有醇，所述醇优选自甲 醇、乙醇或者异丙醇，更优选乙醇或者甲醇。虽然获得的植物提取物组合物可能并非最 理想，但本发明的范围也包括，使用其它合适的和广泛使用的溶剂(例如水)来根据本发 明提取步骤a)的方法提取粉绿叶茄植物或植物部分。更优选地，本发明从粉绿叶茄中制 备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)的溶剂选自乙醇/水混合物，其 中乙醇与水的比率(％)在约100/0至约0/100 (ν/ν)，例如乙醇/水比率(％)为约100/0 乙醇/水(ν/ν)，约95/5乙醇/水(ν/ν)，约90/10乙醇/水(ν/ν)，约85/15乙醇/水 (ν/ν)，约 80/20 乙醇 / 水(V/V)，约 75/25 乙醇 / 水(V/V)，约 70/30 乙醇 / 水(V/V)， 约 65/35 乙醇 / 水(ν/ν)，约 60/40 乙醇 / 水(ν/ν)，约 55/45 乙醇 / 水(ν/ν)，约 50/50 乙醇/水(ν/ν)，约45/55乙醇/水(ν/ν)，约40/60乙醇/水(ν/ν)，约35/65乙醇/水 (ν/ν)，约 30/70 乙醇 / 水(V/V)，约 25/75 乙醇 / 水(V/V)，约 20/80 乙醇 / 水(V/V)， 约15/85乙醇/水(ν/ν)，约10/90乙醇/水(ν/ν)，约5/95乙醇/水(ν/ν)，或者约 0/100乙醇/水(ν/ν)，或者由前面提到的任意两种特定值所组成的范围。本发明人发现 使用这样的混合物提取可以使得浓缩植物提取物中两种所需成分的产率最高，也就是1， 25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇的产率最高，尤其是槲皮苷。最优选地，本发明从粉 绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)中所用的溶剂选自乙醇 /水混合物，其中乙醇/水(v/V)比率(％ )为约80/20至约50/50和/或约35/65至约 20/80。乙醇/水(ν/ν)的特定比率还可以根据1，25- 二羟基维生素D3糖苷在浓缩的植 物提取物中的含量来作进一步选择。本领域技术人员可以根据特定的提取和纯化方法来 选择乙醇/水(ν/ν)的特定比率，优选此处定义的比率。
可选但不是最优地，从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法 提取步骤a)中的溶剂可以选自甲醇/水混合物，其中甲醇/水的比率与上面记载的乙醇/ 水的比率相同。更优选地，甲醇/水的比率可以选自比率(％) (ν/ν)约90/10至约25/75 之间，例如可以选自甲醇/水的比率(％ )为约90/10(V/V)，约85/15甲醇/水(V/V)， 约 80/20 甲醇 / 水(ν/ν)，约 75/25 甲醇 / 水(ν/ν)，约 70/30 甲醇 / 水(ν/ν)，约 65/35 甲醇/水(ν/ν)，约60/40甲醇/水(ν/ν)，约55/45甲醇/水(ν/ν)，约50/50甲醇/水 (ν/ν)，约 45/55 甲醇 / 水(ν/ν)，约 40/60 甲醇 / 水(ν/ν)，约 35/65 甲醇 / 水(ν/ν)， 约30/70甲醇/水(ν/ν)，或者约25/75甲醇/水(ν/ν)，或者由前面提到的任意两种特 定值所组成的范围，特别为约90/10至约60/40和/或约40/60至约25/75甲醇/水(ν/
V) 。
可选但不是最优地，从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法 提取步骤a)中的溶剂可以选自异丙醇/水混合物，其中异丙醇/水的比率与前面记载的 乙醇/水混合物相同或者与甲醇/水混合物相同。粉绿叶茄种的(干燥)植物或植物部分在前面所定义的醇类溶剂中的浓度，可 要求一特定的所用溶剂与溶剂中(干燥)植物或植物部分(药材)(总量)之间的比率， 也就是溶剂/药材的比率(％ )，其优选为约4-40(v/w)，更优选为约4-30(v/w)或者约 4-25 (v/w),此外还可以根据所用的提取方法来作进一步优选，例如对于渗滤类型的提 取，进一步优选为约7-12或8-10 (v/w)，最优选为约9 (v/w)；或者，对于浸渍类型的提 取，进一步优选为约3-7或者4-6 (v/w)，最优选为约5 (v/w)。渗滤类型的提取和浸渍 类型的提取在本发明提取步骤a)中可以看作是等同替换的方法。从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)中所用 的溶剂可以进一步含有添加剂。这些添加剂可被添加以改进所得提取物的质量。一般而 言，这些添加剂在本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤 a)所用溶剂中的浓度能满足特定目的，本领域技术人员可以根据提取步骤的特定要求来 确定此等浓度。通常，所选添加剂的浓度应该不会对步骤a)的提取产生任何损害，但同 时又能起到稳定和/或保护抗氧化等作用。本发明中的添加剂可以包括，例如抗氧化剂 如抗坏血酸，优选浓度为约0.01% (w/v)至约2% (w/v),优选浓度为约0.05% (w/v)至 约(w/v),最优选浓度为约0.05% (w/v)至约0.5% (w/v),或者是生育酚或胶体类型 的抗氧化剂(E310，E21或者E312)，优选浓度为约0.02至约1 % (w/v)，更优选浓度为 约0.05% (w/v)至约0.25% (w/v)等。添加剂可以进一步包括合适的酸，优选有机酸， 更优选植物来源的酸或者存在于植物中的酸，包括例如醋酸、硫酸、柠檬酸等，优选浓 度为约0.05% (w/v)至约(w/v),更优选浓度为约0.1% (w/v)至约0.5% (w/v) ο 前面所述的浓度％ (w/v)是相对于提取步骤a)中所用溶剂的总体积。添加这些酸的作用 优选是为了减少提取和后续步骤中的棕黄反应。因此，可以在本创新方法提取步骤a)的 提取过程中将pH调节至约4.0至约8.0，更优选至约5.5至约6.5。可以通过添加适当量 的合适的酸来调节pH值，所述酸例如是上面定义的那些酸，或者如果必要的话，也可以 添加适当量的合适的碱，例如氢氧化钠，氢氧化钾等。从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以包 括对粉绿叶茄种的植物或植物部分，比如叶子，进行研磨、渗滤和/或浸渍的步骤。所述研磨、渗滤和/或浸渍可以是连续过程或者不连续过程。
