专利名称：接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法
技术领域：
本发明属于中成药含量测定技术领域，涉及一种含骨碎补的中成药含量测 定方法，特别是涉及接骨续筋制剂中骨碎补的含量测定。本发明具体是以骨碎 补中的柚皮苷作为指标成分计的含量测定方法。
背景技术：
接骨续筋片收载于卫生部药品标准《中药成方制剂》第11册第170页，标 准编号WS厂B-2226-96,处方为蜥蜴500g、骨碎补333g、穿山龙167g，剂型为 糖衣片，功能活血化瘀、消肿止痛，主治软组织损伤、骨折等，但缺乏含量测 定方法。
骨碎补是接骨续筋片(糖衣片)以及按照接骨续筋片处方制成的薄膜衣片、分 散片、胶囊、颗粒剂等接骨续筋制剂的主要药味，而柚皮苷是骨碎补的主要成 分之一，且性质稳定。因此，以柚皮苷含量作为接骨续筋制剂的质量控制指标 是一种行之有效的办法。
发明内容
本发明的目的是提供一种接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，本发明 利用高效液相色谱法测定接骨续筋制剂中的柚皮苷含量，以提高接骨续筋制剂 的质量标准。
本发明接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法包括以下步骤
1) 对照品溶液的制备取柚皮苷对照品适量，精密称定，以甲醇溶解，再 用甲醇和l. 5 ~ 2. 5%的醋酸溶液稀释，配制成一定柚皮苷浓度的对照品溶液；
2) 供试品溶液的制备取处理过的接骨续筋制剂样品适量，精密称定，加 甲醇适量，超声提取，再用甲醇和1.5 2. 5%的醋酸溶液稀释，配制成与对照品 溶液柚皮苷浓度相适应的供试品溶液，用O. 45戶微孔滤膜滤过；
3) 采用高效液相色谱法进行测定，其色谱条件为色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相甲醇1.5-2. 5%醋酸溶液=35 : 65 ~ 40 : 60; 柱温35~45°C; 检测波长283nm;
4) 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，测定柚皮苷色 谱峰的峰面积；
5) 以外标法计算接骨续筋制剂样品中的柚皮苷含量；
其中，制备成的对照品溶液与供试品溶液中的溶媒应满足甲醇1.5-2. 5% 醋酸溶液=1 : 0.8-1.3。
进一步地，本发明的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法包括
1) 对照品溶液的制备精密称取柚皮苷对照品适量，置适当的量瓶中，加 甲醇至刻度，摇匀，精密量取amL,置bmL量瓶中，加甲醇cmL，并满足a+c^. 5b; 再用1. 5 ~ 2. 5%醋酸溶液稀释至刻度，配制成一定柚皮苷浓度的对照品溶液；
2) 供试品溶液的制备精密称取处理过的接骨续筋制剂样品适量，置具塞 锥形瓶中，加甲醇25mL,称定重量，超声处理30min,冷却至室温，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置10mL量瓶中，加 1.5~2. 5%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，用O. 45戶微孔滤膜滤过，配制成与对照 品溶液柚皮苷浓度相适应的供试品溶液；
3) 采用高效液相色谱法进行测定，其色谱条件为 色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱；
流动相甲醇1. 5 ~ 2. 5%醋酸溶液=35 : 65 ~ 40 : 60; 柱温35~45°C; 检测波长2 8 3腿；
4) 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，测定柚皮苷色 谱峰的峰面积；5)以外标法计算接骨续筋制剂样品中的柚皮苷含量； 以上百分浓度均为质量百分浓度。
本发明接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法中
所述的对照品溶液为每lmL含10 6(^g柚皮苷的溶液，优选每lmL含约30(ig 柚皮苷的溶液。
所述的流动相比例可以适当调整，但优选甲醇1.5~2. 5%醋酸溶液=38 : 62;流动相的流速为O. 8~ 1. 2mL . mirT1，优选l. OmL . min—1。 所述的柱温优选4(TC。 进样量一般为10(aL或2(VL。
本发明中，所述对照品溶液和供试品溶液的柚皮苷浓度可做适当调整，但 要与进样量相结合，以符合线性浓度范围。
