专利名称：：手足口病疫苗及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明一般涉及医学领域，更具体地涉及微生物学、免疫学、疫苗和通过免疫预防病毒病原体的感染。
背景技术：
：手足口病(HFMD)最早于1957年由新西兰Seddon加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭子中分离出CoxA16(本文也将其称为"CA16")，同时患者血清抗体有四倍增长，初步查知CoxA16为本病病原。1959年英国伯明翰再次出现流行，Alsop从患者疱疹液中分离出CoxA16，进一步证明此病毒与HFMD的关系，并根据本病病变分布特点，命名为"手足口病，，。1959年美国加利福尼亚也发生流行，Magoffin又提倡使用发渗性口腔炎(Vesicularstomatitisandexanthem)这一称呼。由于HFMD典型病人以口腔、手、足部位发渗，且通常很固定出现，所以许多学者主张使用"手足口病"作为通用名词。60年代以后，许多国家和地区净艮导多次该病的流行，日本自1963-1986年曾6次出现全国性大流行，1982年一次流行，其病例报告为143204例。手足口病是全球性传染性疾病，世界大部分地区均有此病流4于的净艮道。该病早期病原体主要为CoxA16型，1969年美国在中枢神经系统疾病的婴儿粪便标本中分离出EV71病毒并被首次确认。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行，1975年保加利亚报告病例750例，其中149人致瘫，44人死亡。20世纪90年代后期，EV71开始东南亚地区流行。1997年马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，其中4-8月份共有2628人发病，4-6月份有29例病人死亡。新加坡、台湾2008年疫情比去年同期明显上升。1981年上海首次才艮道本病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、青海和广东等IO几个省市均有报道。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出BV71,1998年深圳市卫生防疫站从患者标本中分离出EV71。1998年台湾暴发大规模EV71疫情，估计发病人数达150万，重症405例，死亡78例。2000年80，677人发病，291例重症感染者，41人死亡；2001年389例重症感染者，55人死亡。2007年山东临诉、青岛和济南等地发生主要由EV71引起的手足口病流行，报告病例近4万，报告死亡病例14例。近年来EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势，不断引起严重的中枢神经系统症状，导致儿童死亡。EV71病毒属于微小核糖核酸病毒科肠道病毒属，分为A、B、C三种基因型。EV71极其形、小，为正20面体、直径27nm、内含一条单股RNA。同时该病毒还具有以下特性不耐强碱、56匸以上高温失去活性；紫外线可降低其活性；曱醛、含氯漂白水等化学物质可抑制其活性；没有脂质胞膜，故亲脂性消毒剂如酒精对其无用。EV71和CoxA16引起的手足口病存在隐性感染和轻症病例多，传染源难以发现和控制，儿童普遍易感，传播途径多，难以有效阻断等特征。该病在中国已纳入丙类传染病管理，且目前还没有针对预防该病的疫苗、特异性药物等。
