专利名称：羊毛甾-8,24-二烯-3-醇的药学用途的制作方法
技术领域：
本发明一般来说涉及四环萜烯醇家族的羊毛留-8，24- 二烯-3-醇通过抑制某些 酶而作为抗炎、抗癌和/或镇痛药的药学用途，所述酶的活性与某些类型的癌症的增生相关。在下文中，将会经常提到化合物大戟醇，它是羊毛留_8，24- 二烯-3-醇家族的 一个成员，应当知道，这仅仅是为了便于参考的原因，因此，没有其它羊毛甾-8，24-二 烯-3-醇化合物排除在本发明之外。
背景技术：
癌症是一组超过100种疾病的名称，所述疾病通常具有侵袭组织和器官的细胞的 无组织生长，而且可蔓延至身体的其它区域，这称为转移。不同种类的癌症对应于不同种类的体细胞。例如，有若干种类的皮肤癌，因为皮肤 是由不止一种细胞构成的。如果癌症始于上皮组织，例如皮肤或黏膜，就称为癌。如果它始 于结缔组织，例如骨、肌肉或软骨，就称为肉瘤。将一种癌症与其它癌症区分开来的其它表 征是细胞增殖速率以及它们侵袭邻近或远离其起源的其它组织和器官的能力。C类蛋白激酶(H(C)包括其功能和调节都高度保守的一组蛋白激酶。激酶也称为 磷酸转移酶，它们将来自其底物的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化并调节多种细胞活性，包括 基因表达、有丝分裂、细胞移动、代谢和程序细胞死亡(细胞凋亡)。PKC在激活之前经过磷 酸化，这个过程发生在它从细胞溶质转移到原生质膜期间。它们的激活和从细胞溶质向原 生质膜的转移过程的发生是为了响应二酰基甘油(DAG)的瞬时增加，或响应通常存在于植 物中的称为佛波酯的外源物质。PKC家族包括12个同种型，分为3亚类常规型(cH(C，钙依赖型并由DAG和磷 脂酰丝氨酸激活)、原始型(rfKC，钙独立型，但由DAG和磷脂酰丝氨酸激活)和非典型型 (aPKC，钙独立型并由磷脂酰丝氨酸激活，而不是由DAG激活)。在一个细胞内，在向细胞 膜转移前后，同种型的分布不同，文献表明，PKC在膜和核的细胞质区室(citoplasmatic compartment)的亚细胞位置的差异可影响某种细胞相关的各同种型的功能。近年来，若干研究已经证明了 PKC的异常激活与包括类风湿性关节炎、多发性硬 化、大肠炎和不同种类的癌症在内的病理过程的发展之间的关系。近来，有关PKC涉及癌症 的假说已经得到众多关注，尤其是根据以下发现这些酶是肿瘤天然促进剂佛波酯的底物。 丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(包括I3KC)的增加或降低的激活、或者由它们所调节的转录因子 的增加或降低的激活，可导致细胞无组织生长，诱导癌症过程。就这个意义而言，许多研究 已经证明，在PKC激活之后，发生转录因子磷酸化的增加，其中，核因子KB(NF-KB)和激活 蛋白I(AP-I)反过来又调节对肿瘤发展具有重要性的若干蛋白质的表达，所述蛋白质包括 环加氧酶-2(CiClOOXigenase-2，C0X-2)。这样，所述胞内途径的激活或阻遏，天然化合物 可干扰异常细胞的生长和增殖。佛波酯来源于四环二萜并且似乎局限在大戟科(Euphorbiaceae)和瑞香科 (Thymelaceae)植物中。因为它们具有特定的促进肿瘤的诱导作用和促炎作用，所以频繁地对这些化合物进行研究。调节佛波酯促进肿瘤的诱导作用的分子机制不同于触发炎性活 性的机制。促进肿瘤的诱导作用看来与它们在PKC激活中替代DAG的能力相关，并且还与 它们刺激RNA蛋白和DNA蛋白的合成、作为促有丝分裂剂和刺激细胞生长的能力有关。对 于促炎活性，佛波酯动员磷脂，释放花生四烯酸并引起前列腺素的分泌，导致组织的炎性反 应。佛波酯、尤其是TPA(十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)的局部应用，已经增进了对炎症过 程和癌症的相关分子机制的了解。在临床前试验的不同时期，已经测试了某些PKC抑制剂用于治疗癌症。