专利名称：：一种畜用肽苗及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种兽用口蹄疫化学合成肽疫苗及其制备方法。
背景技术：
：口蹄疫(footandmouthdisease,简称FMD)是偶蹄动物的一种高度接触性、发热性、急性传染病，在世界各国普遍分布。其传播迅速，感染马、牛，猪，羊等牲畜，导致幼畜死亡，成年动物生产能力急剧下降，严重危害畜牧业的发展和肉食及其畜产品的生产和供应，给流行国家和地区畜牧业生产造成巨大的经济损失。目前，口蹄疫在许多国家已经被消灭或很好地被控制，然而近几年，它再度给养殖业带来巨大的经济损失。1997年我国台湾口蹄疫大爆发，殃及600多个猪场，2000年在俄罗斯爆发造成了巨大的经济损失。2001年2月在英国的爆发和流行，给英国养殖业造成了继疯牛病和猪瘟两大疫情损害后的又一次沉重打击，其影响甚至扩展到整个欧洲。在我国，A型FMDV、O型FMDV、Asial型FMDV都有发生，Asial型FMDV在历史上仅局限于我国云南边境地区流行，但在2004-2006年先后在我国新疆、甘肃、江苏、北京、河南等地爆发了Asial型口蹄疫，严重影响当地畜牧业的发展。口蹄疫病毒(FMDV)属于细小核糖核酸病毒，该属的病毒具有多型性、易变性等特点。全世界有A、O、C、Satl、Sat2、Sat3和Asial7个血清型，亚型有70多个，各血清型间不存在交叉免疫，且病毒易发生变异，这就为FMD的防治造成了很大困难。目前，我国对口蹄疫实行强制性免疫，疫苗免疫是防治口蹄疫的主要手段。而我国现行使用的口蹄疫疫苗主要是病毒灭活疫苗，但灭活却存在许多隐患，如疫苗生产过程中由于不慎易引起病毒的逃逸以及灭活不完全而导致FMD的再度暴发，不同型的毒抹间不能提供有效保护等。目前世界上很多国家已经停止使用灭活疫苗，也禁止从使用灭活疫苗的国家进口畜产品。为了克服灭活疫苗的自身不足，FMD各种新型疫苗如可饲基因工程疫苗、蛋白质载体疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗等不断涌现，但是其在安全性、免疫效果、工艺方面都存在诸多问题，影响了这些新型疫苗的使用。研究表明口蹄疫病毒衣壳蛋白由四种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60个组成，VP1-VP3位于衣壳蛋白的外侧，组成衣壳蛋白亚单位，而VP4位于病毒颗粒的内部。VP1是主要的保护性抗原，其上含有FMDV主要抗原结合位点能诱导机体产生中和抗体，研究表明，位于VP1第134-158氨基酸之间的G-H环，C端第200-213氨基酸残基是诱导中和抗体的主要免疫抗原位点。在本发明中，选择了O型、A型和Asial型FMDV结构蛋白VP1上第130-168位的优势B细胞表位。同时由于口蹄疫主要以体液免疫为主，有效的疫苗应该能诱导以Th2为主导的免疫反应。DiMarchi等曾报道，将串联有FMDVVP1第140-160和第200-213氨基酸残基的合成肽免疫牛后，动物能抵抗病毒的感染。但随后的研究证实，当将此类合成肽疫苗在易感动物群内大规模使用时，却仅能提供有限的保护。究其原因，强效T细胞表位的缺乏可能是影响该疫苗效果的一个因素。同时携带B细胞抗原表位和T细胞抗原表位的串联肽已经被证明对牛表现出良好的免疫反应性。研究证实，在FMDV衣壳蛋白上有多个能被牛和猪淋巴细胞识别的T细胞表位，但对这些T细胞表位的识别明显地受到了宿主MHC多态性的限制，进而也限制了它们在疫苗中的应用。同时研究发现，内源性的T细胞表位不足以刺激易感动物免疫系统对口蹄疫病毒产生有效的保护。所以，提供强效的外源T细胞表位以辅助增强易感动物的免疫应答是研究高效肽苗的关键。