发明内容针对目前手足口病的流行态势，为了更好的预防手足口病的暴发，本发明人经过长期不懈的努力，最终筛选出了可用于预防、治疗或抵抗手足口病的病毒林。在此基础上，本发明的发明人开发了用于预防或治疗手足口病的疫苗或药剂。经实验证明，本发明的疫苗或药剂具有有效的免疫活性和/或功毒保护能力。所以，本发明一方面提供了用于制备针对手足口病的疫苗或药物的病毒株，其分别为EV71的B型和C型以及CoxA16。对于上述病毒株，申请人:于2009年5月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)对其进行了保藏，保藏号分别为CGMCCNo.3061、CGMCCNo.3062、CGMCCNo.3063。优选地，本发明所涉及的保藏毒林是分离的和/或纯化的。进一步的，本发明提供了一种用于预防或治疗手足口病的疫苗或药剂，其包含一种或多种(例如两种或三种)选自上述所保藏的病毒林。对于本发明的疫苗或药剂，其可以是单价的，也可以是多价的(即联合的)，例如二价或三价的。例如，本发明的单价疫苗或药剂包含上述保藏的EV71的B型或C型，或CoxA16病毒林。另一方面，本发明的多价疫苗或药剂(或称"联合疫苗或药剂")例如可以包含两种或三种选自上述保藏的EV71的B型、C型以及CoxA16的病毒林。例如，可选地，本发明的多价疫苗或药剂包含保藏的EV71的B型的病毒林与一种或两种选自其他两种所保藏的病毒林。可选地，本发明的多价疫苗或药剂包含保藏的EV71的C型的病毒林与一种或两种选自其他两种所保藏的病毒林。另外可选地，本发明的多价疫苗或药剂包含保藏的CoxA16的病毒林与一种或两种选自其他两种所保藏的病毒林。再一方面，本发明还提供了一种制备针对手足口病疫苗或药剂的方法，其包括使用上述保藏的病毒林中的一种、两种或三种。再另一方面，本发明还提供了一种或多种(例如两种或三种)选自上述保藏的病毒林在制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂(例如本发明所述的疫苗或药剂)中的用途。再另一方面，本发明提供了一种制备针对手足口病的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清的方法，其中以本发明所迷的毒林、疫苗或药剂为免疫原。本发明还提供了根据该方法所制备的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清。再另一方面，本发明提供了制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂的方法，其包括使用一种、两种或三种选自上述三种保藏的病毒林。当然，本领域的技术人员明白，本发明的疫苗或药剂可进一步包含其他病毒株如肠道病毒72型和/或佐剂。优选地，本发明各实施方式或技术方案中所包含的病毒林为经过灭活的和/或经过纯化的(灭活也可以在纯化以后进行)。进一步优选地，所述灭活是通过P-丙内脂和/或者曱醛来实现的和纯化。对于本发明所述的纯化，其可通过澄清过滤、超滤浓缩、离心、和/或层析等进行。具体而言，本发明中的单价或者联合疫苗或药剂可以不添加佐剂或可以添加佐剂。"佐剂"是用于增强本发明的病毒的免疫原性的物质，且给予佐剂可以加强免疫应答。另一方面，佐剂对本技术人员而言是公知的。具体地，用于增强病毒的有效性的合适的佐剂包括，但不限于1)铝盐，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝，等等；2)水包油乳液制剂，如MF59(PCT公布号WO90/14837)，SAF，RibiT"佐剂系统(RAS);3)皂苷佐剂，如ISC0Ms,细菌脂多糖，合成的脂类A类似物，如氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(AGP)，或者其衍生物或类似物；4)细胞因子，如白介素，干扰素，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，巨噬细胞集落刺激因子，肺瘤坏死因子，等等；和5)作为免疫刺激剂以增强组合物的有效性的其他物质等。本发明的疫苗或药剂可以用于保护或者治疗对EV71或CoxA16感染敏感的受试者(优选是哺乳动物，更优选是人)，这可通过全身或者粘膜途径施用疫苗或药剂来完成。