从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以 在室温至约85°C下进行，例如约20或者30°C至约85°C，更优选温度范围约30°C至约 70°C,最优选温度范围约40°C至约60°C，特别是约40°C，约45°C，约50°C，约55°C， 或者约60°C，更优选温度约50°C，约55°C或约60°C，或者是前面所提到的任意温度值所 组成的温度范围。从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以重 复至少一次，优选1-2次，1-3次，1-5次或者更多次，为提高活性成分的提取率，优选 使用与提取所用同样的醇类溶剂，其用量为约1至约5，1至4，1至3，1至2或者1倍 (柱床)体积进行重复提取。提取后合并提取液。根据所用的提取方法来选择适当的重 复提取次数，例如浸渍或者渗滤类型的提取。当采用浸渍提取时，提取步骤a)优选重复 1-2次，使用与第一次提取所用的同样醇类溶剂，其用量为约2至约5倍(柱床)体积进 行重复提取。需特别说明的是，发明人因此惊奇地发现在提取步骤a)中不需要为了取得 高产率而对植物或植物部分进行研磨。可选地，从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤 a)可以按照特定时间间隔来进行，其中，所述时间间隔，也就是提取时间，可以在约1 至约48，24，或者约10小时，优选约6至约48小时，更优选24小时。可对提取步骤a)获得的植物提取物进行过滤。可以使用现有技术中已知的任何 方法进行过滤。例如，将溶剂泵送通过40至60 μ m的滤筛，优选50 μ m的滤筛。提取 步骤a)获得的提取物可以在提取步骤a)的每次提取步骤后或者所有提取步骤完成后进行 连续过滤。从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)获得的提 取物可以采用适当的方法进行浓缩(在过滤前进行或过滤后进行)和/或干燥。提取步 骤a)以及本发明其它部分提及的浓缩和/或干燥通常是指任何减少植物提取物中水分或 液体含量的过程，例如在步骤a)渗滤或浸渍粉绿叶茄种的植物或植物部分后进行浓缩和 /或干燥。例如，可以通过浓缩提取物的方法来减少提取步骤a)获得的植物提取物的水 分或液体含量，优选使用常规的浓缩和/或干燥手段和方法，更优选使用可以安全地减 少浓缩的植物提取物中水分或液体含量的方法，该方法不会分解提取物的主要成分，尤 其是1，25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇，特别是槲皮苷。用于浓缩(和/或干燥)的 方法包括但不限于，例如蒸发比如真空蒸发，或者在平稳温度(smoothtemperatures)下蒸 馏溶剂。可以对已经浓缩后的提取物进行干燥但也可以直接干燥提取(和/或纯化)后获 得植物提取物。这些干燥方法包括但不限于，例如喷雾干燥、带式干燥(band drying)、 冷冻干燥等，特别是当需要将所述(中间的)植物提取物干燥至约100%或者将近100% 的不挥发物质。优选地，浓缩或者干燥提取步骤a)获得的植物提取物时，先除去有机溶剂，然 后除去水直到获得含有特定含量(％ )水和特定含量(％ )不挥发物质的溶液。例如，提 取步骤a)获得的植物提取物可以浓缩或干燥至植物提取物含有约90-80%水和约10-20% 不挥发物质，约85-75%水和约15-25%不挥发物质，约80-70%水和约20-30%不挥发物 质，约75-65%水和约25-35%不挥发物质，约70-60%水和约30-40%不挥发物质，约65-55%水和约35-45%不挥发物质，约60-50%水和约40-50%不挥发物质，约55-45% 水和约45-55%不挥发物质，约50-40%水和约50-60%不挥发物质，约45-35%水和约 55-65%不挥发物质，约40-30%水和约60-70%不挥发物质，约35-25%水和约65-75% 不挥发物质，约30-20%水和约70-80%不挥发物质，约25-15%水和约75-85%不挥发物 质，约20-10%水和约80-90%不挥发物质，约15-5%水和约85-95%不挥发物质，或者 约10-0%水和约90-100%不挥发物质，优选约85-75%水和约15-25%不挥 发物质，约 80-70%水和约20-30%不挥发物质，约75-65%水和约25-35%不挥发物质，约70-60% 水和约30-40%不挥发物质，约65-55%水和约35-45%不挥发物质，最优选约75-65%水 和约25-35%不挥发物质。前述百分含量基于浓缩或者干燥前植物提取物的总重量，例 如基于渗滤或者浸渍类型的提取直接获得的提取物的总重量。这样的浓缩和/或干燥至 特定含量不挥发物质，可以使活性成分的不同浓度与根据提取步骤a)获得的植物提取物 的特定浓度一致，其中所述提取步骤a)获得的提取物可能是使用不同体积的前面提到的 溶剂提取而来，例如重复提取步骤a)。将步骤a)获得的植物提取物浓缩和/或干燥至约 100%不挥发物质还可以使提取物在使用前能保存在最小空间中。最后，对步骤a)获得的植物提取物进行热_/高温处理以增加提取物的贮藏时 间，优选使得提取物可以(长期)贮藏。该处理步骤可以在浓缩和/或干燥步骤a)获得 的植物提取物之前进行或者之后进行。所述热_/高温处理可以通过本领域的已知技术 来进行。更优选地，所述热_/高温处理在温和条件下进行，优选在100°C至约145°C， 例如在最低温度100°C下进行处理，优选处理30至40秒，或者在最高温度145°C下进行 处理，优选处理约2至10秒，或者在上述两个温度之间的任何温度下进行处理，例如约 105°C, IlO0C, 115°C, 120°C, 125°C, 130°C, 135°C,或约 140°C。根据特别优选的实施方式，本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物 这一创新方法的提取步骤a)可以适用于实验室规模或者工业规模的生产，其中此处定义 的实验室规模的生产条件也可以转化成工业规模的生产。如果用于实验室规模的生产，本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取 物这一创新方法提取步骤a)所用的粉绿叶茄种的植物或植物部分重量通常(但不限于此) 为约0.5g至约lOOOg，更优选约Ig至约100g，最优选约Ig至约10g，其中叶子可以经 过研磨和用醇类溶剂渗滤或浸渍过的。其中醇类溶剂可以是上面提到的那些溶剂，更优 选选自乙醇/水混合物，该混合物中乙醇/水比率(％ )为约80/20至20/80，或更优选 80/20至65/35，或者35/65至20/80，例如可以选自乙醇/水混合物比率(％ )为约80/20 乙醇/水(ν/ν)，约75/25乙醇/水(ν/ν)，约70/30乙醇/水(ν/ν)，约65/35乙醇/水 (ν/ν)，约 60/40 乙醇 / 水(ν/ν)，约 55/45 乙醇 / 水(ν/ν)，约 50/50 乙醇 / 水(ν/ν)， 约 45/55 乙醇 / 水(ν/ν)，约 40/60 乙醇 / 水(ν/ν)，约 35/65 乙醇 / 水(ν/ν)，约 30/70 乙醇/水(v/V)，约25/75乙醇/水(ν/ν)，或者约20/80 (ν/ν)的混合物，或者可以选自 前述任意两个特定值组成的范围。此外，实验室规模生产提取过程中采用的ρΗ值和温度 通常也可以选自前面定义的那些，其中优选所用的这些条件可以使得提取效率大于3(见 下表1，实施例1Α)。优选温度为约40°C至60°C，更优选温度为约50°C。可以根据前 面提到的方式重复提取，优选重复1-5次。