本发明中所述的接骨续筋制剂是指接骨续筋片(糖衣片、薄膜衣片、分散 片)、接骨续筋胶囊、接骨续筋颗粒剂等任何药剂学中所述的剂型。
所述的接骨续筋制剂中柚皮苷的含量，是指接骨续筋制剂中骨碎补所含柚 皮苷的量。
本发明人认为，中成药标准现代化是中医药现代化的重要组成部分，含量 测定是中成药标准现代化的难点和重点。选择中成药的主要药味中具有标志性 的化学成分为指标成分，测定其含量，是化学法测定中成药含量的主要手段； 而发明与通用的药品标准(特别是《中国药典》)收载的中药材所含指标成分的 含量测定方法具有一致性的中成药含量测定方法，也将应该是化学法测定中成 药含量的主流方向之一。
本发明选择接骨续筋制剂中的主要药味骨碎补所含柚皮苷为指标成分，通 过采用高效液相色谱法测定接骨续筋制剂中的柚皮苷含量来作为接骨续筋制剂 的质量控制指标，所建立的测定方法专属性强，线性关系好，准确度高，重复 性好，测定时间短，简便、快速，可以更科学地评价柚皮苷的转移率，有效地提高产品的质量。
图i是对照品溶液的高效液相色谱图2是供试品溶液的高效液相色谱图； 图3是阴性对照溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1
接骨续筋片(依据卫生部药品标准WS厂B-2226-96处方制成的糖衣片)中的 柚皮苷含量测定。
1) 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱(5^im, 4. 6mmx 200mm); 流动相甲醇2.25%醋酸溶液=35 : 65; 流速0. 9mL min—； 检测波长283nm; 柱温35°C。
理论板数按柚皮苷峰计算，应不低于2000。
2) 对照品溶液的制备精密称取在ll(TC千燥至恒重的柚皮苷对照品10rag， 置100mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇勻，精密量取3mL,置10raL量瓶中，加甲醇 2mL，再用2. 25%醋酸溶液稀释至刻度，摇勻，即得。
3) 供试品溶液的制备将接骨续筋片除去糖衣，粉碎，混匀，称取2. Og， 精密称定，置具塞锥形瓶中，加甲醇25mL,称定重量，超声处理30min，放冷， 再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5raL,置10mL 量瓶中，力口2.25%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(O. 45,)滤过，即 得。
4) 测定法分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各2(^L，注入液相色谱
7仪，测定。
5)计算法按照外标法计算，即得。
分别测定3批接骨续筋片样品，每片接骨续筋片中含柚皮苷分别为O. 19, 0.21, 0. 20mg。 实施例2
接骨续筋胶囊(依据卫生部药品标准WS3-B-2226-96处方制成的胶囊，规格: 每粒装0.4g)中的柚皮苷含量测定。
1) 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱(10罔,4, 6mmx 250mm); 流动相甲醇2. 25%醋酸溶液=38 : 62; 流速1. OmL min-1; 检测波长283nm; 柱温4(TC。
理论板数按柚皮苷峰计算，应不低于2000。
2) 对照品溶液的制备精密称取柚皮苷对照品3mg,置10mL量瓶中，加甲 醇至刻度，摇匀，精密量取lmL,置10mL量瓶中，加甲醇4mL,再用2. 25%醋酸溶 液稀释至刻度，制成每lmL含柚皮苷30ng的溶液，即得。
3) 供试品溶液的制备取接骨续筋胶囊内容物2. Og，精密称定，置具塞锥 形瓶中，加甲醇25mL,称定重量，超声处理30min,冷却至室温，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5mL，置10mL量瓶中，加 2.25%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(O. 45,)滤过，即得。
4) 测定法分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10pL，注入液相色谱 仪，测定。
5) 计算法按照外标法计算，即得。
分别测定3批接骨续筋胶囊样品，每粒接骨续筋胶囊中含柚皮苷分别为0.26， 0.27， 0. 26mg。 实施例3
