专利名称：紫杉醇在制备防治特发性肺纤维化的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及紫杉醇在制备防治特发性肺纤维化的药物中的应用。
背景技术：
特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis简称IPF)是慢性间质性肺病原因不明类中的一种，也是以普通型间质性肺炎为特征性病理改变的慢性炎症性肺疾病，其确切的发病机制目前尚不十分清楚。2000年美国胸科学会、欧洲呼吸病学会共同发表了国际共同声明对IPF作了明确界定，认为IPF是一个独立的疾病，它的病理形态学表现即是寻常性间质性肺炎(UIP)有别于其它特发性间质性肺炎，如脱屑型间质性肺炎(DIP)、急性间质性肺炎(AIP)、非特异性间质性肺炎(NSIP)等。根据现有的资料，可以将IPF的发病机制归纳为肺泡炎，肺实质损伤，过度的修复和纤维化几个阶段。IPF的流行病学资料尚不完整，但其发病率日益增高，已成为常见病，确诊后平均存活3～5年。到目前为止，对于肺纤维化的治疗糖皮质激素仍为首选，但它仅对20％的IPF患者有效，并且常常为一过性反应。免疫抑制剂不仅存在潜在的严重副作用，而且对IPF治疗基本无效。因此，寻找治疗IPF的其它有效方法是当务之急。
我国历代医学文献中对红豆杉(或名扁柏、紫柏)多有记载，如《本草纲目》、《本草推陈》等。1971年美国科学家首先从红豆杉中分离出紫杉醇后，国内外开始了红豆杉活性成分的深入研究的热潮。红豆杉具有几十种生物活性物质，其中紫杉醇、紫杉酚、巴卡亭III等成份具有抗癌作用，迄今为止，从红豆杉属植物中已分离鉴定出紫杉烷二萜类化合物等约300余种。紫杉醇是一种衍生的二萜类化合物，能特异性的与细胞中微管和微管蛋白结合，促进微蛋白装配成微管，而又抑制微管蛋白的解聚，使大量微管非正常的聚合，从而改变细胞骨架的平衡状态，产生结构的畸形，导致其失去正常的功能，造成细胞发育停止于G0/G1期和G1/M期，细胞的有丝分裂阻止于丝状分裂期，从而抑制血管平滑肌的分裂、增殖，减少再狭窄的发生。近年来，研究表明紫杉醇药物洗脱支架可以明显降低以经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)及支架置入为基础的经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后冠脉再狭窄率，以紫杉醇为代表的抗增殖药物已经成为预防支架内再狭窄研究热点。
发明内容
本发明以红豆杉中的二萜类物质紫杉醇脂质体为个例，对紫杉醇脂质体高、中、低三个剂量作了药效对比研究，明确了紫杉醇脂质体抑制大鼠特发性肺纤维化的作用及给药的最佳剂量。
本发明采用的技术方案是 紫杉醇在制备防治特发性肺纤维化的药物中的应用。
具体的，所述紫杉醇用于制备减轻博莱霉素A5导致的特发性肺纤维化早期肺泡炎症细胞渗出的药物，或用于制备改善肺组织ECM过度沉积状态的药物，或者用于制备抑制ERK1信号通路激活的药物。
目前，针对特发性肺纤维化机制的研究大多集中在对效应细胞、细胞因子及其相关基因调控的研究，其前提是学术界对肺纤维化的形成过程是涉及到细胞、细胞因子、细胞外基质(ECM)等因素的复杂过程已经具有共识。肺纤维化形成过程涉及到的众多细胞因子网络与信号传导途径非常复杂，本发明从紫杉醇脂质体对参与肺纤维化形成过程中的代表性细胞因子及其信号传导通路的影响入手，首先建立博莱霉素A5诱导的大鼠肺纤维化模型，通过对给予紫杉醇脂质体后的大鼠血清LN含量、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated protein kinasel，ERK1)信号传导通路的活化与分布情况的测定以及大鼠肺脏病理组织学检查，观察大鼠出现肺泡炎、肺实质的损伤、肺组织的修复与增生等病变的严重程度，并通过与空白组、模型组和强的松组比较来研究紫杉醇脂质体对大鼠特发性肺纤维化的防治作用，探讨紫杉醇脂质体对肺纤维化转规机制的影响，表明紫杉醇脂质体可通过调节LN的释放以及抑制ERK1信号转导途径来抑制肺组织弹性纤维钙化，从而为进一步寻找治疗特发性肺纤维化的有效途径提供实验依据。
