专利名称：高纯度天然熊去氧胆酸的制备及其在医药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医药生物技术领域，特别是涉及一种高纯度天然熊去氧胆酸的制备方 法及其在医药中的应用。
背景技术：
熊去氧胆酸(UDCA)系珍稀药物熊胆之有效成份，具有清热、平肝、明目等功效，临 床用于治疗各种胆道疾病、急慢性肝炎、肝硬化及心血管系统疾病，尤其对胆固醇型胆结石 有独特疗效。国内外现有专利或文献报道UDCA的制备方法主要有三个方面，一是以天然熊 胆或人工引流熊胆所制备的熊胆粉为原料提取精制而得(参见文献石丽霞等，引流熊胆 粉精制前后有效成分含量比较，中药材.2000,23(6) 334 ；石丽霞等，熊胆注射液的研制与 临床应用，中成药.1989，11 (6) :12)，所得产物主要是UDCA含量较低的熊胆粉提取物，主要 作为一些中药或天然保健品的原料使用，尚不能满足中药和天然药物高端制剂，如注射液 的原料药的质量标准和要求；第二是以鹅去氧胆酸为原料进行UDCA的半合成制备(参见文 献EP，88637，1983等)，该法是现在药用UDCA的主要制备工艺，但反应收率较低，反应副产 物等相关杂质不易控制；第三是以其他化学原料为起始材料进行UDCA的全合成制备(参见 文献李良，中国专利98105020. 4等)，该发明合成路线不需高温高压反应条件，各步反应 收率高，具有较高的工业化生产价值，在UDCA合成研究中，获得了一条较为优化的合成路 线该路线为一新工艺，但仍在实验室研究阶段。鉴于中药和天然药物现代化的迅猛发展，对于相关中药和天然药物的有效活性成 分的质量标准和质量要求也日益提高。如高纯度的天然熊去氧胆酸，已经是诸多相关中药 和天然药物注射剂所需的重要原料，因此研究一种可制备高纯度天然熊去氧胆酸的分离纯 化工艺具有非常重要的价值和意义。
发明内容
本发明旨在公开一种以人工引流熊胆粉为原料，经两步柱层析法快速制备高纯 度、高收率天然熊去氧胆酸的工艺方法。本发明是通过以下途径得以实现人工引流熊胆粉是经人工饲养的黑熊胆汁引流干燥制备所得，该熊胆粉的主要物 质成分为牛磺熊去氧胆酸(含量约30%)、牛磺鹅去氧胆酸(含量约25%)、熊去氧胆酸 (含量约3%)、鹅去氧胆酸(含量约2%)、牛磺酸(含量约8%)和其他胆酸盐等成分。其 中的牛磺熊去氧胆酸是主要目的成分，该成分经碱水解可得目的物熊去氧胆酸和杂质牛磺 酸。因熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸在碱性条件下都会水解，为避免鹅去氧 胆酸的干扰，因此首先分离出牛磺熊去氧胆酸。鉴于牛磺熊去氧胆酸在酸性条件下可吸附 于阳离子交换介质上，因此选用CM Sepharose Fast Flow作为吸附介质，具体吸附和洗脱 条件如下将人工引流制备的熊胆粉用20 70%的甲醇溶液溶解，浓度为3 15% (w/w)，加入乙酸钠，终浓度为5 20mmol/L，用乙酸调节pH值为3 5 ；用与溶解熊胆粉相同的 甲醇溶液浸泡并装柱CM Sepharose Fast Flow阳离子交换介质，平衡后上样，然后在含 250mmol/L的NaCL的上述甲醇溶液中洗脱牛磺熊去氧胆酸。阳离子交换层析所得牛磺熊去氧胆酸在碱性条件下可彻底水解为熊去氧胆酸钠 和牛磺酸，具体水解条件如下阳离子层析所得牛磺熊去氧胆酸加水稀释3 10倍，加入10 40% (w/w )NaOH, 于80 110°C水解20 30小时，得熊去氧胆酸钠和牛磺酸。水解产物用稀盐酸调节酸度至1 2，熊去氧胆酸钠酸化为熊去氧胆酸析出，牛磺 酸保留溶液中，过滤干燥后得熊去氧胆酸粗品，该粗品溶解于硅胶流动相中经硅胶吸附层 析可得纯度大于98%的熊去氧胆酸，具体硅胶层析条件如下装柱200 300目层析用硅胶，以乙酸乙酯-甲醇为流动相，其中流动相中甲醇含 量为0 25% (v/v)。熊去氧胆酸粗品用流动相溶解，上柱，流速为0. 5 3倍柱体积/小 时，薄层色谱检测收集熊去氧胆酸，浓缩后乙酸乙酯结晶得高纯度熊去氧胆酸。本发明所制备的熊去氧胆酸可用于原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎 的治疗。