接骨续筋胶囊(依据卫生部药品标准WS3-B-2226-96处方制成的胶囊，规格: 每粒装0.4g)中的柚皮苷含量测定。
1) 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱(l(Vm， 4. 6mmx 250mm); 流动相甲醇2. 25%醋酸溶液=40: 60; 流速1. 2mL min— 检测波长283nm; 柱温45°C。
理论板数按柚皮苷峰计算，应不低于2000。
2) 对照品溶液的制备精密称取在ll(TC干燥至恒重的柚皮苷对照品15mg, 置50mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，精密量取lmL,置10mL量瓶中，加甲醇4mL， 再用2. 25%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
3) 供试品溶液的制备取接骨续筋胶囊内容物2. Og，精密称定，置具塞锥 形瓶中，加甲醇25mL，称定重量，超声处理30rain，冷却至室温，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5mL，置10mL量瓶中，加 2.25%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45，)滤过，即得。
4) 测定法分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10^iL，注入液相色谱 仪，测定。
5) 计算法按照外标法计算，即得。
分别测定3批接骨续筋胶囊样品，每粒接骨续筋胶囊含柚皮苷分别为0. 26, 0.26， 0. 27mg。 实施例4
专属性考察按照本发明提供的对照品溶液和供试品溶液制备方法分别制
9备对照品溶液和供试品溶液；按照接骨续筋制剂的处方比例及工艺制备缺骨碎 补的阴性对照样品，再按照供试品溶液的制备方法，制备不含骨碎补的阴性对 照溶液。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各1(^L注入液 相色谱仪，得到图1~图3的液相色谱图。
由图1和图2可以看出，供试品溶液的高效液相色谱图中，在与对照品溶
液高效液相色谱图的相应位置处有一个相同的柚皮苷色谱峰；而从图3可以看 出，阴性对照溶液的高效液相色谱图中，在此相应位置上无色谱峰。说明本发 明的测定方法具有专属性。
实施例5
线性关系考察分别精密吸取对照品溶液(30.7mg . L-" 5、 10、 15、 20、 25jiL注入液相色谱仪，记录色谱图。以柚皮苷峰面积为纵坐标(Y)、对照品溶 液进样量(pg)为横坐标(X)进行线性回归，得回归方程为Y-1853.3X-1.5374， r-O. 9999。表明柚皮苷在0. 1535 ~ 0. 7675pg范围内，峰面积与进样量线性关系 良好。
实施例6
重复性试验取同一批样品6份，分别测定其柚皮苷含量，RSD为0."y。， 表明本发明建立的测定方法重复性良好。 实施例7
稳定性试验取同一供试品溶液，于制备后0、 2、 4、 6、 8h分别精密吸取 10nL注入液相色谱仪，记录色谱图，柚皮苷峰面积的RSD为0.20%,表明供试 品溶液在8h内稳定性良好。
实施例8
回收率试验采用加样回收法，取已知柚皮苷含量的同一批样品内容物6 份，分别精密加入柚皮苷对照品甲醇溶液2. 5mL(307mg L-1)，再分别测定其柚 皮苷含量，计算平均回收率及其RSD,见表l。表l柚皮苷加样回收率取样量样品中含量测得量回收率平均值RSD
(g)(mg )(mg )(y。("(%)
1. 02830. 66841. 422198. 2
1. 01520. 65991. 422299. 3
1. 00380. 65251. 410498. 7
99. 10. 67
1. 02090. 66361. 428199. 6
1. 01920. 66251. 420398. 7
0. 99260. 64521. 4125100. 0
权利要求