国内外从上世纪90年代初开始进行紫杉醇脂质体研究，已取得具有应用价值的结果，主要表现为制成脂质体后明显降低了药物的毒性，提高了机体耐受性，保持了紫杉醇的抗肿瘤活性，提高了治疗效果。紫杉醇脂质体的溶解性为本发明实验研究提供了必要的条件。
120只SD大鼠随机抽取90只采用气管内一次性注射博莱霉素A5的方法建立大鼠肺纤维化模型，造模后分为模型组、强的松组、紫杉醇组，剩余大鼠设为空白组，模型组每日尾静脉注射生理盐水、对照组隔日尾静脉注射强的松龙、试验组尾静脉注射紫杉醇脂质体(d1、d21)，实验的第7、14、28天各组大鼠随机处死10只，观察各组大鼠肺部病理组织学改变，比较各组大鼠血清LN、肺组织ERK1信号传导通路活化参数。
结论 (1)紫杉醇脂质体可以减轻博莱霉素A5所致的大鼠特发性肺纤维化早期肺泡炎症细胞的渗出，抑制肺泡炎症反应。
(2)紫杉醇脂质体能通过调节特发性肺纤维化模型大鼠血清LN含量，改善肺组织ECM过度沉积状态，从而防止纤维化的形成。
(3)紫杉醇脂质体对特发性肺纤维化发生过程中ERK1信号通路有一定的阻断作用，对该信号通路的激活起到了一定的抑制作用。
(4)紫杉醇脂质体通过以上几种途径干预大鼠肺纤维化进程，从而达到抑制大鼠特发性肺纤维化的作用。
本发明有益效果主要体现在明确了紫杉醇脂质体抑制大鼠特发性肺纤维化的作用机制，并确定了药物的最佳剂量，为新药筛选提供了基础。
图1为模型组第7天病理切片(HE×20)； 图2为紫杉醇组第7天病理切片(HE×20)； 图3为空白组第7天病理切片(DAB×400)； 图4为模型组第7天病理切片(DAB×400)； 图5为紫杉醇组第7天病理切片(DAB×400)； 图6为模型组第14天病理切片(DAB×400)； 图7为紫杉醇组第14天病理切片(DAB×400)； 图8为模型组第28天病理切片(DAB×400)； 图9为紫杉醇组第28天病理切片(DAB×400)。
具体实施例方式 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此 实施例1 实验材料 实验动物雄性3～4周龄Sprague-Dawley(SD)大鼠(180～200g)SPF级浙江中医药研究院动物实验中心提供。
实验药品 博莱霉素A5(博莱霉素A5)天津太河制药有限公司批号060201注射用紫杉醇脂质体南京思科药业有限公司批号051104 主要试剂 ELLISA试剂盒(大鼠Laminin) 丹麦DAKO公司 免疫组化检测试剂盒EnVisionTM丹麦DAKO公司 EKR1单克隆抗体 美国Santacruz公司 DAB显色液 丹麦DAKO公司 实验仪器设备 石蜡切片机 德国MICROW公司 显微镜摄像机日本OLYMPUS公司 BMJ-III型包埋机及冷冻台 中国常州中威电子仪器有限公司 GNP-9080型隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司 APESSIGMA公司 电热恒温水温箱 上海医疗器械七厂 超净工作台 美国Thermo Life Sciences公司 莱卡图像分析系统德国Leica公司 溶液配制 博莱霉素A5溶液博莱霉素A58mg，0.9％氯化钠注射液4mL注射用紫杉醇脂质体溶液紫杉醇脂质体30mg，5％葡萄糖注射液30mL强的松溶液强的松注射液10mg/2mL，0.9％氯化钠注射液8mL 1.动物模型建立 ①麻醉按40mg/kg计算，用1％戊巴比妥钠腹腔麻醉。
