专利名称：传染病治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明是一种涉及用于治疗结核等传染病的传染病治疗剂的发明。
背景技术：
在医疗中，传染病治疗剂的存在是不可缺少的。现在，许多抗生素和合成抗菌剂等 传染病治疗剂被提供于医疗处理中。但是，现在主要被作为传染病治疗剂提供的抗菌剂，事实上伴随着耐药菌的出现 这一不可避免的问题。即，重复着由于出现新的抗菌剂而导致产生新的耐药菌的这种状态。例如，在单一的传染病中占死亡率第一位的结核最近有增加的趋势，已成为世界 性的问题。并且，还证实了对大部分的抗生素具有耐药性的耐药菌的存在，并且该问题日益 明显。现在已经明确了，被称为颗粒溶素且出现在NK细胞和CTL中的分子，对于结核杆 菌等细菌具有直接的杀伤能力[Stenger, S. et al.，Science 282,121-125(1998)]。颗粒溶素被制造成15K后，在细胞毒性颗粒内被加工成9K。15K和9K的颗粒溶素 分别进入巨噬细胞，从而杀伤被巨噬细胞吞入的结核杆菌等细菌。但是，为了使9K颗粒溶 素进入巨噬细胞，而需要作为相同的细胞毒性颗粒内分子的穿孔蛋白。这是由于为了使9K 颗粒溶素进入细胞内需要通过穿孔蛋白对靶细胞打孔。因此，9K颗粒溶素具有细胞毒性。 可是，15K颗粒溶素不需要对靶细胞打孔的穿孔蛋白，就进入巨噬细胞内，从而杀伤被巨噬 细胞吞入的结核杆菌等细菌。因此，15K颗粒溶素没有细胞毒性。本发明人制成了 9K颗粒溶素转基因小鼠和15K颗粒溶素转基因小鼠，对各自的小 鼠和野生型对照小鼠，从尾部静脉中静脉内投入了 5X IO5CFU的H37Rv人型结核杆菌，四周 后分别测量了在肺脏中的结核杆菌数。其结果证实，在15K颗粒溶素转基因小鼠的肺脏中， 具有统计学上的显著性差异(t检验为ρ < 0. 05)，15K颗粒溶素转基因小鼠的肺脏比9K颗 粒溶素转基因小鼠的肺脏中的结核杆菌数更少。根据该事实，本发明人首次发现，15K颗粒 溶素比9K颗粒溶素在生体内的抗结核杀伤效果、抗结核抑制效果更加强大，而且，该事实 提示了 9K颗粒溶素在生体内的抗结核抑制效果非常弱。根据上述的结果，本发明人已经申请了，将不具有细胞毒性且具有比9K颗粒溶素 更强大的结核抑制效果的15K颗粒溶素作为有效成分的传染病治疗剂；以及作为有效成 分，包含插入有对15K颗粒溶素进行编码的基因且使15K颗粒溶素在体内表达的载体的传 染病治疗剂，并获得了专利权(专利文献1)。但是，为了制成更强大的传染病治疗剂，而需 要一种通过组合投入15K颗粒溶素，与单独投入15K颗粒溶素相比，对被巨噬细胞吞入的结 核杆菌等细菌引起的传染病更加有效的传染病治疗剂。
现有技术文献专利文献1 日本专利第4149713号公报
发明内容
发明所要解决的课题本发明的课题在于，提供一种细菌的耐药性较少，并具有与抗生素不同特征的传 染病治疗剂，通过将不具有细胞毒性的15K颗粒溶素组合投入，从而比单独使用15K颗粒溶 素具有更强大的对被巨噬细胞吞入的结核杆菌等细菌的杀伤效果。
用于解决课题的手段第一项所涉及的发明为一种传染病治疗剂，其有效成分包含15K颗粒溶素；以及 载体，该载体中插入有对15K颗粒溶素进行编码的基因，从而使15K颗粒溶素在体内表达。 第二项所涉及的发明为一种传染病治疗剂，其有效成分包含15K颗粒溶素；以及以下的物 质(a)至(c)中的任意一个。(a)白细胞介素6(b)白细胞介素23(c)白细胞介素27第三 项所涉及的发明为一种传染病治疗剂，其有效成分包含载体，其中插入有对15K颗粒溶素 进行编码的基因，从而使15K颗粒溶素在体内表达；以及以下的物质(a)至(c)中的任意一 个。(a)白细胞介素6(b)白细胞介素23(c)白细胞介素27第四项所涉及的发明为一种传 染病治疗剂，其有效成分包含以下的(a)、(b)。(a)插入有对15K颗粒溶素进行编码的基 因，从而使15K颗粒溶素在体内表达的载体；(b)在仙台病毒的被膜上，插入对人型结核杆 菌H37Rv的65KDa热休克蛋白进行编码的基因以及对白细胞介素12进行编码的基因，从而 使65KDa的热休克蛋白和白细胞介素12在体内表达的载体。第五项所涉及的发明是一种 根据第一项或第二项所述的传染病治疗剂，其特征在于，所述15K颗粒溶素是重组蛋白质。 第六项所涉及的发明是一种根据第一项至第五项中任意一项所述的传染病治疗剂，传染病 的致病菌是结核杆菌。