它们中 的一种是enZastaurin(LY317615)，它在口服给予时显示出重要活性，并在不同癌症模 型中、在体外和体内显示出功效(Journal of Investigative Dermatology(2006) 126, 1641-1647 ；Cancer Res(2005) 65 :7462-7469 ；MoI Cancer Ther. (2006)5 :1783-1789)。用NSAID(非类固醇类抗炎药)和类固醇类药物(类皮质激素)治疗炎性疾病的 主要问题是它们所引起的不良反应和它们的非总体有效性。最频繁报道的副作用是头 痛、胃痛、呕吐、腹泻、胃病例如胃和十二指肠溃疡。类皮质激素可升高血压，引起asteny和 肌病、消化性溃疡、瘀点、红斑、痤疮、慢性头痛、多毛症、儿童生长抑制(在长期治疗中)、闭 经、白内障和青光眼、食欲和体重增加、恶心。NSAID，选择性C0X-2，也会增加严重血栓性心 血管事件、冠状动脉血栓形成和中风的危险。对于癌症的有效治疗而言，困难在于确定恶性体细胞与正常体细胞之间的区别。 它们共享相同来源并且非常相似，导致免疫系统部分在面对威胁时无法识别。迄今为止，已 经通过手术、化疗、放疗和免疫治疗(单克隆抗体治疗)的方式来治疗癌症。治疗的选择取 决于肿瘤的位置、程度和疾病的阶段、以及患者的全身状态。完全除去肿瘤、而不损伤生物 体的其余部分，是治疗的主要目标，这有时可通过手术的方式而达到，但是该疾病侵袭邻近 组织或向远端部位扩张(转移)的倾向性常常会限制其功效。化疗的功效通常受到其对生 物体其它细胞的毒性的限制，而放疗可损伤正常组织。在免疫治疗中，癌细胞发展出逃避免 疫应答的机制，这种现象称为治疗抗性。附图简述
图1表明耳朵厚度在应用所测化合物前后随时间的变化。图2表明3种所测组合物的吸光度。白框阳性对照，即TPA(十四烷酰佛波 醇-13-乙酸酯)，2，5yg/耳，在包含丙酮乙醇的3 1混合物的溶媒中；黑框阴性对 照，即丙酮乙醇的3 1混合物的溶媒；和灰框每耳100 μ g大戟醇和2，5 μ g TPA的混 合物，在包含丙酮乙醇的3 1混合物的溶媒中。图3A和图3B，图3A是时间与反应频率的图解，图表示每种所测化合物的图3A 的曲线下面积，允许它们之间进行％比较。图4A、图4B和图4C，图4A是时间与反应频率的图解，图4B和图4C表示每种所测 化合物的图4A的曲线下面积，允许它们之间进行％比较。图5A、图5B和图5C，图5A是时间与反应频率的图解，图5B和图5C表示每种所测 化合物的图4A的曲线下面积，允许它们之间进行％比较。发明详述考虑到现有技术，本发明提供了羊毛留-8，24- 二烯-3-醇在酶、尤其是PKC的抑 制中的用途，所述酶活性与癌细胞增殖有关。因此，本发明也涉及羊毛留-8，24-二烯-3-醇在有效治疗肿瘤、炎症和/或疼痛中的用途，所述治疗是显著的，没有迄今为止已知的缺 陷。合适的羊毛留-8，24-二烯-3-醇是大戟醇、甘遂醇和羊毛固醇、它们的异构体、衍 生物(尤其是乙酸酯)、溶剂合物或水合物，不排除任何其它。羊毛留_8，24-二烯-3-醇可 得自例如大戟科植物，或通过本发明无关的化学合成途径而获得。因此，在第一方面，本发明涉及羊毛留-8，24- 二烯-3-醇在生产药物组合物中的 用途，所述药物组合物抑制丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶增加或降低的激活或者由它们所调节 的转录因子的增加或降低的激活。本发明的化合物抑制所述激酶、尤其是I3KC(蛋白激酶C) 的激活，所述酶的活性已知与癌细胞相关。再具体地讲，所述激酶所调节的转录因子包括核 因子K B (NF- K B)和/或激活蛋白1 (AP-I)。可以任何合适的方式，将本发明的羊毛留-8，24-二烯-3-醇以及包含它们的组 合物给予需要治疗的患者，所述方式是肠内或胃肠外，包括口服、局部、透皮、皮下、腹膜内、 静脉内、通过渗透、通过吸入、透皮、透黏膜、肌内、肺部内、阴道、直肠、眼内和舌下。本发明 尤其合适的给药方式是局部和系统给药(渗透、口服、通过喷雾而吸入、透皮)。本发明的 羊毛留_8，24-二烯-3-醇可包含在缓释或控释组合物中。