②颈前皮肤75％酒精消毒，沿颈前正中切开约2cm大小的切口，逐层钝性分离暴露气管，然后用1mL注射器抽取博莱霉素A5溶液，沿气管软骨之间斜向下刺入迅速注射博莱霉素A5溶液(按5mg/kg体重)，立即将大鼠直立，缓慢摇动数十秒钟，立即消毒，缝合。
2.实验动物分组 120只SD大鼠随机抽取90只进行模型建立，造模后随机分为3组模型组、强的松组、紫杉醇组，每组30只，余30只未造模SD大鼠设为空白组。分别称重。
3.给药方法 第一组(空白组)正常饲养； 第二组(模型组)24h后每天尾静脉注射生理盐水(4mL/kg体重)； 第三组(强的松组)24h后隔天尾静脉射强的松溶液(20mg/kg体重)； 第四组(紫杉醇组)24h后第1、21天尾静脉注射紫杉醇溶液(2mg/kg体重)。
4.标本采取 实验第7天、14天、第28天各组随机抽取10只大鼠摘眼球取血，后行颈椎脱臼处死，分离出肺，取左肺和右肺下叶，左肺拍照后置于10％中性福尔马林溶液中浸泡固定，经脱水，石蜡包埋切片，按常规行HE染色，进行病理组织学分析。右肺下叶行免疫组化ERK1测定。
5.指标测定方法 (1)大鼠肺组织病理组织学检查 肺部形态学观察肉眼观察肺部病变情况，取左肺标本进行HE染色。在光镜下(4×10)评估每张切片上肺泡炎和肺纤维化的面积，分成0、I、II、III级，具体标准如下0级，肺组织结构正常，无肺泡炎和肺纤维化累及肺组织；I级，肺泡炎和肺纤维化累及肺组织＜25％；II级，肺泡炎和肺纤维化累及肺组织25％～50％；III级，肺泡炎和肺纤维化累及肺组织＞50％。
(2)血清层粘连蛋白(LN)含量将采集的全血标本离心(500r/min×30)后分离血清，将试剂盒中标准品稀释(1000，500，250，125，62.5，0ng/mL)备用。取出所需板条，加入100μL标准品、100μL待测血清于相应孔中。37℃30min。洗板甩尽板内液体，每孔加入350mL洗涤液，静止30sec后甩尽液体，在厚叠吸水纸上拍干，反复洗涤5次。每孔加入Incubation Solution 75μL，37℃30min。洗板甩尽板内液体，用每孔加入350mL洗涤液，静止30sec后甩尽液体，在厚叠吸水纸上拍干，反复洗涤5次。每孔加入显色液75μL，15±5min。每孔加入终止液50μL，混匀，即刻在450nm处读数。各孔(包括零孔)OD值应减去零孔的OD值。以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标本的OD值在标准曲线上查得其含量。
(3)ERK1的表达与分布的测定右肺下叶组织标本在中性缓冲福尔马林液(pH＝7.4)固定8～12h后，自来水洗30min，70％乙醇30min，95％乙醇1h×2次，100％乙醇1h×2次，二甲苯透明20min×2次，浸蜡58～60℃3h，包埋组织，连续切片，厚4μm，捞至预先以APES处理的载玻片上，于60～62℃烘箱(隔水式恒温培养箱GNP-9160)烤片6～8h，做免疫组织化学ERK1染色。二甲苯脱蜡、无水乙醇、95％、80％、70％乙醇脱水，蒸馏水洗，抗原修复采用高温高压修复(Tris/EDTA缓冲溶液，PH＝9.0)，蒸馏水洗，PBS洗5min×3次，3％H2O2阻断内源性过氧化物酶10min，PBS洗5min×3次，滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜。PBS冲洗，5min×3次，滴加山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育40min。PBS冲洗，5min×3次，DAB显色液显色1～3min，显微镜下控制反应，自来水冲洗终止反应，Harris苏木素液复染细胞核1min，95％、100％乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