这些施用可以包括通过肌内、腹膜内、皮内或者皮下途径注射，或者通过粘膜施用于口/消化道、呼吸或者泌尿生殖道。施用剂量依个体体重而定，例如可为0.02微克/Kg体重或可为O.l微克/Kg，施用次数可为单次或间隔1—6个月加强一次。在本发明的单价或联合疫苗或药剂中，每个EV71基因型病毒及CoxA16病毒的蛋白抗原成份含量为100纳克-10微克/剂，优选的蛋白抗原成分含量为100纳克-5微克/剂，更优选500纳克-5微克/剂。当然，本领域技术人员应当明白，根据本发明所保藏的毒林为免疫原(例如本发明所述的疫苗)所制备的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞也是属于本发明的保护范围的，因为这对本领域技术人员而言是显而易见或在无需花费创造性劳动的情况下就可以实施的。对于本发明的疫苗或药剂，可通过以下方法制备，所述方法包括如下步骤将不同基因型的病毒分别接种至培养的细胞(例如RD细胞、vero细胞或人胚肺二倍体细胞)后，继续培养接种后的细胞从而经过灭活和纯化(或先纯化后灭活)后获得单价疫苗原液。优选的，上述不同基因型的病毒为上述为了本发明的目的而保藏的病毒。可以向该疫苗原液加入佐剂或不加入佐剂，从而获得针对手足口病的单价疫苗或药剂。获得的单价疫苗原液可以经过配制而获得多价疫苗或药剂，例如2-3价疫苗。优选的，所述多价疫苗中含有佐剂或不含有佐剂。进一步优选的，所述多价疫苗中每一基因型的病毒抗原含量为IOO纳克-10微克/剂。具体的，对于本发明的疫苗或药剂可通过以下方法制备，所述方法包括对于从工作细胞库中取出细胞(例如RD细胞、vero细胞和人胚肺二倍体细胞)进行复苏；对复苏后的细胞进行扩大培养(例如，可以采用转瓶、细胞工厂、发酵罐等方式)；在细胞扩大培养至一定的细胞量后(本领域技术人员可以根据实际需要来进行确定合适的细胞量，例如培养至完全汇合)，按照一定的比例(例如10-100000MOI的病毒浓度)接种病毒，然后继续培养(例如在30-4(TC下培养2-10日)；在无菌的条件下、收获培养后的单价病毒液；对收获的单价病毒液进行灭活(例如通过加入适量p-丙内脂或者甲醛)和纯化。其中，灭活也可以在纯化以后进行。对于本发明所述的纯化，其可通过澄清过滤、超滤浓缩、离心、和/或层析等进行。图1为本发明的疫苗的量效关系。为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。实施例实施例l:制备EV71病毒C基因型疫苗原液建立细胞主种子库和工作种子库(Vero和人胚肺二倍体细胞)将源自美国ATCC120代非洲绿猴肾传代细胞(Vero细胞)种子复苏，具体操作是将安瓶从液氮中取出，迅速置于40"C无菌水中，轻轻振摇使内容物融化，无菌吸出悬液，2000rpm离心10min,吸出上清，再加入含有20%胎牛血清的MEM生长液，通过轻轻吹打将其混匀，将混匀的悬液接种于25cm2的细胞培养瓶中，置于37'C孵育箱中培养过夜，更换细胞培养瓶中的培养液(更换后的培养液为含10°/。胎牛血清的MEM生长液)，再置于37t:孵箱中培养5~8天，待细胞长成致密单层后传代，其中传代按照1:5~1:8的面积比接种细胞瓶，每传代一次增加一代。按上迷方法制备129代Vero细胞工作种子库。根据上述方法，本领域的技术人员能同样制备出满足本发明要求的工作种子库人胚肺二倍体细J包主种子库和工作种子库建立方法与Vero细J包方法相同，细胞主种子库和工作种子库均在液氮(-196°C)中保存。建立主代病毒种子库和工作病毒种子库将从手足口病患者的临床标本中使用敏感细胞(RD细胞、Vero细胞、或人二倍体细胞)分离的EV71或CoxA16病毒经过在细胞上连续传代，按照《中国药典》关于种子库建立方法的要求建立病毒主种子库和工作种子库，种子库均冷冻保存(<-6(TC)。以Vero细胞为例筒述建库方法将来自病毒工作种子库的病毒按照1:1000(体积比)接种至细胞(来自细胞工作种子库)长满单层的细胞瓶中(培养基是含2%胎牛血清的MEM维持液)，并置于3rC下培养，每天观察细胞病变(CPE)。