从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤a)的提取效率可以根据下式计算yf =VDM(提取物)· [Qu(提取物)/1000] · ef,VDM= 1，25-二羟基维生素D3(或者它的糖苷或者前面定义的其它具有活性的 维生素D化合物)Qu =槲皮素ef 经验工艺系数(empirical process factor)yf 经衡量工艺质量(weighed goodness ofprocess)其中，[VDM] 和[Qu]根据每克(g)提取物计算。系数[ef]是表示如成本、生态 和提取物质量(例如溶解性)等因素的经验系数。结果惊奇地发现，本发明提取效率yf 可以大于3，这明显优于现有技术中的方法，该提取效率符合本发明的标准。因此，本发 明提取步骤a)的优选实施方式是提供一种yf大于2，优选大于2.5，更优选大于3的提取 物。如果工业规模的生产，从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方 法提取步骤a)所用的粉绿叶茄种的植物或植物部分重量通常(但不限于此)为至少约 IOOOg,优选至少约10或约100kg，更优选至少约250kg，更优选至少约500kg，至少约 1000kg或者甚至至少约2500kg，至少约3000，至少约4000kg，至少约5000kg，或者更 多。本领域技术人员可以根据特定条件来确定粉绿叶茄种的植物或植物部分的用量，例 如工厂的规模，需要实际加工的量等条件。粉绿叶茄种的植物或植物部分例如叶子可以 在上面定义的醇类溶剂中进行研磨、渗滤和/或浸渍。也可以在提取步骤a)中采用研 磨、渗滤和/或浸渍处理。例如，可以使用本领域已知的方法来进行渗滤，优选地，将粉绿叶茄植物或植 物部分例如叶子填充到至少一个容器中(根据工业装置的类型可以使用但不限于，至少1 个，2个，3个，4个或5个或更多个(循环填充的)容器)，然后往混合物中加入前面所 定义的溶剂。所述醇类溶剂通常选自前面定义的用于提取步骤a)的溶剂。优选地，渗 滤用的溶剂通常还进一步含有前面定义的用于提取步骤a)的添加剂。此外，工业规模提 取工艺中所采用的pH值和温度通常可以采用前面所定义的那些，其中优选采用的这些条 件可以使得提取效率大于3 (对应于下表1，实施例1A)。优选pH值约4.0至约8.0，更 优选约5.5至约6.5。优选将混合物加热到前面定义的温度，优选在约40°C至约75°C之 间，更优选在约40°C至约60°C之间。渗滤工艺可以以连续工艺、半连续工艺或者任何其 它工艺进行，只要该等可以按照特定流速将醇类溶剂泵送/转移到至少一个容器中。优 选地，该流速为约500至1500升每小时，更优选为约800至1200升每小时，最优选为约 1000升每小时。提取时间可以按照上面定义的那样进行变化，例如在约6至约48小时， 优选约24小时。渗滤后获得的提取物可以按照上面定义的那样进行过滤、浓缩和/或干 燥处理。根据特别优选的实施方式，如果进行工业规模的生产，从粉绿叶茄中制备和纯 化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)采用渗滤提取，并且包括下列特定的子步 骤(提取工艺EP)EPl)将粉绿叶茄种的植物或植物部分填充到至少一个(循环填充的)容器中， 例如如上面定义数量的容器；
EP2)加入醇 类溶剂，其中所述醇类溶剂优选自上面定义的乙醇/水混合物，例 如混合物中乙醇/水的比率(％)为约25/75，或者约75/25 (ν/ν)，其中溶剂/药材的比 率优选如上面定义的范围，例如约7-12 (v/w)，最优选约9(V/w);EP3)可选地，按照上面定义的方法将pH调节至约5.5-6.5 ；EP4)在醇类溶剂中提取所述粉绿叶茄种的植物或植物部分，优选流速为 800-1200升每小时，更优选1000升/小时；优选6-48小时，更优选24小时；EP5)在提取过程中将混合物加热至前面定义的温度，优选约40-75°C，更优选 约 40-60 0C ；EP6)可选地，按照前面定义的方法真空浓缩步骤EP4和EP5获得的植物提取 物，例如，先蒸发有机溶剂然后再蒸发水直至获得的溶液含有约75-65%水和约25-35% 不挥发物质；以及EP7)可选地，喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥(浓缩后的)植物提取物。可选的，可以按照前面定义的方法来进行浸渍，通常使用带有搅拌器或者搅拌 部件的反应器，优选还带有加热系统的反应器。此外，浸渍可以通过先将叶子填充至容 器然后加入前面定义的醇类溶剂并进行加热和搅拌混合物(在容器中)的方式来进行，优 选在前面定义的提取时间和前面定义的温度以及pH值内进行。优选地，浸渍用的醇类溶 剂通常还含有至少一种前面定义的用于提取步骤a)的添加剂。所述醇类溶剂可以选自前 面所定义比率(％ )的乙醇/水(v/V)混合溶剂。此外，工业规模提取工艺中所用的pH 值和温度可以选自前面定义的那些，优选所选的这些条件可以使提取效率大于3 (对应于 下表1，实施例1A)。优选pH值约4.0至约8.0，更优选约5.5至约6.5。优选地，温度 为约55°C且提取时间为24小时。浸渍获得的提取物可以按照前面定义的方法进行过滤、 冲洗、浓缩和/或干燥处理。根据特别优选的实施方式，如果用于工业规模的生产，从粉绿叶茄中制备和纯 化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)是浸渍提取，其包括下列特定的子步骤 (提取工艺EM)EMl)将粉绿叶茄种的植物或植物部分填充到至少一个容器中，优选该容器带有 搅拌器，优选该容器带有加热器；EM2)加入醇类溶剂，其中醇类溶剂优选自前面定义的乙醇/水混合物，例如具 有乙醇/水(ν/ν)比率(％ )为约65/35的混合物，其中溶剂/药材的比率优选为上面定 义的范围，例如约4-6(V/w)，最优选约5(V/w)；所述醇类溶剂优选还含有前面定义的 添加剂，例如含有0.1%抗坏血酸。EM3)可选地，按照前面定义的方法将pH调节至约5.5_6.5，优选约5.5 ；EM4)在前面定义的温度和提取时间内，在醇类溶剂中提取粉绿叶茄种的植物或 植物部分，优选约55°C下提取约24小时；EM4)从容器中回收植物提取物并进行过滤，例如泵送植物提取物通过50 μ m的 筛网。EM5)可选地，使用与前面定义的乙醇/水混合物相同的混合物冲洗提取步骤 EM4和EM5留下的固体一次或两次，优选溶剂/药材的比率约为3 ；EM6)可选地，真空浓缩植物提取物，该真空浓缩先是在真空条件下蒸发有机溶齐U，然后再蒸发水直至获得的溶液中含有75-65%水和25-35%不挥发物质；以及EM7)可选地，喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥(浓缩后的)植物提取物。本发明制备和纯化粉绿叶茄的 植物提取物的方法进一步包括纯化步骤b)以纯化 提取步骤a)获得的提取物。该纯化步骤b)对于获得植物提取物的主要活性成分以及达到 较高的产率而言都是非常关键的步骤，所述主要活性成分也就是1，25-二羟基维生素D3 糖苷和黄酮醇，特别是槲皮苷。