结果判定方法光镜下观察阳性细胞的数量，以细胞浆或(和)细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性。每张切片随机选择5个高倍视野(×400)，每个视野计数100个细胞。10个视野阳性细胞平均百分率被认为是阳性细胞百分率。没有阳性细胞赋值为0，＜30％为1，31％～70％为2，＞70％为3。染色程度标注据每张切片的大多数细胞染色特征决定。细胞内无着色赋值为0，浅黄色为1，棕黄色为2，棕色为3。最终结果由染色的总数和染色强度共同决定。总值0，为阴性(-)，1～2之间为弱阳性(+)，3～4之间为阳性(++)，5～6之间为强阳性(+++)。2以下为低表达，＞3为高表达。
6.统计学方法 统计学处理计量数据均用x±s表示，采用SPSS13.0统计分析软件进行处理 多组间比较及两两之间比较采用方差分析以及LSD-t检验。病理及免疫组化半定量结果组间比较用Kruskal-Wallis秩和检验，组间两两比较Mann-Whitney U检验，此时校正检验水准α′为0.01，即P＜0.01认为两两组间差异有统计学意义。
7.实验结果 7.1大鼠肺组织病理组织学检查结果 7.1.1整体形态观察空白组肺外观无明显异常，呈粉红色，表面光滑；模型组两肺呈暗红色，部分肺叶呈灰白色，弹性明显降低，可见散在的大小不等的点片状灰白色斑块，大部分动物肺脏体积缩小，硬度增加；紫杉醇组和强的松组两肺外观病变明显好于模型组，两肺颜色略暗红，大部分动物肺脏弹性尚可，部分肺叶偶尔可见散在的点状灰白色斑块。
7.1.2光学显微镜观察空白组肺组织正常，无炎性细胞，无间质纤维组织增生(见图3)。模型组大鼠的肺纤维化比较明显，肺泡间隔增宽明显，间质中大量淋巴细胞浸润积聚，出现大量胶原纤维和成纤维细胞，肺泡壁破坏，部分肺泡实变，肺泡腔内有多少不等的炎性细胞浸润，多呈II、III级纤维化和I级肺泡炎改变。第7d表现为肺泡炎(见图1、图4)，第14d肺泡炎加重，成纤维细胞、平滑肌细胞增殖，胶原纤维沉积，肺泡变形(见图6)；第28d广泛纤维化，玻璃样变，细胞成分少，肺泡大部分消失(见图8)。紫杉醇组和强的松组大鼠的肺纤维化程度均较模型组大鼠明显减轻，大多只有轻度肺纤维化形成，肺泡间隔轻度增宽，部分有少量炎性细胞浸润，多呈I级纤维化改变，肺泡炎不明显(见图2、图5、图7、图9)。统计结果显示模型组肺泡炎及肺纤维化程度显著高于空白组(P＜0.01)，表明动物模型复制成功；紫杉醇组和强的松组肺泡炎程度分别与模型组比较第7d、14d差异有显著意义(P＜0.01)，第28d比较无意义(P＞0.01)。紫杉醇组与强的松组肺纤维化程度分别与模型组比较第7d、14d差异无意义(P＞0.01)，第28天差异有意义(P＜0.01)。紫杉醇组与强的松组肺泡炎和肺纤维化程度比较第7d、14d、28天均无显著差异。见表1、表2、表3。
表1第7天各组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度分级结果的比较
与空白组比较*P＜0.01，与模型组比较★P＜0.01，▲P＞0.01，与强的松组比较△P＞0.01. 表2第14天各组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度分级结果的比较
与空白组比较*P＜0.01，与模型组比较★P＜0.01，▲P＞0.01，与强的松组比较△P＞0.01 表3第28天各组大鼠肺泡炎及肺纤维化程度分级结果的比较
与空白组比较*P＜0.01，与模型组比较★P＞0.01，▲P＜0.01，与强的松组比较△P＞0.01 7.2血清LN测定结果 第7、14、28天模型组与空白组血清LN比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，第7、14、28天紫杉醇组与模型组血清LN比较差异均有统计学意义(P＜0.01)，与强的松组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表4。