具体实施例方式现以一个较佳工艺条件例证举阐明本发明所述方法取熊胆粉饮片1公斤，用10公斤50%的甲醇溶液搅拌溶解，加入乙酸钠至终浓度 25mmol/L，用乙酸调节酸度值至5. 8，过滤，得熊胆粉饮片溶液10. 6升。取CM Sephrose Fast Flow阳离子层析介质装填玻璃层析柱，柱规格lOcmX 80cm， 填料高度60cm。配制平衡缓冲液50%甲醇，25mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲，pH 5.8。用平衡 缓冲液平衡3倍柱体积，上样熊胆粉饮片样品溶液，上样结束后再平衡3倍柱体积。配制洗 脱缓冲液I :50%甲醇，25mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲，100mmol/L氯化钠，pH 5. 8。用洗脱缓 冲液I洗脱3 5倍柱体积，至薄层检测无显色斑点结束。配制洗脱缓冲液II :50%甲醇， 25mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲，250mmol/L氯化钠，pH 5. 8。用洗脱缓冲液II洗脱3 5倍 柱体积，至薄层检测无牛磺熊去氧胆酸显色斑点结束。收集洗脱液，减压浓缩至无醇味，得 样品8. 5升。取阳离子交换层析样品，加入纯水40升，氢氧化钠5公斤，置反应釜110°C搅拌24 小时，冷却至室温后用6mmol/L盐酸调至pH 1. 5，过滤干燥，得熊去氧胆酸粗品320克。取200 300目层析用硅胶，装填玻璃层析柱，柱规格15CmX80Cm，填料高度 120cm。以乙酸乙酯为流动相。熊去氧胆酸粗品320可用1升乙酸乙酯溶解，过滤，上样，调 节流速为350ml/min，分布收集流出液，高效薄层色谱检测，收集熊去氧胆酸部分，合并。得 收集液54升，减压浓缩至6. 3升，置室温放置结晶24小时，过滤，干燥，得晶体272. 8克。经反相高效液相色谱检测，所得熊去氧胆酸含量为99. 12%，鹅去氧胆酸含量为 0. 33%，牛磺酸未检出。
权利要求
一种天然熊去氧胆酸，化学式为C24H40O4；结构式为3a，7β-二羟基-5β-胆甾烷-24-酸；其化学结构如下F2009101036989C0000011.tif
2.根据权利要求1所述的熊去氧胆酸，其特征是反相高效液相色谱纯度不低于98%， 主要相关杂质鹅去氧胆酸含量不高于0. 5%，牛磺酸含量不高于0. 5%。
3.一种制备权利要求1和2所述的熊去氧胆酸的方法，其特征是包括以下步骤(1)牛磺熊去氧胆酸的制备将人工引流制备的熊胆粉用20 70%的甲醇溶液溶解， 浓度为3 15% (w/w)，加入乙酸钠，终浓度为5 50mmol/L，用乙酸调节pH值为3 5 ； 用与溶解熊胆粉相同的甲醇溶液浸泡并装柱CM Sepharose Fast Flow阳离子交换介质，平 衡后上样，然后在含250mmol/L的NaCL的上述甲醇溶液中洗脱牛磺熊去氧胆酸。(2)牛磺熊去氧胆酸的水解步骤(1)所得牛磺熊去氧胆酸加水稀释3 10倍，加入 10 40% (w/w)NaOH,于80 110°C水解20 30小时，得熊去氧胆酸和牛磺酸。(3)熊去氧胆酸的分离纯化及精制装柱200 300目层析用硅胶，以乙酸乙酯_甲醇 为流动相，其中流动相中甲醇含量为0 25% (v/v) 0步骤(2)所得水解液用稀盐酸调节 酸度为1 2，过滤取沉淀，干燥后用上述流动相溶解，上柱，流速为0. 5 3倍柱体积/小 时，薄层色谱检测收集熊去氧胆酸，浓缩后乙酸乙酯结晶得高纯度熊去氧胆酸。
4.一种权利要求1、2和3所述的熊去氧胆酸，其特征是可用于原发性胆汁性肝硬化和 原发性硬化性胆管炎的治疗。
全文摘要
本发明属于医药生物技术领域，特别是涉及一种高纯度天然熊去氧胆酸的制备方法。高纯度天然熊去氧胆酸由人工引流熊胆制备的熊胆粉分离纯化所得，高效液相色谱纯度不低于98％。其制备方法是首先应用阳离子交换介质分离纯化制备纯度不低于90％的牛磺熊去氧胆酸，然后将牛磺熊去氧胆酸在碱性条件下彻底水解为熊去氧胆酸和牛磺酸，再应用硅胶吸附色谱技术分离纯化制备纯度不低于98％的熊去氧胆酸。本发明制得的天然熊去氧胆酸具有治疗原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎作用。
文档编号A61K31/575GK101870718SQ200910103698
公开日2010年10月27日 申请日期2009年4月27日 优先权日2009年4月27日
发明者侯世兴, 周家蔚, 张金魁, 王建 申请人:重庆寰瑞生物技术有限公司