最令人惊奇的发现是，纯化步骤b)高产率的实现主要是 与使用含有非离子型聚合物树脂的柱子对提取物进行处理这一点有关，这一点是本领域 技术人员根据现有技术所预料不到的。只有使用这样的非离子型聚合物树脂才能使得粉 绿叶茄植物提取物浓缩两种主要成分，并可以明显提高这些活性成分的产率，所述活性 成分也就是1，25-二羟基维生素込糖苷和黄酮醇，尤其是槲皮苷。使用其它柱子材料无 法使前述两种活性成分达到这种浓缩含量。本领域中已知的用于植物成分分离的方法， 例如说明书背景技术部分记载的那些，包括蒸馏法，以及先进行溶剂-溶剂(逆流)提取 然后进行色谱分离的方法，例如柱色谱分离法。只有极少数情况下才可以省去色谱分离 过程，例如目标产物具有特殊的物理化学性质从而使得只用液相_液相提取或者蒸馏就 可以获得足够纯度的产物。但是，已知现有技术中进行的纯化实验目标都是为了获得纯 的具有活性的维生素D产物，而不是上述两种活性成分的组合。如果需要使用色谱分离 法进行进一步的纯化，那么本领域的技术专家也都会选择文献中提到的那些硅胶材料和 交联葡聚糖作为用于色谱分离纯化植物提取物的基质(参见前面的描述)。就如发明人 所发现的，硅胶材料和交联葡聚糖在用于同时纯化两种活性成分时都具有明显缺陷硅 胶材料上进行色谱分离所获得1，25-二羟基维生素D3产率低，而交联葡聚糖色谱分离只 浓缩1，25-二羟基维生素D3而无法浓缩黄酮醇，这可以从附图6第9道看出。因此， 这些材料都不适用于同时纯化两种物理化学性质略有差异的活性成分。在这一方面，黄 酮醇一直都被认为其对于治疗作用并不重要，也没有进行过任何有关纯化同时含有两种 活性成分的植物提取物方面的尝试。因此，本领域专家始终都会选择前面定义的硅胶材 料或者交联葡聚糖来纯化主要成分为维生素D代谢产物的植物提取物。发明人也已经发 现，离子型聚合物树脂(参见de Boland等人，supra)不是充分的替代物，因为已经发现 植物提取物的盐含量超过了柱子的处理能力，这就需要离子盐来进行洗脱。与本领域技术人员所期望的相反，发明人惊奇地发现非离子型聚合物树脂反而 适于本发明的特定方法，也就是提供含有两种活性成分组合物的方法，所述两种活性成 分也就是1，25-二羟基纤维素D3糖苷和黄酮醇，特别是槲皮苷，而且组合物中这些活性 成分的含量可以接近最佳，而生物碱的含量则可以降低至最小。因此，用于纯化步骤a)获得的提取物的纯化步骤b)优选包括下列步骤bl)将步骤a)获得的植物提取物填充至含有非离子型聚合物树脂的柱子中；b2)可选地，使用水和/或前面定义的醇类溶剂冲洗柱子；b3)从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物；以及b4)可选地，干燥浓缩的植物提取物。根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的纯化步骤b)的 子步骤bl)，所述提取物被填充至含有非离子型聚合物树脂的柱子中。本发明中，适于 步骤b)子步骤bl)的非离子型聚合物树脂可以包括(多孔的或无孔的)非离子聚合物树月旨，包括但不限于聚苯乙烯、苯乙烯二乙烯苯共聚物、丙烯酸酯聚合物，以及多酚树 月旨。更优选地，所述(多孔的或无孔的)非离子型材料选自Amberlite XAD-I、XAD-2、 XAD-4、XAD-5(这些都是商标名称，它们由Rohm and Haas Co.，U.S.A.生产，这些树 脂是由苯乙烯二乙烯苯共聚物组成)以及Diaion HP10、HP20、HP30、HP40、HP50 (这 些是商标名称，它们由MitsubishiChemical Co.，Japan生产，这些树脂是由苯乙烯二乙烯 苯共聚物组成)，Amberlite XAD-7、XAD-7HP、XAD-8或者XAD-1180 (这些是丙烯 酸酯聚合物组成的吸附剂的商标名称，它们是由Rohm and Haas Co.生产)，以及Duolite S-30 (这些是酚醛树脂组成的吸附剂的商标名称，它们由Chemical Process Co., U.S.A.生 产)或者与前面具体提到的树脂等效的非离子型聚合物树脂，例如，其它供应商提供的 任何等效树脂，更优选地，适于本发明步骤b)(多孔的或无孔的)非离子型材料选自 树月旨Amberlite XAD-树月旨，包括 Amberlite XAD-1、XAD-2、XAD-4、XAD-5，以 及 Amberlite XAD-7、XAD-7HP、XAD-8 或者 XAD-1180，最优选 AmberliteXAD-7、 XAD-7HP、XAD-8或者XAD-1180，或者与前面提到的树脂等效的非离子型聚合物树 月旨，例如，其它供应商提供的任何等效树脂。此外，适于本发明纯化步骤b)的子步骤bl)的非离子型材料优选不含有基于葡 聚糖的树脂，更优选不含有交联葡聚糖和Superdex树脂材料，特别优选不含有非离子型 的交联葡聚糖和Superdex树脂材料，优选这些材料明确排除在本发明所述的适于步骤b) 的非离子型材料的范围内。可以使用本领域中任何合适的方法来将植物提取物填充到本发明从粉绿叶茄中 制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法纯化步骤b)子步骤bl)中所用的柱子。这些 方法包括(但不限于)，如果是实验室规模的生产，则使用注射器等设备，如果是工业规 模的生产，则使用泵等设备。优选地，适用于植物提取物的柱子具有约2至6的长/宽 比。柱子可以在使用前先用前面定义的溶剂进行冲洗，优选使用此处定义的醇类溶剂， 和/或水和/或丙酮。柱子还可以在使用前进行平衡处理，优选使用水或者此处定义的 醇类溶剂进行平衡处理，优选柱子在平衡处理期间没有发生过跑干。当根据纯化步骤b) 子步骤bl)将植物提取物填充到柱子时，可以是将植物提取物(因为其具有前面定义的溶 剂含量所以呈水溶液形态)填充或泵送到柱子顶部，优选以1、2、3、4、5倍柱床体积或 更高倍的速度进行，优选3倍柱床体积。可以将相同的提取物步骤a)获得的植物提取物 填充到柱子中数次，例如1次、2次、3次、4次、5次，或更多次，其中第一次(通常是 干净的)柱子洗脱液可以不收集。根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的纯化步骤b)可 选的子步骤b2)，可选地，可以使用水和/或前面定义的醇类溶剂冲洗填充有植物提取物 的柱子。如果使用醇类溶剂，则该醇类溶剂可以是前面提到的任何醇类溶剂，通常优选 醇类溶剂所含醇的量不高于20% (ν/ν),这是为了防止将浓缩的植物提取物或者它的任 何成分过早的从柱子中洗脱出来，或者是为了使这种情况最小化。特别合适的醇类溶剂 (但不限于此)可以选自比率(％ )为约0/100至约20/80乙醇/水(ν/ν)的混合物，例 如可以选自比率(％ )为约0/100乙醇/水(ν/ν)，约5/95乙醇/水(ν/ν)，约10/90乙 醇/水(ν/ν)，约15/85乙醇/水(ν/ν)，或者 约20/80乙醇/水(ν/ν)，更优选乙醇/水 混合物具有比率(％ )约5/95乙醇/水(ν/ν)，约10/90乙醇/水(ν/ν)，或者约15/85乙醇/水(v/V)。可选但不是最优地，本发明方法纯化步骤b)子步骤b2)中的醇类溶剂 可以选自甲醇/水混合物，其中甲醇/水的比率与上面定义的乙醇/水的比率相同。