发明内容因此，本发明的目的是提供一种能抵抗口蹄疫病毒感染的肽疫苗。本发明的另一个目的是提供一种生产上述肽疫苗的方法。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明提供一种抗口蹄疫病毒的肽疫苗其特征在于肽抗原具有如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3所示的氨基酸序列。上述肽苗，其特征在于如SEQIDNO:1和SEQIDNO:3所示氨基酸序列的肽抗原结构是由口蹄疫病毒VP1上130-168位的B细胞表位与如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的外源T细胞表位构成，两个表位间的接头氨基酸序列为Lys-Lys。上述肽苗，其特征在于如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的肽抗原结构表示为VPtB(M68-Lys曙Ala-Lys-Lys-Ala隱Lys-VPi130_168,是由口蹄疫病毒VP1上130-168位的两个B细胞表位串联而成，串联接头氨基酸序歹'j为Lys國Ala-Lys-Lys-Ala-Lys。上述肽苗，其特征在于抗口蹄疫病毒的肽抗原还可以由该型口蹄疫病毒VP1上130-168位的两个B细胞表位串联后的SEQIDNO:2和如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的肽构成。上述肽苗，其特征在于抗口蹄疫病毒的肽抗原由SEQIDNO:2即VPi130_168-Lys-Ala-Lys-Lys-Ala-Lys-VPi130_168肽和如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的肽按照摩尔比为1:2的比例构成。上述肽苗，其特征在于如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的外源T细胞表位来源于小反刍兽疫病毒。通过大量试验室试验在小反当兽疫病毒上找到了一段能增强口蹄疫VP1上第130-168(167)位的优势B细胞表位的强效外源T细胞表位，然后通过一定的接头氨基酸将强效外源T细胞表位和优势B细胞表位连接，构建了含辅助性强效外源T细胞表位和FMDV主要抗原表位基因的多肽疫苗，并通过计算机模拟完全符合设计要求。上述的肽苗，其可以釆用化学合成的方法制备合成肽抗原。本发明还提供了该肽疫苗的制备方法，主要包括以下步骤(1)抗原肽的化学合成；(2)抗原肽的裂解、沉淀；(4)高压液相色谱分离纯化多肽抗原；(5)多肽疫苗的配置。上述制备方法中抗原肽的化学合成是以氨基树脂和FMOC氨基酸为原料，逐步接上氨基酸，每步接肽反应后用乙酰咪唑封闭未反应的活性氨基端，主要包括如下步骤(a)FMOC基团脱除用含15%-35%六氲吡咬的DMF溶液在20-26。C条件反应20-40分钟脱除氨基上保护的FMOC基团，氮气吹干，DMF洗涤树脂；(b)接肽反应加入HOBT、HBTU、DIEA与FMOC保护的氨基酸在20-28。C条件反应0.5-2.5小时，氮气吹干，DMF洗涤树脂；(c)封闭反应使用1.5。/。-3.5。/。的乙酰咪唑在20-26。C条件反应15-30分钟。上述制备方法中抗原肽裂解沉淀操作中所使用的裂解试剂为三氟乙酸(TFA)、苯酚(Phenol)和水(H20)，它们的比例是卯/8/2，裂解反应的时间为1-3小时。上述制备方法中肽抗原的分离纯化主要使用高压液相色谱，色谱条件如下(a)ds反相色谱柱，规格19mmx250mmx5um，孔径300埃；(b)流动相A相为含0.5。/oTFA的水，B相含0.5%TFA的乙腈。上述制备方法中疫苗配制的方法包括如下(a)用注射用水将肽抗原稀释到3(K200ug/ml;(b)将油佐剂高压灭菌后备用。(c)在20-28。C条件下将抗原水相与油佐剂按照5:5的比例进行乳化，分装后即得到多肽疫苗。本发明进一步提供了上述肽及其混合物在制备预防和/或治疗口蹄疫的药物中的用途。