已知的佐剂和赋形剂可用于这 样的组合物，用于本发明相关组合物的给药形式的参考资料可参见出版物Remington的 Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing，1965—1990。不排除该家族的任何其它化合物，合适的羊毛甾-8，24- 二烯-3-醇是一种或多种 大戟醇(RN 514-47-6)、甘遂醇(RN 514-46-5)和羊毛固醇(RN 79-63-0)，更尤其是大戟醇。在另一方面，本发明涉及羊毛留_8，24- 二烯-3-醇或其组合物在生产用于治疗肿 瘤和/或炎症和/或疼痛(伤害感受反应)的药物组合物中的用途。可以固体、液体或半液体、片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、分散剂 和任何其它可用的已知药学上可接受的形式，给予本发明的组合物。所述组合物还可含有 其它活性剂，例如抗生素，这取决于想要的效果。对于供口服给药的片剂或胶囊剂(软质和 硬质胶囊剂)，可将所述羊毛留_8，24- 二烯-3-醇与例如以下药学上可接受的惰性溶媒混 合乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纤维素、硬脂酸镁、磷酸二钙、磷酸钙、甘露醇、山梨醇等； 对于液体形式的口服给药，可将所述羊毛留_8，24-二烯-3-醇与乙醇、甘油、水等混合。当 需要或必要时，可将胶凝剂、润滑剂、崩解剂、着色剂和香料添加到混合物中。常用的胶凝剂 是葡萄糖、β -乳糖、玉米甜味剂、天然或合成树胶(例如阿拉伯胶、西黄蓍胶)或藻酸钠、羧 甲基纤维素、聚乙二醇、蜡等。润滑剂包括油酸钠、硬脂酸钠、硬脂酸镁、苯甲酸钠、乙酸钠、 氯化钠。崩解剂包括淀粉、甲基纤维素、琼脂、皂土、黄原胶等。也可以脂质体形式或与作为载体的可溶性聚合物偶联的形式给予本发明的组合 物。供口服给药用的液体剂型可包含着色剂和甜味剂，以增加患者的接受性。用于 含水剂型的可接受的溶媒是水、合适的油、盐水溶液、葡萄糖水溶液、其它糖溶液和二醇类 (例如丙二醇或聚乙二醇)、磷酸缓冲液。在又一方面，本发明涉及用于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶、尤其是PKC异常激活相关 的哺乳动物的身体病症的医学治疗方法，当所述病症影响了炎症和/或癌症和/或疼痛的出现或存在时，所述方法包括给予所述哺乳动物药理学有效量以及药理学上可接受的载体 或赋形剂，用于治疗所述病症。
实施例尽管以下实施例是本发明的具体实施方案，但是它们并不以任何方式强制限制本 发明不同于所附权利要求书所指示的范围。在以下所有实施例中，将20_30g雄性小鼠关在有过滤空气通风的笼子内，控制温 度(22士2°C )和湿度(50-60% )，12小时的光/12小时的暗周期，随意饮水和进食。将动 物留在实验室内，适应周期为至少1小时，然后再进行药理学试验，在8 00至17 00小时之 间进行。在以下所有实施例中，用Graph Pad Prism 5. 0软件进行统计学分析。实施例1通过比较局部使用以下试剂治疗小鼠耳朵的结果，来完成某些化合物的刺激效应 的表征-阳性对照，即TPA(十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)，2，5μg/耳，在包含丙酮乙 醇的3 1混合物的溶媒中。-阴性对照，即丙酮乙醇的3 1混合物的溶媒；-一种本发明的化合物即大戟醇，100 μ g/耳，在包含丙酮乙醇的3 1混合物 的溶媒中；-每耳100μ g大戟醇和2，5 μ g TPA的混合物，在包含丙酮乙醇的3 1混合物 的溶媒中。给5个成员一组的小鼠，在耳朵内面局部使用上述组合物。在暴露给所测组合物 的前后，用数字测微计测量耳朵厚度，反应值表示为πιμ。图1显示耳朵厚度在应用所测化 合物前后随时间的变化。结果见图1。如图所示，用大戟醇而得到的抑制效应是显著的，甚至在治疗后直到M小时，表 明对炎症的重要的药物动力学效应。实施例2本实施例是本发明化合物对小鼠皮肤上PKC活性的效应评价。动物接受以下 100 μ g/耳的组合物-阳性对照，即TPA(十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯)，2，5μg/耳，在包含丙酮乙 醇的3 1混合物的溶媒中。