本 发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的纯化步骤b)子步骤b2) 中所述可选的冲洗步骤可以进行至少一次，优选1-2次，可选1-3次，1-4次，1-5次或 更多次。本发明方法步骤b子步骤b2)中的冲洗可以按照水和/或醇类溶剂的特定顺序 来进行。例如，先进行第一步冲洗，用水或者其它任何前面提到的醇类溶剂冲洗柱子至 少一次，优选用水，例如冲洗1次、2次、3次等，例如用水冲洗1次。优选地，使用水 或者另一种溶剂进行第一步冲洗直到洗脱液呈无色。然后，使用不同的溶剂进行可选的 第二步冲洗，也就使用水或者前面定义的醇类溶剂进行冲洗，优选使用含有前面具体提 到过的浓度的醇类溶剂。优选柱子在第二步冲洗中至少被冲洗1次，2次，1-3次，1-4 次，1-5次或者更多次，优选使用前面定义的醇类溶剂冲洗1-3次。所述醇类溶剂优选为 前面定义的那些溶剂。优选使用1，2，3，4，5，(1-2，1-3，1-4, 1-5)倍柱床体积， 或者更多倍柱床体积溶剂来进行所述第二步可选的冲洗，优选1-3倍柱床体积。根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法纯化步骤b)子步 骤b3)，从柱子中洗脱出来浓缩的植物提取物。可以选择前面记载的那些溶剂从柱子中洗 脱出提取物，这些溶剂包括醇，例如乙醇、甲醇、异丙醇，优选乙醇或甲醇，或者酮， 例如丙酮，或者前面定义的合适的醇类溶剂。所述合适的醇类溶剂可以是任何前面定义 的醇类溶剂，例如乙醇/水混合物，包括但不限于，所述含有比率(％)为约100/00至约 70/30乙醇/水(ν/ν)的乙醇/水混合物，例如比率(％ )为约100/00乙醇/水(ν/ν)， 约 95/5 乙醇 / 水(ν/ν)，约 90/10 乙醇 / 水(ν/ν)，约 85/15 乙醇 / 水(ν/ν)，约 80/20 乙醇/水(v/V)，约75/25乙醇/水(ν/ν)，或者约70/30乙醇/水(ν/ν)。更优选地， 乙醇/水混合物中乙醇/水的比率(％ )为约100/00乙醇/水(ν/ν)至约95/5乙醇/水 (ν/ν),最优选约 95/5、96/4、97/3、98/2、99/1 或者 100/0 乙醇 / 水(ν/ν)。可选但不 是最优地，本发明方法纯化步骤b)子步骤b3)中的醇类溶剂可以选自甲醇/水混合物， 其中甲醇/水混合物中甲醇/水的比率与前面定义的乙醇/水混合物中乙醇/水的比率相 同，或者选自异丙醇/水混合物，其中异丙醇/水混合物中异丙醇/水的比率与前面定义 的乙醇/水混合物中乙醇/水的比率相同。用于纯化步骤b)子步骤b3)从柱子中洗脱出 浓缩的植物提取物中所用的溶剂可以是1、2、3、4、5、(1-2、1-3、1_4、1_5)倍柱床 体积，或者更多倍柱床体积，优选2-5倍柱床体积。根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法纯化步骤b)可选 的子步骤b4)，可选地，所获得的浓缩的植物提取物可以按照前面记载的提取步骤a)所 用的方法来进行干燥。优选地，植物提取物的干燥方法包括但不限于，喷雾干燥、带 干燥、冷冻干燥等，优选干燥至不挥发物质含量为约100%或者接近100%，例如含有约 10-0%水和约90-100%不挥发物质，上述含量值以干燥前植物提取物的总重为基数进行 计算，例如洗脱后纯化步骤b)子步骤b3)获得的提取物总重。
本发明方法纯化步骤b)子步骤b4)中干燥植物提取物的过程还可以进一步与前 面提到的用于提取步骤a)中的热_/高温处理相结合，或者是先进行干燥再进行热_/高温 处理，从而提高浓缩的植物提取物的储存时间，优选允许所述浓缩植物提取物的储存， 例如如果在使用前所述提取物需要被储存。
根据一个特别优选的实施方式，如果用于实验室规模的生产，优选本发明从粉 绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤b)的纯化含有下列特定特征 (纯化工艺PL)PLl)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中，所 述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180或者任何其他供应商提供的任何其它 等效的树脂； PL2)用水冲洗柱子1次，优选至少2次，可选3次，优选直至洗脱液呈无色为 止；使用乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次，优选混合物含有乙醇/水的比率与前面定 义的一样，例如，乙醇/水(v/V)的比率为约0/100至约10/90，更优选约5/95，优选用 1-3倍柱床体积；和PL3)使用前面定义的醇类溶剂从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物，优选使用乙 醇/水混合物，更优选该混合物中乙醇/水(ν/ν)的比率(％)为前面定义的比率，例如 在约95/5至约100/0之间，最优选约96/4，优选使用2_5倍柱床体积。PL4)可选地，干燥步骤PL3)获得的浓缩的植物提取物。根据一个特别优选的实施方式，如果用于工业规模的生产，优选本发明从粉绿 叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤b)的纯化含有下列特定特征(纯 化工艺PF)PFl)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中，优 选使用渗滤(提取类型)工艺(工艺步骤EPl至EP7)，更优选使用乙醇/水(ν/ν)比率
)为约25/75的乙醇/水混合物，所述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180 或者任何其他供应商提供的任何其它等效树脂；将柱子洗脱液返回至柱子中，优选返回 3次；PF2)用水冲洗柱子至少1次，优选冲洗至洗脱液呈无色为止；使用乙醇/水(ν/ ν)比率(％ )在约10/90至约0/100之间的乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次，优选使用 2倍柱床体积的溶剂；以及PF3)使用乙醇/水混合物从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物，该混合物中乙醇/ 水(ν/ν)比率(％ )为约95/5至约100/0之间，优选约96/4、97/3、98/2、99/1或者约 100/0，最优选约96/4。PF4)可选地，干燥步骤PF3)获得的浓缩的植物提取物。