本发明在详尽了解口蹄疫病毒分子结构及其生物功能，分析病毒抑制宿主免疫应答的分子成分，及激活宿主免疫细胞产生保护性免疫应答的分子基础上，针对我国口蹄疫流行现状，以O型、A型和Asial型FMDV主要结构蛋白VP1上优势抗原表位基因为基础，结合强效的外源Th细胞表位设计了新型高效的肽苗。本发明的抗FMDV肽疫苗可以有效应对口蹄疫病毒的抗原变异、不存在生物安全性，易于大规模合成，具有良好的应用前景。下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。实施例I.肽抗原固相化学合成本发明肽抗原的制备可使用全自动多肽合成仪运用经典固相化学合成法，采用的是FMOC保护氨基酸，固相载体采用的是氨基树脂。生产过程通常分为肽抗原的固相合成、肽的裂解、抗原纯化与除菌保存。具体步骤如下1.1肽抗原的固相合成1.1.1合成原料的准备合成肽抗原的序列如SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示。依据上述抗原的序列以及合成规模准备合适的保护氨基酸，加入到相应的氨基酸瓶中。同样按要求称量氨基树脂，放入反应腔，将上下盖子拧紧，贴标签，记录所合成肽的名称，反应腔的皮重及所称树脂的重量。将反应腔装入合成仪。配制合成试剂包括DMF、AIM(已酰咪唑)、PIP(哌啶)、甲醇等放置到相对应的试剂瓶中。1.1.2合成仪状态的检测检查合成仪器是否正常运行，开机后，运行自检程序，仪器自检各项指标是否正常。另外检查氮气是否充足，系统表压是否正常。合成前应对仪器的性能有所了解，所以要对每种合成试剂的流速进行测定。发送测试程序到合成仪，进行测量或观察，若流量不合适，则调节上下阀门压力，直至达到要求。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.1.3肽抗原的合成开始在合成仪的程序中将要合成的氨基酸序列与合成方法发送到合成仪上。编辑合成肽的序列，保存。检查合成方法是否正确，序列是否为所存名字，设定合成循环；确定后保存，然后运行程序。1.1.4肽抗原的合成如上述的多肽序列，合成的时候是从C端开始至N端，依照设定的程序，依次不断地重复如下合成步骤(1)脱除FMOC保护基团使用含25%六氢吡啶的DMF溶液在25°C条件反应30分钟脱除氨基上保护的FMOC基团；(2)洗涤树脂氮气吹干树脂，用DMF洗涤树脂5次；(3)接肽反应加入HOBT、HBTU、DIEA与FMOC保护的氨基酸在25。C条件反应1.5小时，氮气吹干树脂，然后DMF洗涤树脂；(4)洗涤树脂氮气吹干树脂，使用DMF洗涤树脂5次；(5)封闭反应使用2.5。/。的乙酰咪唑在25。C条件反应30分钟，将未反应活性氨基封闭；(6)多肽抗原合成后处理合成结束后从多肽合成仪上取下反应器，再用甲醇洗涂肽树脂5次，后在通风厨内吹干，然后将多肽树脂转移至棕色瓶内，放入-2(KC水箱内，封口膜密封备用。1.2、肽抗原的裂解及鉴定1.2.1、肽抗原的裂解按照比例(TFA/Phenol/H20-卯/8/2)配制裂解液，然后从冰箱内取出合成好多肽树脂，放入圆底烧瓶内，在通风厨内向烧瓶内加入配制好的裂解液和磁搅拌子，然后稳定地放置在磁力搅拌器上，室温下持续搅拌2小时到反应完全。反应结束后，使用带冷阱的旋转蒸发仪持续蒸发80分钟除去粗产品中的TFA。然后用二甲基甲酰氨(DMF)多次清洗多肽抗原的粗品，最后将混合在一起的树脂用砂心漏斗过滤出来，既得到多肽抗原。1.2.2、合成抗原的鉴定肽抗原合成完毕后用基质辅助激光解吸飞试时间质谱法(MALDL-TOF)和反相高压液相色谱法(RP-HPLC)进行定性定量分析。1.3、肽抗原的分离纯化肽抗原的分离纯化采用高压液相色镨法，色i普条件是色语柱ODSCn8(柱规格19mmx250mmx5p，300A，Hypersil);流动相A(0.5Q/oTFA/H2O)，流动相B(0.5。/。TFA/乙腈)；梯度洗脱条件为30min内从10。/oB变化到50%B;检测波长216nm;流速为1.0mL/min;进样量:20ul。