-阴性对照，即丙酮乙醇的3 1混合物的溶媒；-每耳100μ g大戟醇和2，5 μ g TPA的混合物，在包含丙酮乙醇的3 1混合物 的溶媒中。给5个成员一组的小鼠，在耳朵内面局部使用上述组合物。在暴露给所测组合物 的前后，用ELISA(酶联免疫吸附测定)测定PKC活性。图2显示上述3种所测组合物的吸 光度。如图所示，对于溶媒治疗组，TPA促进PKC活性显著增加，而用大戟醇治疗却显著 降低了由TPA所诱导的PKC活性的增加。
实施例3、实施例4和实施例5-伤害感受在10 次施用 Von Frey 丝(VHF，Stoelting, Chicago, USA)之后，用脚爪退缩的反 应频率来评价动物的伤害感受机械阈值。将动物单独放在升高的丝网平台上方的9x7x11cm 透明丙烯酸隔室中，允许接近脚爪足底面。将Von Frey丝施用于右后脚爪，观察标准(1) 用足以弯曲金属丝的压力垂直施用于足底面，以确保总压力；( 当所有4脚爪都适应丝网 时，评价动物；C3)当动物从丝网上完全移动脚爪时，认为就是脚爪退缩反应；(4)对每只动 物连续刺激10次，每次刺激的持续时间是1秒；(5)每次脚爪退缩就认为是10%反应，10次 退缩对应于100%反应。实施例3-由卡拉胶诱导的炎性伤害感受为了进行炎性疼痛的诱导，每只动物在右后脚爪上接受20μ 1足底内卡拉胶注射 (300yg/脚爪)。用0.9% (20μ1/脚爪)PBS(磷酸缓冲盐水)溶液治疗的动物用作对照。 该卡拉胶剂量在已注射的脚爪上产生水肿、伤害感受和大小显著增加。在卡拉胶注射前1小时，给动物口服大戟醇(30yg/kg)，进行治疗。在卡拉胶 注射前4小时，皮下注射0. 5mg/kg地塞米松而进行治疗的动物用作阳性对照。用0. 6g Von Frey丝，在8小时期间以及卡拉胶注射后M和48小时后，每小时评价超伤害感受 (Hypernociception) 0结果见图3A和图3B，图3A是时间与反应频率的图解，图表示每种所测化合物 的图3A的曲线下面积，允许它们之间进行％比较。如图所示，用大戟醇的急性治疗显著降低了由卡拉胶诱导的炎性机械超伤害感 受。大戟醇导致伤害感受反应降低，类似于用地塞米松治疗的对照组。实施例4-由CFA (完全弗氏佐剂)诱导的永久性炎性伤害感受给动物在足底内注射25μ 1 CFA，该剂量产生超伤害感受并增加已注射脚爪的大 小(Neuropharmacology, 41 1006—1012，2001 ；AnesthAnalg.，101 1763—1769，2005)。在CFA注射前1小时，给动物口服30mg/kg大戟醇或70mg/kg加巴喷丁(阳性对 照)，来进行治疗。通过在CFA注射后的1、2、4、6、8、M和48小时的时间间隔，以及直到伤 害感受反应重新建立时，用0.6g Von Frey丝进行刺激，以测定机械超伤害感受。此后，在 第3天，开始进行慢性治疗，以评价用大戟醇的持续治疗。为此，动物每天接受口服30mg/kg 大戟醇，计5天，并在首次给予后4小时，每天一次地评价超伤害感受。评价机械超伤害感 受，直到疼痛反应恢复为止。此后，再开始每天一次的治疗，计5天，以评价对所述化合物耐 受性的发展，并评价超伤害感受，直到伤害感受反应恢复为止。结果见图4A、图4B和图4C，图4A是时间与反应频率的图解，图4B和图4C表示每 种所测化合物的图4A的曲线下面积，允许它们之间进行％比较。如图4A和图4B所示，用大戟醇的急性治疗显著降低由CFA诱导的机械超伤害感 受，接近于用加巴喷丁所得到的效应。当每天一次给予大戟醇，计5天时，在接着的6天治疗期间观察到对由CFA所致的 伤害感受反应的抑制。开始持续治疗，再次降低了机械超伤害感受，如注射CFA之后的第3 天到第M天的曲线所示。用加巴喷丁的持续治疗，观察到类似抑制。实施例5-由坐骨神经部分缢缩而诱导的神经病疼痛此处所用方法类似于用于大鼠的所述方法(Pain，43 :205_218，1990)，该方法经改良而用于小鼠((Pain, 76 :215-222,1998)并由 Bortolanza 等(EurJ Pharmacol, 453 203-208,2002)标准化。