根据另一个特别优选的实施方式，如果用于工业规模的生产，优选本发明从粉 绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤b)的纯化含有下列特定特征 (纯化工艺ES)PSl)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中，优 选使用浸渍(提取类型)工艺(工艺步骤EMl至EM7)，更优选使用乙醇/水(ν/ν)比率 (% )为约65/35的乙醇/水混合物，所述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180 或者任何其他供应商提供的任何其它等效树脂；将柱子洗脱液返回至柱子中，优选返回 3次；PS2)用水冲洗柱子至少1次，优选冲洗至洗脱液呈无色为止；使用乙醇/水(ν/ ν)比率(％ )在约10/90至约0/100之间的乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次，优选使用2倍柱床体积的溶剂；以及PS3)使用乙醇/水混合物从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物，该混合物中乙醇/ 水(ν/ν)比率(％ )为约95/5至约100/0之间，优选约96/4、97/3、98/2、99/1或者约 100/0，最优选约96/4。前面提到的任何可替换方法都可以相互结合使用。例如用于工业化规模生产的 提取工艺EP或者EM (或者用于实验室规模生产的提取工艺)可以与用于工业化规模生产 的纯化工艺PF或者PS进行适当的结合。浓缩的棺物提取物本发明进一步涉及一种粉绿叶茄浓缩的植物提取物，该植物提取物是由前面所 定义的从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法直接获得的产品，也就 是由前面定义的方法获得的或者可以由前面定义的方法获得的产品。这种浓缩的植物 提取物特征在于其含有特殊的有利成分，这些成分只有通过前面定义的特定方法才能获 得。更具体地，直接由前面定义的方法或者可由前面定义的方法获得的浓缩的植物提取 物优选具有以下成分■活性成分_维生素D3代谢产物，优选浓度至少为300 μ g/g活性维生素D3,优选大于 500yg/g,更优选大于2000 μ g/g，优选所述浓度以1，25-二羟基维生素D3的总量来计 量确定，优选维生素D3代谢产物以糖苷形式存在或者以1，25-二羟基维生素D3不同糖 苷的混合物存在，或者更优选以下式⑴的1，25-二羟基维生素D3-I β-吡喃葡萄糖苷 形式存在以及
权利要求
1.一种从粉绿叶茄制备和纯化富含1，25- 二羟基维生素D3糖苷和槲皮苷的浓缩植物 提取物的方法，其中所述方法包括以下步骤a)使用醇类溶剂提取粉绿叶茄种的植物或植物的部分；和b)使用下列步骤纯化根据步骤a)获得的植物提取物bl)将根据步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中；b2)可选地，用水和/或醇类溶剂冲洗柱子；b3)从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物；以及b4)可选地，浓缩和/或干燥所述浓缩的植物提取物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a)包括对粉绿叶茄种的植物或植物的部分 进行研磨、渗滤和/或浸渍的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述醇类溶剂选自由以下组成的组水和醇 组成的混合物，或者醇，其中所述醇优选自甲醇、乙醇或异丙醇。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述醇类溶剂选自乙醇/水(ν/ν)比 率(％ )在约100/0至约0/100之间的乙醇/水混合物，包括具有以下比率(％ )的乙醇 / 水混合物100/0 (ν/ν)，约 95/5 (ν/ν)，约 90/10 (ν/ν)，约 85/15 (ν/ν)，约 80/20 (ν/ ν)，约 75/25(ν/ν)，约 70/30(ν/ν)，约 65/35(ν/ν)，约 60/40(ν/ν)，约 55/45(ν/ν)， 约 50/50(ν/ν)，约 45/55(ν/ν)，约 40/60(ν/ν)，约 35/65(ν/ν)，约 30/70(ν/ν)，约 25/75 (ν/ν)，约 20/80 (ν/ν)，约 15/85 (ν/ν)，约 10/90 (ν/ν)，约 5/95 (ν/ν)，或者约 0/100 (ν/ν),或者选自由前面提到的特定值中任意两个值所组成的比率范围，或者选自 具有前述提到比率的甲醇/水或者异丙醇混合物。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述醇类溶剂选自乙醇/水比率(％) 在约80/20至约50/50之间的乙醇/水混合物，和/或选自乙醇/水(ν/ν)比率(％ )在 约35/65至约20/80之间的乙醇/水混合物，对于渗滤类型的提取，优选乙醇/水(ν/ν) 比率(％ )为约25/75或约75/25的乙醇/水混合物，或者对于浸渍类型的提取，优选乙 醇/水(ν/ν)比率(％ )为约65/35的乙醇/水混合物。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中溶剂/药材的比率(％)为约4-40(ν/ w)，或者优选为约4-30 (v/w)或者约4-25 (v/w)，对于渗滤类型的提取，所述溶剂/药 材的比率更优选为约7-12或者8-10 (v/w)，最优选为约9 (v/w)，对于浸渍类型的提取， 所述溶剂/药材的比率更优选为约3-7或者4-6 (v/w)，最优选为约5 (v/w)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述醇类溶剂进一步含有添加剂，所 述添加剂选自抗氧化剂，所述抗氧化剂包括抗坏血栓、生育酚和胶体类型的抗氧化剂， 包括E310，E211或者E312，和/或所述添加剂选自有机酸，包括醋酸、硫酸、柠檬酸。
8.根据权利要求7所述的方法，其中抗坏血栓存在的浓度为约0.01%(w/v)至约2% (w/v),优选浓度为约0.05% (w/v)至约(w/v),最优选浓度为约0.05% (w/v)至约 0.5% (w/v),其中生育酚或者胶体类型的抗氧化剂(E310，E211orE312)存在的浓度为约 0.02至约(w/v),更优选浓度为约0.05% (w/v)至约0.25% (w/v),和/或其中酸存 在的浓度为约0.05% (w/v)至约(w/v),更优选浓度为约0.1% (w/v)至约0.5% (w/V) 。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中步骤a)在约20或30°C至约85°C温度下进行，更优选在约30°C至约70°C下进行，最优选在约40°C至约60°C下进行，特别是 在约40°C，约45°C，约50°C，约55°C，或者约60°C下进行，更优选在约50°C，约55°C 或者约60°C下进行，或者在由前面提到的任意数值组成的温度范围下进行。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中将步骤a)中溶剂的pH值调节至约 4.0至约8.0之间的一特定pH值，优选调节至约5.5至约6.5之间的一特定pH值。