当有80%的细胞表现为CPE状态时，将培养物置于-20。C冷冻，室温融化，重复一次。将冻融物再按照上述操作程序接种至新的单层细胞，开始新的传代，每一批收获物记为一代。将病毒传至病毒滴度稳定、抗原含量稳定、免疫原性稳定后，建立病毒库，并送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。其保藏号为CGMCCNos3061、3062、3063,分别对应EV71的B型、C型以及CoxA16的病毒林。所建立的病毒库用于后续的抗原制备。病毒培养和收获将来自Vero细胞工作种子库的种子经过培养扩增后，将本发明的EV71病毒C基因型工作种子按照10-100000MOI接种到长满单层的细胞瓶中，在30-40。C条件下培养2-10日，等细胞发生50%以上病变以后收获病毒液。将细胞悬液合并收集到瓶中，置于-20'C冷冻，备用。病毒灭活和钝化将上述制备的EV71病毒C基因型病毒收获液用1:100-1:10000(V/V)的p-丙内酯或1:1000-1:10000(V/V)的甲醛溶液灭活。病毒灭活也可以在病毒纯化以后进行。对于上述病毒液的纯化，其可由离心澄清、超滤透析、PEG沉淀、密度梯度离心、层析和除菌过滤等步骤组成。除非另外指出，所有步骤都在室温下进行，具体如下所述。离心澄清4000-10000g，30min离心,合并上清为病毒澄清液超滤透析将装上适宜数目(根据需要处理的样品数量)30-500kD膜包的超滤器用0.1M的NaOH溶液浸泡16hr,然后用5倍体积的注射用水清洗膜包，再用2倍体积的PBS冲洗膜包进行预处理。将病毒澄清液用上述预处理后的超滤器浓缩至原体积的1/10-50,然后用緩沖液超滤透析2-20次，得到病毒超滤液。PEG沉淀向病毒超滤液内加入磁力搅拌子，并在磁力搅拌器上搅拌，同时緩慢加入20-60%PEG，4吏PEG终浓度为5-15%。用l-2MHC1的盐酸调PH值至5.0-7.O之间后，继续搅拌10-60min,于2-8°C下沉淀8-24h。取出PBG沉淀8-24h的病毒超滤液(包括沉淀和上清)，放入离心机并于5000-10000g、2-8'C下离心20-60min。将沉淀用PBS緩沖液重溶，在磁力搅拌器搅拌10-60min后，将其放入离心机中并于3000-10000g、2-8X:下离心20-60min。离心后收集上清P1，同时将沉淀用PBS第二次重溶。对于第二次重溶的沉淀，用磁力搅拌器搅拌10-60min后，放入离心机中于3000-10000g、2-8。C下第二次离心20-60min，离心后收集上清P2，将两次上清Pl和P2合并为病毒沉淀液。蔗糖密度梯度离心将上述获得的病毒沉淀用PBS重新溶解，再进行蔗糖密度梯度离心，离心转速20000-40000rpm，8-24h，收取病毒所在的区带。超滤脱糖收取上述病毒区带的病毒，用超滤器(30-500kD膜包)进行超滤，使用与超滤液等体积的PBS透析(共计透析2-IO次)，直至糖度在5%以下，得到病毒脱糖液。分子篩层析使用sephacryS-400介质装填BPG140/950层析柱，以Q.01MNa0H溶液为流动相，维持1.Obar的压力恒压装柱。丙酮法测柱效，0.5MNa0H溶液在位清洗2-4个柱体积，然后用PBS+吐温80清洗至pH中性。按照2%-10。/。CV上样病毒脱糖液,然后用PBST80洗脱，收集病毒洗脱峰，其中上样和洗脱速度为0.3-10cm/min。30-500kD超滤透析将用分子筛层析获得的病毒洗脱液用超滤器(30-500kD)超滤，然后等体积透析2-10个体积，得到病毒精纯液。除菌过滤用孔径为0.22um的滤器过滤病毒精纯液，收集的滤出液为病毒除菌液，即EV71病毒C基因型疫苗原液。实施例2:制备EV71病毒B基因型疫苗原液采用与实施例1类似的方法来制备本发明所保藏的EV71病毒B基因型的疫苗原液。