1、接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，包括以下步骤1)对照品溶液的制备取柚皮苷对照品适量，精密称定，以甲醇溶解，再用甲醇和1.5～2.5％的醋酸溶液稀释，配制成一定柚皮苷浓度的对照品溶液；2)供试品溶液的制备取处理过的接骨续筋制剂样品适量，精密称定，加甲醇适量，超声提取，再用甲醇和1.5～2.5％的醋酸溶液稀释，配制成与对照品溶液柚皮苷浓度相适应的供试品溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过；3)采用高效液相色谱法进行测定，其色谱条件为色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相甲醇1.5～2.5％醋酸溶液＝35∶65～40∶60；柱温35～45℃；检测波长283nm；4)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，测定柚皮苷色谱峰的峰面积；5)以外标法计算接骨续筋制剂样品中的柚皮苷含量；其中，制备成的对照品溶液与供试品溶液中的溶媒应满足甲醇1.5～2.5％醋酸溶液＝1∶0.8～1.3；以上百分浓度均为质量百分浓度。
2、 根据权利要求l所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特征 是包括以下步骤1) 对照品溶液的制备精密称取柚皮苷对照品适量，置适当的量瓶中，加 甲醇至刻度，摇匀，精密量取amL，置bmL量瓶中，加甲醇cmL,并满足a+c^. 5b; 再用1. 5 ~ 2. 5%醋酸溶液稀释至刻度，配制成一定柚皮苷浓度的对照品溶液；2) 供试品溶液的制备精密称取处理过的接骨续筋制剂样品适量，置具塞 锥形瓶中，加甲醇25mL,称定重量，超声处理30min,冷却至室温，再称定重量， 用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL,置10mL量瓶中，加,1. 5~2. 5%醋酸溶液稀释至刻度，摇匀，用0.45pm微孔滤膜滤过，配制成与对照 品溶液柚皮苷浓度相适应的供试品溶液；3) 采用高效液相色谱法进行测定，其色谱条件为 色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相甲醇1.5~2. 5%醋酸溶液=35 : 65 - 40 : 60; 柱温35~45°C; 检测波长283nm;4) 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液注入液相色谱仪，测定柚皮苷色 谱峰的峰面积；5) 以外标法计算接骨续筋制剂样品中的柚皮苷含量； 以上百分浓度均为质量百分浓度。
3、 根据权利要求1或2所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特 征是每lmL对照品溶液中含柚皮苷IO ~ 60pg。
4、 根据权利要求1或2所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特 征是每1 mL对照品溶液中含柚皮苷约3 Ojig 。
5、 根据权利要求1或2所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特征是所述接骨续筋制剂是接骨续筋片、接骨续筋胶囊、接骨续筋颗粒剂中的一种。
6、 根据权利要求1或2所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特征是所述柚皮苷的含量是接骨续筋制剂中骨碎补所含柚皮苷的量。
7、 根据权利要求1或2所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特 征是所述的流动相优选甲醇1. 5~2. 5%醋酸溶液=38 : 62。
8、 根据权利要求1或2所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特 征是流动相的流速为O. 8 ~ 1. 2mL min—。
9、 根据权利要求1或2所述的接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，其特 征是所述的柱温优选4(TC。
全文摘要
一种接骨续筋制剂中的柚皮苷含量测定方法，是选择柚皮苷作为接骨续筋制剂中骨碎补的指标成分，以甲醇和醋酸溶液配制柚皮苷对照品溶液和接骨续筋制剂供试品溶液，采用十八烷基硅烷键合硅胶柱，以甲醇∶1.5～2.5％醋酸溶液＝35∶65～40∶60为流动相，在283nm检测波长下进行高效液相色谱测定，以外标法计算接骨续筋制剂样品中的柚皮苷含量。本发明建立的测定方法专属性强，线性关系好，准确度高，重复性好，测定时间短，可依此方法科学评价柚皮苷的转移率，有效提高产品的质量。
文档编号A61K36/88GK101485808SQ20091007385
公开日2009年7月22日 申请日期2009年2月27日 优先权日2009年2月27日
发明者平 朱, 娜 李, 王志敏 申请人:王志敏