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中根据步骤a)的提取可以重复至少 1次，优选1-2次，1-3次，1-5次，或者更多次。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中根据步骤a)和/或b)获得的提取 物可以被过滤。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，将根据步骤a)和/或b)获得的植物提 取物浓缩或干燥至含有约85-75%水和约15-25%不挥发物质，约80-70%水和约20-30% 不挥发物质，约75-65%水和约25-35%不挥发物质，约70-60%水和约30-40%不挥发物 质，或者约65-55%水和约35-45%不挥发物质。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，对根据步骤a)和/或b)获得的提取物 进行喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，对根据步骤a)获得的提取物进行热_/ 高温处理。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，当以工业规模实施步骤a)时，其为渗 滤类型的提取并包括以下子步骤(提取工艺EP)EPl)将粉绿叶茄种的植物或植物部分填充到至少一个(循环填充的)容器中；EP2)加入醇类溶剂，其中该醇类溶剂优选自乙醇/水比率(％)为约25/75的乙醇 /水混合物，或者约75/25的乙醇/水(ν/ν)混合物，其中溶剂/药材比率为约7-12 (ν/ w)，优选为约9(v/w)；EP3)可选地，将pH调节至约5.5-6.5 ；EP4)在所述醇类溶剂中提取所述粉绿叶茄种的植物或植物部分，优选流速为 800-1200升每小时，更优选1000升/小时；优选提取6-48小时，更优选提取24小时；EP5)在提取过程中将混合物加热至约40-75°C，更优选约40-60°C ；EP6)可选地，将由步骤P4和P5获得的植物提取物浓缩至溶液中含有约75-65%水 和约25-35%不挥发物质；以及EP7)可选地，喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥所述(浓缩的)植物提取物。
17.根据权利要求1-15任一项所述的方法，当以工业规模实施步骤a)时，其为浸渍 类型的提取并包括以下子步骤(提取工艺EM)EMl)将粉绿叶茄种的植物或植物部分填充到至少一个容器中，优选该容器带有搅拌 器和加热器；EM2)加入如前面定义的醇类溶剂，其中所述醇类溶剂优选自乙醇/水(ν/ν)比率 (%)为约65/35的乙醇/水混合物，其中溶剂/药材的比率为约4-6 (v/w)，所述醇类溶 剂进一步含有权利要求7或8中定义的添加剂；EM3)可选地，将pH调节至约5.5-6.5，优选约5.5 ；EM4)约55°C下在所述醇类溶剂中提取粉绿叶茄种的植物或植物部分约24小时；EM4)从所述容器中回收植物提取物并进行过滤，优选通过将植物提取物泵送通过 50 μ m筛网的方式进行过滤；EM5)可选地，使用与前面定义的乙醇/水混合物相同的混合物冲洗由提取步骤M4 和M5剩下的固体1次或2次；EM6)可选地，通过先在真空条件下蒸发有机溶剂然后再蒸发水的方式来浓缩所述植 物提取物，直至获得含有75-65%水和25-35%不挥发物质的溶液；以及EM7)可选地，喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥所述(浓缩的)植物提取物。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中非离子型聚合物树脂选自(多孔或 无孔的)非离子型聚合物树脂，包括聚苯乙烯、苯乙烯二乙烯苯共聚物、丙烯酸酯聚合 物，以及多酚树脂。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中非离子型聚合物树脂选自 AmberliteXAD-I、XAD-2、XAD-4、XAD-5、Diaion HP10、HP20、HP30、HP40、 HP50、Amberlite XAD-7、XAD-7HP、XAD-8 或 XAD-1180，以及 Duolite S-30，优选 自 Amberlite XAD-树脂，包括 Amberlite XAD-1、XAD-2、XAD-4、XAD-5、XAD-7、 XAD-7HP、XAD-8 或 XAD-1180，以及更优选自树脂 Amberlite XAD-7、XAD-7HP、 XAD-8 或 XAD-1180。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中在纯化步骤b的子步骤b2)中，使 用水冲洗提取物，和/或使用乙醇/水比率(％ )在约0/100至约20/80 (ν/ν)之间的乙醇 /水混合物冲洗提取物，所述乙醇/水混合物包括乙醇/水(ν/ν)比率(％ )为约0/100、 约5/95、约10/90、约15/85、或约20/80的乙醇/水混合物。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中纯化步骤b的子步骤b2)至少进行 1次，优选1-2次，可选1-3次、1-4次、1-5次或更多次。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中步骤b)的子步骤b2)先用水冲洗 提取物至少1次，随后使用权利要求20定义的醇类溶剂冲洗至少1次。
23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中纯化步骤b的子步骤b2)中，使用 醇或者醇/水混合物从所述柱子中洗脱出所述提取物，其中所述醇选自乙醇、甲醇、异 丙醇。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述醇/水混合物是乙醇/水(ν/ν)比率(％) 为约100/0至约70/30之间的乙醇/水混合物，包括约100/0乙醇/水(ν/ν)，约95/5 乙醇/水(ν/ν)，约90/10乙醇/水(ν/ν)，约85/15乙醇/水(ν/ν)，约80/20乙醇/ 水(ν/ν)，约75/25乙醇/水(ν/ν)，和约70/30乙醇/水(ν/ν)的乙醇/水混合物，优 选为约95/5乙醇/水(ν/ν)至约100/0乙醇/水(ν/ν)的乙醇/水混合物，更优选为约 96/4、97/3、98/2、99/1或者100/0乙醇/水(ν/ν)的乙醇/水混合物，最优选为96/4 乙醇/水(ν/ν)的乙醇/水混合物。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中当以工业规模实施步骤b)时，其 包括以下特定步骤(纯化工艺PF)PFl)将根据步骤a)获得的所述植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子 中，优选使用乙醇/水(v/V)比率(％ )为约25/75的乙醇/水混合物进行渗滤工艺(工 艺步骤EPl至EP7)，所述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180或者任何其他供应商提供的任何其它等效树脂；将柱子洗脱液返回至柱子重复洗脱，优选返回洗脱3 次；PF2)用水冲洗柱子至少1次，优选冲洗至洗脱液呈无色为止；使用乙醇/水(ν/ν) 比率(％ )在约10/90至约0/100之间的乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次，优选使用2 倍柱床体积的溶剂；以及PF3)使用乙醇/水(ν/ν)比率(％ )为约95/5至约100/0之间的乙醇/水混合物从 柱子中洗脱出浓缩的植物提取物，优选乙醇/水(v/V)的比率(％)为约96/4、97/3、 98/2、99/1或者约100/0，最优选为约96/4。