1.4、肽疫苗的配制1.4.1、肽抗原水相配制将合成好的肽抗原冷冻干燥，配制多价肽疫苗时各型抗原按照1:1:1的质量比称取抗原混合在一起，用灭菌注射用水将合成肽抗原稀释至180吗/ml;配制单价肽疫苗时将该型肽抗原用灭菌注射用水稀释至60^ig/ml。然后将肽抗原溶液经孔径为0.2nm的过滤器过滤，除菌。1.4.2、疫苗油相的准备将油佐剂经121。C，30分钟灭菌，备用。1.4.3、肽疫苗的乳化按油相和抗原水相为5:5的比例，先将油相加入乳化罐内，开动电机以200r/m慢速转动搅拌5分钟后，同时緩慢加入水相抗原，加完后搅拌15分钟，再以5000r/m高速搅拌10分钟，静置10分钟，使疫苗乳化成油包水的单相疫苗。实施例II.外源T细胞表位对T细胞的增殖试验试验目的发明人通过大量试验在小反当兽疫病毒上找到了一段能增强口蹄疫VP1上第130-168位的优势B细胞表位的强效外源T细胞表位(SEQIDNO:4)，然后通过一定的接头氨基酸将强效外源T细胞表位和优势B细胞表位连接，构建了含辅助性强效外源T细胞表位和FMDV主要抗原表位基因的肽抗原，与口蹄疫VP1上笫130-168位的优势B细胞表位构成的抗原进行T细胞增殖试验，以检验该外源表位SEQIDNO:4对T细胞的免疫刺激作用。试验准备96孔板、培养箱、Bio-Rad酶标仪、生物安全柜3-(4，5-二曱基漆唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)的配制MTT50mg溶解在10mlRPMI1640和O.lml的胎牛血清(FCS)的混合溶液，即得到5mg/ml的MTT.试验抗原依据下表l中所示的抗原序列按照上述实施例合成肽抗原。试验方法与结果无菌分离豚鼠脾脏淋巴细胞，调整细胞浓度为106个/mL，将细胞悬液0.1ml加入96孔细胞培养板，再分别加入30ug肽抗原，每个抗原设置3个重复。37。C刺激培养48h后加入MTT,继续培养4h,再加入预热到37。C的二甲基亚砜(DMSO),持续振荡5min，用Bio-Rad酶标仪测OD57G/OD63()光吸收值，按下列公式计算刺激指数(StimulationIndex,SI):SI-待测孔OD值/空白对照孔OD值，计算结果如下表l。表l:T细胞增殖试验结果刺激指数SI分组抗原种类SI值第一組(CK组)注射用水0.140第二组(免疫组)SEQIDNO:l0.423第三组(免疫组)SEQIDNO:30.428第四组(免疫组)SEQIDNO:2+SEQIDNO:40.484第五组(免疫组)VPl30-1680.225第六组(免疫组)VPl30-168KAKKA!CVPl30-1680.258第七组(免疫组)0.217(第四组中SEQIDNO:2与SEQIDNO:4抗原的摩尔比是1:2)上表说明免疫组(第二組到第七组)与对照组(第一组)都存在显著性差异(P0.05)，各免疫组相比，带有外源T细胞表位的第二组、第三组、第四组刺激指数都很高，达到0.4以上，第四组刺激指数最高达到(U84。这三组的刺激指数与单独的口蹄疫VP13(M68抗原免疫组(第五组、第六组、第七组)存在显著性差异(P<0.05)。第五组、第六组、第七组的刺激指数在0.2只有。上述结果表明来源于小反刍兽疫病毒的SEQIDNO:4对T淋巴细胞有良好的刺激增殖作用，可用于口蹄疫肽疫苗的研制。实施例III肽疫苗的安全性试验按照上述实施例合成如SEQIDNO:l、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示氨基酸序列的多肽抗原，然后按照上述实施例配制抗口蹄疫病毒的多肽疫苗，每批疫苗抗原含量为60ug/ml。每批疫苗用体重350450g的豚鼠10只，每只皮下注射2ml;用体重18~22g的小鼠10只，每只皮下注射0.5ml。连续观察7日，判定是否出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。观察结果见表2。