用7%水合氯醛(0.6% ml/kg足底内)麻醉小鼠。然后在大腿上 部将坐骨神经暴露约至坐骨三叉部(sciatic trifurcation)，用8号缝合丝线将1/3-1/2 背侧部(dorsal portion)扎紧。在假操作组(false-operated group)，将坐骨神经暴露， 但不扎紧。在操作后第4天，一组动物口服30mg/kg大戟醇进行治疗，而另一组口服70mg/ kg加巴喷丁进行治疗，作为阳性对照。在治疗后的预定时间(1、2、4、6、8、对和48小时)， 通过用0.6Von Frey丝刺激来评价机械阈值。为了评价持续治疗的效果，从第6天开始，每 日给予动物大戟醇，计5天，在首次给予后4小时，每天一次地评价机械超伤害感受，直到伤 害感受反应恢复到类似于对照组为止。此后，重复延迟治疗方案，以评价对所述化合物的耐 受性的可能发展。结果见图5A、图5B和图5C，图5A是时间与反应频率的图解，图5B和图5C表示每 种所测化合物的图4A的曲线下面积，允许它们之间进行％比较。如图5A和图5B所示，用大戟醇或加巴喷丁的急性治疗显著抑制了由坐骨神经部 分缢缩而诱导的机械伤害感受反应。同样，用大戟醇或加巴喷丁的每天一次的持续治疗显著降低了由坐骨神经部分缢 缩而诱导的机械超伤害感受，在治疗的第10天才恢复伤害感受反应。借助于本文所给出的教导和实施例，本领域技术人员能够以同样方式重现本发 明，使用同样的功能，以得到类似结果，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明范围。
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权利要求
1.羊毛留-8，24-二烯-3-醇在生产药物组合物中的用途，所述药物组合物抑制丝氨 酸-苏氨酸蛋白激酶增加或降低的激活或者由它们所调节的转录因子的增加或降低的激活。
2.权利要求1的用途，其中所述蛋白激酶是蛋白激酶C。
3.权利要求1的用途，其中所述转录因子是核因子KB(NF-KB)和/或激活蛋白 1 (AP-I)。
4.权利要求1的用途，其中所述羊毛留_8，24-二烯-3-醇是一种或多种大戟醇、甘遂 醇和羊毛固醇、它们的异构体、衍生物、溶剂合物或水合物。
5.权利要求4的用途，其中所述羊毛留_8，24-二烯-3-醇的衍生物是乙酸酯。
6.权利要求1的用途，其中羊毛留_8，24-二烯-3-醇是大戟醇。
7.用于治疗肿瘤、炎症和/或疼痛的羊毛甾_8，24-二烯-3-醇。
8.权利要求7的羊毛留_8，24-二烯-3-醇，其中所述治疗涉及肿瘤。
9.权利要求7的羊毛留_8，24-二烯-3-醇，其中所述治疗涉及炎症。
10.权利要求7的羊毛留-8，24-二烯-3-醇，其中所述治疗涉及疼痛。
11.用于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶、尤其是I3KC异常激活相关的哺乳动物的身体病症的 医学治疗方法，所述方法包括给予所述哺乳动物药理学有效量以及药理学上可接受的载体 或赋形剂，用于治疗所述病症。
12.权利要求11的方法，其中所述身体病症影响了炎症和/或癌症和/或疼痛的出现 或存在。
13.权利要求11的方法，其中所述医学治疗涉及肿瘤。
14.权利要求11的方法，其中所述医学治疗涉及炎症。
15.权利要求11的方法，其中所述医学治疗涉及疼痛。
全文摘要
本发明一般来说涉及四环萜烯醇家族的羊毛甾-8，24-二烯-3-醇通过抑制丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶、尤其是PKC的异常激活而作为抗炎、抗癌和镇痛药的药学用途。
文档编号A61P29/00GK102112133SQ200880130708
公开日2011年6月29日 申请日期2008年8月5日 优先权日2008年8月5日
发明者C·P·查维斯, J·B·卡利克斯托, L·F·皮亚诺夫斯基, P·C·莱亚尔 申请人:阿马佐尼亚菲托药品有限公司