26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中当以工业规模实施步骤b)时，其 包括以下特定步骤(纯化工艺PS)PSl)将根据步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中，优 选使用乙醇/水(v/V)比率(％ )为约65/35的乙醇/水混合物进行浸渍工艺(工艺步骤 EMl至EM7)，所述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180 ；将柱子洗脱液返 回至柱子重复洗脱，优选返回洗脱3次；PS2)用水冲洗柱子至少1次，优选冲洗至洗脱液呈无色为止；使用乙醇/水(ν/ν) 比率(％ )在约10/90至约0/100之间的乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次，优选使用2 倍柱床体积的溶剂；以及PS3)使用乙醇/水(ν/ν)比率(％ )在约95/5至约100/0之间的乙醇/水混合物从 柱子中洗脱出浓缩的植物提取物，优选乙醇/水(v/V)的比率(％)为约96/4、97/3、 98/2、99/1或者约100/0，最优选为约96/4。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的粉绿叶茄植物提 取物的方法获得或者可以通过该方法获得的粉绿叶茄浓缩的植物提取物。
28.根据权利要求27所述的浓缩的植物提取物，其含有以下成分a)维生素D3代谢产物，其优选浓度至少为300 μ g/g的活性维生素D3,优选大于 500 μ g/g,更优选大于2000 μ g/g，优选通过1，25-二羟基维生素D3的总量来计量，优 选维生素D3代谢产物以糖苷形式存在或者以1，25- 二羟基维生素D3不同糖苷的混合物 存在，或者更优选以下式⑴1，25- 二羟基维生素D3-I β -吡喃葡萄糖苷形式存在
29.根据权利要求27或28所述的浓缩植物提取物，其进一步含有 C)无机物最大含量6% ；d)碳水化合物50-75%之间；e)蛋白小于2%；f)脂肪小于2%。
30.根据权利要求27至29任一项所述的浓缩植物提取物，其另一个特征在于生物碱 含量低于检测限10yg/g。
31.合成的植物提取物组合物，含有以下成分a)维生素D3代谢产物，优选浓度至少为300yg/g的活性维生素D3,优选大于 500 μ g/g,更优选大于2000 μ g/g，优选通过1，25-二羟基维生素D3的总量来计量，优 选维生素D3代谢产物以糖苷形式存在或者以1，25- 二羟基维生素D3不同糖苷的混合物 存在，或者更优选以下式⑴1，25- 二羟基维生素D3-I β -吡喃葡萄糖苷形式存在
32.根据权利要求31所述的合成的植物组合物，其中所述至少一种黄酮醇选自杨梅黄 素、槲皮素、山萘酚、非瑟酮、异鼠李素、藿香黄酮醇、甲基鼠李黄酮、藤菊黄素、异 泽兰素、去甲泽兰黄醇素、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮、5-羟基-7-甲氧基 黄酮、7-羟基-5-甲基黄酮，或者它们的糖苷。
33.根据权利要求31或32所述的合成的植物提取物组合物，其中所述至少一种黄酮 醇选自槲皮素或其糖苷。
34.含有以下成分的药物组合物(a)根据权利要求1-30任一项所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物，或者根据权利要求 31至33任一项所述的(合成的)植物组合物；以及(b)可选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
35.根据权利要求1-30任一项所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物，或者根据权利要求 31至33任一项所述的(合成的)植物组合物用于制备预防或治疗骨质量减少相关的疾病 的药物组合物的用途，所述疾病包括人体或动物体的骨质减少或骨质疏松。
36.根据权利要求1-30任一项所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物，或者根据权利要求 31至33任一项所述的(合成的)植物组合物用于制备预防或治疗胫骨软骨发育异常的药 物组合物的用途，优选用于治疗家禽胫骨软骨发育异常。
37.根据权利要求1-30任一项所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物，或者根据权利要求 31至33任一项所述的(合成的)植物组合物用于制备预防或治疗产奶动物的产后轻瘫或产乳热的药物组合物的用途。
38.根据权利要求1-30任一项所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物，或者根据权利要求 31至33任一项所述的(合成的)植物组合物用作人体或兽医用的饮食补充剂的用途。
39.试剂盒，其包括根据权利要求1-30任一项所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物或者根 据权利要求31至33任一项所述的(合成的)植物组合物和/或根据权利要求34所述的 药物组合物，以及可选的技术说明书或说明书手册。
全文摘要
本发明涉及从粉绿叶茄中制备具有高含量1，25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇的浓缩的且平衡的植物提取物，所述黄酮醇尤其是槲皮苷。本发明特别记载了一种工业规模或实验室规模制备前述提取物的方法。本发明还记载了前述植物提取物或者与其类似的(合成的)组合物用于预防和治疗骨质量减少相关的疾病，例如骨质减少或骨质疏松，用于预防和治疗胫骨软骨发育异常，优选家禽胫骨软骨发育异常，用于治疗产乳热，以及用作人体或动物体的饮食补充剂。
文档编号A61P19/00GK102014945SQ200880128743
公开日2011年4月13日 申请日期2008年4月21日 优先权日2008年4月21日
发明者塞布丽娜·奥岑, 海因里希·巴赫曼 申请人:赫伯尼斯股份公司