表2:肽疫苗对豚鼠与小鼠的安全性试验结果组号疫苗抗原动物动物头数注射剂量注射方法判定结果第一组SEQIDNO:l多肽疫苗脉鼠102ml/只皮下注射无不良反应，安全小鼠100.5ml/只无不良反应，安全银一矛■组SEQID隐2+SEQIDNO:4多肽疫苗(摩尔比-l:2)豚鼠102ml/只无不良反应，安全小鼠100.5ml/只无不良反应，安全第三组SEQIDNO:3多肽疫苗豚鼠102ml/只无不良反应，安全小鼠100.5ml/只无不良反应，安全从本试验结果可以看出，本发明的肽疫苗免疫豚鼠和小鼠后连续观察7日，均没有出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部不良反应或全身反应。在整个试验过程中，豚鼠和小鼠均没有出现死亡现象。这说明本发明的肽疫苗对于豚鼠和小鼠是安全的。实施例IV肽疫苗的免疫效果研究将体重450克左右的健康豚鼠随机分为五组，每组六只豚鼠，在后腿进行多点肌肉注射试验疫苗，各组注射抗原种类及剂量见表1。第一次免疫后28天进行第二次免疫，然后采血测定抗口蹄疫特异性抗体和中和抗体产生的情况。表l:各组豚鼠免疫抗原类型和剂量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>1、间接ELISA法检测口蹄疫病毒特异性抗体在96孔酶标板上以O型口蹄疫病毒为包3皮抗原(1:10稀释)，被检豚鼠血清为一抗，过氧化物酶标记的兔抗豚鼠IgG为二抗，在波长492nm处测定每个学清样品的OD值，同时以空白孔调零。每组随机采血3只，以1:32稀释豚鼠血清，取每组间接ELISA方法测定结果的平均值(见表2)。表2显示，除第五组外，各免疫组豚鼠的特异性抗体水平在第一次免疫后的第二周明显提高，即抗O型口蹄疫病毒合成肽疫苗组的特异性抗体水平在第一次免疫豚鼠后的第二周明显提高。同时，其特异性抗体水平高于灭活苗组。表2:间接ELISA检测豚鼠血清FMDV特异性抗体结果(X土SE)分组第一组第二组第三组第四组第五组次免疫第次免疫免疫前第一周第二周第三周第四周第一周第二周第三周0.2213±0.0120.3433±0.0240.5124±0.0220.5532±0.0880.9867±0.0041.5031±0.1711.8239±0.1430.9705±0.1310.1698±0.0210.3301±0.0560.6373±0.0780.6759±0.1451.0223±0.0861.5985±0.0241.8266±0.0391.0968±0.1540.2011±0.0350.3465±0.0720.6385±0.0120.6964±0.1271.1227±0.0921.6172±0.0331.8953±0.0241.1121±0.0930.2322±0.0220.3423±0.0720.6426±0.1250.6854±0.2341.0119±0.1591.6124±0.0031.9347±0.0241.1135±0.1370.2354±0.0260.2334±.0.1520.3479±.0.0010.2931±0.2230.2895±0.1510.3865±0.0640.2841±0.2340.2324±.0.1572、豚鼠血清中和抗体的检测分别选用免疫前(O天)，第一次免疫后第28天，第二次免疫后第三周(第49天)的豚鼠血清用于微量中和试验，每组各测2只豚鼠。将生理盐水稀释的豚鼠血清灭活后，在96孔微量细胞培养板上用稀释液作一系列倍比稀释，每个稀释度作4孔，每孔加入50h1病毒液(100TCIDso),37。C温箱中和lh后每孔加入lOOjtl细胞悬液，置于5。/oC02培养箱中37。C培养，自48h开始观察，至144h终判。设置阳性和阴性血清对照、病毒回归试验、血清毒性试验、正常细胞对照。按照Spearman-Karber方法，计算出能保护50%孔中的细胞不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。