表4各组大鼠血清LN含量(pg/mL)比较(x±s)
与空白组比较*P＜0.01，与模型组比较★P＜0.01，与强的松组比较△P＞0.05 7.3ERK1表达与分布测定结果 ERK1在模型组较为广泛表达，主要表达在肺泡和或间质内的组织细胞(吞噬细胞)、纤维细胞和炎症细胞及血管的内皮细胞和少量的平滑肌上，气管上皮表达较少；在空白组主要表达在肺泡或和间质内的组织细胞(吞噬细胞)且表达强度也较弱。在阳性组和试验组有减弱部分不表达，以阳性组较明显。统计结果显示模型组中ERK1表达与强的松组比较有显著差异(P＜0.01)，模型组与紫杉醇组比较有显著差异(P＜0.01)，强的松组与紫杉醇组比较无显著差异(P＞0.05)。见表5。
表5大鼠肺组织ERK1表达
实施例2红豆杉中的二萜类物质的提取 1、红豆杉中的二萜类物质的粗提 南方红豆杉枝叶→60℃12～24hr烘干(至原料水分低于18％)→原料粉碎60目以下→采用95∶5(v∶v)的甲醇和水混合物，按溶剂和原料10∶1(v∶v)的比例在常温条件下萃取48hr→过滤，取上清液，减压浓缩得到固体→按溶剂(氯仿∶水＝3∶1，v∶v)和浓缩固体物20∶1(v∶v)进行分相→取有机相，50℃真空干燥，得到红豆杉中的二萜类物质的粗提物浸膏粉。
2、紫杉醇脂质体的精制 粗提物浸膏粉→按石油醚和水50∶1(v∶m，mL/g)的比例萃取→真空干燥，得到浸膏粉→乙酸乙酯(按溶剂∶原料(v∶m，mL/g)＝90∶1)溶解，过滤→乙酸乙酯溶液→用100倍(溶液体积原料浸膏重量)1M氢氧化钠溶液和去离子水分别淋洗2次→有机相用无水硫酸钠脱水干燥，减压浓缩→拌入硅藻土，阴干→上样，进行正相层析(硅胶用量为原料浸膏50倍重量)，洗脱剂为3BV(3倍柱体积)的体积比65∶35的正己烷、丙酮混合液→目标产物馏分减压干燥，在甲醇-水体系中结晶→结晶物以结晶∶氯仿1∶33(g/mL)的比例溶解，加入少量溴，常温反应5min(溴采用10％的亚硫酸钠中和)，再用去离子水淋洗2次，无水硫酸钠脱水后减压干燥，得样品→按样品和硅胶1∶30质量比干法装柱，3BV(3倍柱体积)的体积比60∶40正己烷、乙酸乙酯混合液洗脱→目标产物馏分减压干燥，在甲醇-水体系中再次结晶，得紫杉醇脂质体纯品，产品纯度99％，收率70％。
权利要求
1.紫杉醇在制备防治特发性肺纤维化的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述紫杉醇用于制备减轻博莱霉素A5导致的特发性肺纤维化早期肺泡炎症细胞渗出的药物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述紫杉醇用于制备改善肺组织ECM过度沉积状态的药物。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述紫杉醇用于制备抑制ERK1信号通路激活的药物。
5.如权利要求1～4之一所述的应用，其特征在于以紫杉醇脂质体制备所述的药物。
全文摘要
本发明提供了紫杉醇在制备防治特发性肺纤维化的药物中的应用。具体的，所述紫杉醇用于制备减轻博莱霉素A5导致的特发性肺纤维化早期肺泡炎症细胞渗出的药物，或用于制备改善肺组织ECM过度沉积状态的药物，或者用于制备抑制ERK1信号通路激活的药物。本发明明确了紫杉醇脂质体抑制大鼠特发性肺纤维化的作用机制，并确定了药物的最佳剂量，为新药筛选提供了基础。
文档编号A61K31/337GK101491515SQ20091009655
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月6日 优先权日2009年3月6日
发明者孔繁智, 朱婉萍, 樊锦秀, 王红岗 申请人:浙江省中医药研究院