实施例3:制备CoxA16病毒的疫苗原液采用与实施例1类似的方法来制备本发明所保藏的CoxA16病毒的疫苗原液。实施例4:制备EV71病毒C基因型单价疫苗半成品与成品(氢氧化铝佐剂吸附)将实施例1中获得的EV71病毒C基因型疫苗原液与氢氧化铝溶液(铝含量为0.5-20mg/ml)，使最终蛋白含量为2ug/ml，铝含量为0.5mg/ml，即得到EV71病毒C基因型单价疫苗半成品。将制得的半成品无菌灌装至西林瓶或者预灌封注射器中，即得到EV71病毒C基因型成品。实施例5:制备EV71病毒C基因型单价疫苗半成品与成品(无佐剂)将实施例1中获得的EV71病毒C基因型疫苗原液用0.OIM磷酸緩冲液稀释至最终蛋白含量为2ug/ml，即得到EV71病毒C基因型单价疫苗半成品(无佐剂)。将上述半成品无菌灌装至西林瓶或者预灌封注射器中，即得到EV71病毒C基因型成品(无佐剂)。实施例6:制备EV71病毒B基因型单价疫苗半成品与成品(无佐剂)根据实施例2所制备的EV71病毒B基因型原液并参照实施例5和实施例4的方法进行制备无佐剂或有佐剂的相关疫苗的半成品和成品。实施例7:制备CoxA16病毒单价疫苗半成品与成品(氢氧化铝佐剂吸附)将实施例3中获得的CoxA16病毒疫苗原液与氢氧化铝溶液(铝含量为0.5-20mg/ml)，使最终蛋白含量为2ug/ml，铝含量为0.5mg/ml，即得到CoxA16病毒单价疫苗半成品。将所述半成品无菌灌装至西林瓶或者预灌封注射器中，即得到CoxA16病毒疫苗成品。实施例8:制备CoxA16病毒单价疫苗半成品与成品(无佐剂)将实施例3中获得的CoxA16病毒疫苗原液用0.OIM磷酸緩冲液稀释至最终蛋白含量为2ug/ml，即得到CoxA16病毒型单价疫苗半成品(无佐剂)。将所述半成品无菌灌装至西林瓶或者预灌封注射器中，即得到CoxA16病毒疫苗成品(无佐剂)。实施例9:制备两价或多价联合疫苗(氢氧化铝佐剂吸附)将实施例1、2或3中获得单价病毒原液稀释到合适的蛋白含量后，与氢氧化铝溶液(铝含量为0.5-20mg/ml)，分别吸附或者混合吸附，使最终各个单价病毒原液的蛋白含量为2ug/ml，铝含量为0.5mg/ml，得到两价或多价联合疫苗半成品。将所述半成品无菌灌装至西林瓶或者预灌封注射器中，得到两价或多价联合疫苗成品。实施例10:制备两价或多价联合疫苗(无佐剂)将实施例1、2或3中获得单价病毒原液稀释到合适的蛋白含量后，使最终各个单价病毒原液的蛋白含量为2ug/ml,得到两价或多价联合疫苗半成品。将所述半成品无菌灌装至西林瓶或者预灌封注射器中，得到两价或多价联合疫苗成品。实施例ll:疫苗的免疫原性将实施例4、5、6、7、9制备的疫苗免疫ICR小鼠，考察疫苗的免疫原性。具体为将实施例4、6、7中制备的原液按照8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、lug/ml的剂量配制4批疫苗；将实施例5中制备的原液按照8ug/m1的剂量配制1批疫苗；将实施例9中制备的原液按照每种蛋白8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、lug/ml的剂量配制4批疫苗。选用1822克ICR小鼠，每组10只，采用腹腔注射方法，分别于0和14天接种小鼠，每次接种剂量为O.5ml。在末次接种后的14天采血，分离血清。按照常规实验方法将血清系列稀释后，与100CCIDs。/0.05ml(0.05ml是指病毒液的体积)的病毒混合，置于37摄氏度孵育2小时，然后将其接种至Vero，并在37摄氏度培养5-7天，同时观察细胞病变，其中以出现细胞病变的血清最高稀释度为血清中和效价。中和用毒林为生产用病毒(其是指生产抗体的毒抹与被血清中和的毒林相同)，阳性判定指标中和效价大于1:8;阴性对照血清效价小于1:8试验成立。结果见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果表明使用疫苗免疫ICR小鼠，中和抗体阳转率100%。