结果如表3所示，除第五组外，在第一次免疫后各试验组均出现中和抗体，且第二组、第三组、第四组的中和抗体滴度高于第一组，即抗O型口蹄疫病毒的合成肽疫苗免疫后产生的中和抗体滴度高于灭活苗产生的中和抗体滴度。表3:豚鼠的中和抗体水平豚鼠编号第一组第二组第三組第四组第五组免疫前1<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6(第o天)2<0.6<0.6<0.6<0.6<0.6第一次免疫11.51.81.51.7<0.6(第28天)21.41.61.91.9<0.6第二次免疫12.12.32.12.4<0.6(第49天)21.82.01.91.8<0.6由上述结果可以看出，肽疫苗在豚鼠上免疫后，产生的特异性抗体水平和中和抗体水平均高于口蹄疫灭活疫苗，远远高于佐剂组产生的抗体水平。这体现了肽疫苗潜在的实际应用价值。序列表〈110〉陶钰邵国虎〈120〉一种畜用肽苗及其制备方法〈130〉一种畜用肽苗及其制备方法〈160>4〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉60〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉1GlyLeuSerlieLeuPheLeuSerGlulieLysGlyValLeuValHis151015LyslieGluLysLysTyrAsnGlyLeuCysLysTyrAlaAsnAlaGly202530GluValAsnValArgGlyAspLeuGinValLeuAlaGinLysAlaThr354045ArgCysAsnProThrSerPheAsnTyrGlyAlalie505560〈210>2〈211〉84〈212〉PRT<213>人工序列〈400〉2TyrAsnGlyAlaCysLysTyrAsnAlaThrValAsnGluAsnValArg151015GlyAspLeuGinValLeuAlaGinLysAlaLeuArgCysGlyProThr202530SerPheAsnTyrGlyAlalieLysAlaLysLysAlaLysTyrAsnGly354045AlaCysLysTyrAsnAlaThrValAsnGluAsnValArgGlyAspLeu505560GinValLeuAlaGinLysAlaLeuArgCysGlyProThrSerPheAsn65707580TyrGlyAlalie85〈210〉3<211>60〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉3GlyLeuSerlieLeuPheLeuSerGlulieLysGlyValLeuValHis151015LyslieGluLysLysTyrAsnGlySerCysLysTyrArgSerAlaAsp202530ValSerAsnValArgGlyAspLeuGinValLeuAlaGinLysAlaGlu354045ArgCysLeuProThrSerPheAsnTyrGlyAlalie505560<210>4<211>19〈212〉PRT〈213〉人工序列〈400〉4GlyLeuSerlieLeuPheLeuSerGlulieLysGlyValLeuValHis51015LyslieGlu权利要求1、一种抗口蹄疫病毒的肽疫苗，其特征在于肽抗原具有如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3所示的氨基酸序列。2、根据权利要求1所述的肽苗，其特征在于如SEQIDNO:l和SEQIDNO:3所示氨基酸序列的肽抗原结构是由口蹄疫病毒VPl上130-168位的B细胞表位与如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的外源T细胞表位构成，两个表位间的接头氨基酸序列为Lys-Lys。3、根据权利要求1所述的肽苗，其特征在于如SEQIDNO:2所示氨基酸序列的肽抗原结构表示为VP!130_168-Lys-Ala-Lys-Lys-Ala-Lys-VPi130-168，是由口蹄疫病毒VPl上130-168位的两个B细胞表位串联而成，串联接头氨基酸序列为Lys-Ala-Lys-Lys-Aia-Lys。4、根据权利要求3所述的肽苗，其特征在于抗口蹄疫病毒的肽抗原还可以由该型口蹄疫病毒VPl上130-168位的两个B细胞表位串联后的SEQIDNO:2和如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的肽构成。5、根据权利要求4所述的肽苗，其特征在于抗口蹄疫病毒的肽抗原由SEQIDNO:2即VP,130.168-Lys-Ala-Lys-Lys-Ala-Lys-130_168肽和如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的肽按照摩尔比为1:2的比例构成。6、根据权利要求1至5所述的肽苗，其特征在于如SEQIDNO:4所示氨基酸序列的外源T细胞表位来源于小反刍兽疫病毒。7、根据权利要求1至6所述的肽苗，其特征在于采用化学合成的方法制备合成肽抗原。8、根据权利要求1至6中任一项所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中还包含佐剂。9、权利要求1至6中任一项所述的多肽及其混合物在制备预防和/或治疗口蹄疫的药物中的用途。10、一种根据权利要求1至6中任一项所述的多肽制备疫苗的方法，主要包括以下步骤(l)抗原肽的化学合成；(2)抗原肽的裂解、沉淀；(3)高压液相色谦分离纯化多肽抗原；(4)疫苗配置。11、根据权利要求10所述的疫苗制备方法，抗原肽的化学合成其特征在于，是以氨基树脂和9芴甲氧羰基(Fmoc)氨基酸为原料，逐步接上氨基酸，每步接肽反应后用乙酰咪唑封闭未反应的活性氨基端，主要包括如下步骤(a)FMOC基团脱除用含15%-35%六氩吡啶的二甲基甲酰氨(DMF)溶液在20-26。C条件反应20-40分钟脱除氨基上保护的FMOC基团，氮气吹干，二甲基甲酰氨(DMF)洗涤树脂；(b)接肽反应加入1-羟基苯丙三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N，N，N，，N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、二异丙基乙胺(DIEA)与FMOC保护的氨基酸在20-28。C条件反应0.5-2.5小时，氮气吹干，二甲基甲酰氨(DMF)洗涤树脂；(c)封闭反应使用1.5%-3.5%的乙酰咪唑在20-26°(:条件反应15-30分钟。12、根据权利要求10所述疫苗的制备方法，其中所述多肽抗原裂解所用试剂为三氟乙酸(TFA)/苯酚(Phenol)/H2O-90/8/2,裂解时间为1-3小时。13、根据权利要求10所述疫苗的制备方法，特征在于，疫苗配制的方法包括如下(a)用注射用水将肽抗原稀释到30-200ug/ml;(b)将油佐剂高压灭菌后备用。(c)在20-28"C条件下将抗原水相与油佐剂按照5:5的比例进行乳化，分装后即得到肽疫苗。全文摘要本发明公开了一种抗口蹄疫病毒感染的肽苗及其制备方法，免疫该肽疫苗后可使易感动物抵抗口蹄疫病毒的感染。该疫苗结合了口蹄疫病毒衣壳蛋白VP1优势B细胞表位和强效外源T细胞表位，具有如SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4所示的氨基酸序列，可以通过化学合成和基因工程的方法制备，产品质量稳定、免疫效果好、安全性好，可用于保护易感动物免受口蹄疫病毒的感染。文档编号A61K39/125GK101653601SQ20091013107公开日2010年2月24日申请日期2009年4月22日优先权日2009年4月22日发明者邵国虎,钰陶申请人:陶钰;邵国虎