实施例12:以实施例4中制备的单价疫苗配制抗原含量为2ug/ml、0,5ug/ml、0.125ug/ml、0.031ug/ml的原液，肌肉途径免疫Wistar大鼠，免疫程序l针，0.5ml/只，l-6周分别采血，分离血清，检测中和抗体。结果表明，疫苗的量效关系显著，随着剂量提高，免疫原性随之提高(见图1)。实施例13:攻毒用毒林制备将所分离的毒抹(B基因型)脑内接种ICR乳鼠(l-9日龄)，每只O.Olml，病毒盲传2代，每代7天。选取后肢出现麻痹症状的乳鼠，无菌取脑，研磨，用生理盐水配制10%的悬液。用配制的悬液再次接种乳鼠脑，病毒共传6代，制备攻毒用病毒MP。免疫用样品用实施例4、6和9中的疫苗配制不同蛋白含量的样品。动物Balb/C小鼠免疫和攻毒方法采用腹腔l针免疫程序，剂量0.5ml,10只/组。免疫后第5天用100LD5。(LD5():半数致死量)的病毒量腹腔攻毒，攻毒后观察14天，鼠的发病和存活率。结果见下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>同时，本发明的发明人也对其他联合形式的疫苗进行了功毒试验，均证实本发明的联合疫苗，例如本发明的EV71(B基因型)+CoxA16联合疫苗、EV71(B基因型)+CoxA16+EV71(C基因型)联合疫苗、EV71(B基因型)+EV71(C基因型)联合疫苗具有类似的功毒效果，在此不--赘&o权利要求1、一种病毒株，其保藏号为CGMCCNo.3061。2、一种病毒林，其保藏号为CGMCCNo.3062。3、一种病毒抹，其保藏号为CGMCCNo.3063。4、用于预防或治疗手足口病的疫苗或药剂，其包含一种、两种或三种选自权利要求l、2和3中所述的病毒林，可选地，所述疫苗或药剂包含权利要求1所述病毒抹与一种或两种选自权利要求2和3的病毒林；可选地，所述疫苗或药剂包含权利要求2所述病毒林与一种或两种选自权利要求1和3的病毒抹；另外可选地，所述疫苗或药剂包含权利要求3所述病毒林与一种或两种选自权利要求1和2的病毒株。5、权利要求4中所述的疫苗或药剂，其中所述的病毒林是经过灭活和纯化的。6、一种或多种(例如两种或三种)选自权利要求l-3的病毒林在制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂(例如权利要求4-5中任一项所述的疫苗或药剂)中的用途。7、一种制备抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清的方法，其中以选自权利要求1-3中所述的毒林为免疫原(例如权利要求4-5中任一项所述的疫苗或药剂)。8、通过选自权利要求1-3中所述的毒林为免疫原(例如权利要求4-5中任一项所述的疫苗或药剂)所制备的抗体(例如，多克隆抗体或单克隆抗体，或其功能性片段)或杂交瘤细胞或抗血清。9、制备预防或治疗手足口病的疫苗或药剂的方法，其包括使用一种、两种或三种选自权利要求1、2和3中所述的病毒林，可选地，使用权利要求1所述病毒株与一种或两种选自权利要求2和3的病毒林；可选地，使用权利要求2所述病毒林与一种或两种选自权利要求1和3的病毒林；另外可选地，使用权利要求3所述病毒林与一种或两种选自权利要求1和2的病毒林。10、权利要求9中所述的方法，其中所述的病毒林是经过灭活和纯化的。全文摘要本发明涉及手足口病疫苗及其制备方法和应用，属于预防用新生物制品新型疫苗领域。本发明的疫苗可用于预防手足口病。具体地，本发明通过灭活纯化的EV71的B型和C型以及CoxA16来提供本发明的疫苗。另一方面，本发明的疫苗具有有效的免疫活性或功毒保护能力。文档编号A61K39/135GK101575593SQ20091014392公开日2009年11月11日申请日期2009年6月3日优先权日2009年6月3日发明者公雪杰,刘玉芬,刘瑜喧,尹卫东,卉张,张小梅,张建三,伟胡,韦志华,强高,高正伦申请人:唐山怡安生物工程有限公司