发明的效果根据第一项所述的发明，传染病治疗剂的有效成分包含15K颗粒溶素以及载体， 该载体中插入有对15K颗粒溶素进行编码的基因，从而使15K颗粒溶素在体内表达(以下 称为15K颗粒溶素的体内表达载体)，与单独投入15K颗粒溶素或者单独投入15K颗粒溶素 的体内表达载体相比，通过投入该传染病治疗剂，能够获得不显示细胞毒性、且具有更强的 杀伤被巨噬细胞吞入的结核杆菌等细菌的效果。根据第二项所述的发明，传染病治疗剂的有效成分包含15K颗粒溶素；以及白细 胞介素6(以下称为IL-6)、白细胞介素23(以下称为IL-23)、白细胞介素27(以下称为 IL-27)中的任意一个，与单独投入15K颗粒溶素或者单独投入IL-6、或IL-23、或IL-27相 比，通过投入该传染病治疗剂，能够获得不显示细胞毒性、且具有更强的杀伤被巨噬细胞吞 入的结核杆菌等细菌的效果。根据第三项所述的发明，传染病治疗剂的有效成分包含15K颗粒溶素的体内表 达载体；以及IL-6、IL-23、IL-27中的任意一个，与单独投入15K颗粒溶素的体内表达载体 或者单独投入IL-6、或IL-23、或IL-27相比，通过投入该传染病治疗剂，能够获得更强的杀 伤被巨噬细胞吞入的结核杆菌等细菌的效果。根据第四项所述的发明，传染病治疗剂的有效成分包含15K颗粒溶素的体内表 达载体；以及本发明人开发出的对结核杆菌的体内表达载体，其不仅在小鼠类中，而且在作为最接近于人的结核感染模型的弥猴类中，也表现出较强的结核治疗效果的HVJ-被膜 HSP65DNA和IL-12的DNA的体内表达载体(以下称为HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载 体)。与单独投入15K颗粒溶素的体内表达载体、或者单独投入HSP65DNA和IL-12DNA体 内表达载体相比，通过投入该传染病治疗剂，能够获得更强的杀伤被巨噬细胞吞入的结核 杆菌等细菌的效果。而且，众所周知，HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载体，是在仙台病毒 (HVJ)的被膜上，插入人型结核杆菌H37Rv的65KDa热休克蛋白的DNA(HSP65DNA)和IL-12 的DNA的体内表达载体，并对于结核杆菌具有较强的治疗效果(Okada et. al,Jpn. J. Clin. Immunol. ,31 (5) 356 368 (2008))。根据第五项所述的发明，能够稳定地大量供给15K颗粒溶素蛋白质。根据第六项所述的发明，能够提供对结核杆菌有效的传染病治疗剂。根据本发明，通过15K颗粒溶素和15K颗粒溶素的体内表达载体的组合；15K颗粒 溶素和IL-6、或IL-23、或IL-27的组合；15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-6、或IL-23、 或IL-27的组合；以及15K颗粒溶素的体内表达载体和HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载 体的组合，从而能提供一种没有副作用，且比单独投入15K颗粒溶素具有更强的对被巨噬 细胞吞入的结核杆菌等细菌的杀伤性的传染病治疗剂。
图1为，在腹腔内感染了结核杆菌的小鼠(DBA/1)肝脏中的15K颗粒溶素重组蛋 白质和15K颗粒溶素的体内表达载体的治疗效果图。图2为，在气溶胶感染了结核杆菌的 小鼠(DBA/1)脾脏中的15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-6的治疗效果图。图3为，在气溶胶 感染了结核杆菌的小鼠(DBA/1)脾脏中的15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-6的治疗效 果图。图4为，在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠(BALB/c)肝脏中的15K颗粒溶素重组蛋 白质和IL-6的治疗效果图。图5为，在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠(BALB/c)肺脏中的 15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-6的治疗效果图。图6为，在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠 (DBA/1)肝脏中的15K颗粒溶素重组蛋白质和15K颗粒溶素的体内表达载体的治疗效果图。 图7为，在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠(DBA/1)脾脏中的15K颗粒溶素重组蛋白质和15K 颗粒溶素的体内表达载体的治疗效果图。图8为，在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠(DBA/1) 脾脏中的15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-23的治疗效果图。图9为，在气溶胶感染了结核 杆菌的小鼠(DBA/1)肝脏中的15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-23的治疗效果图。图10为， 在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠(DBA/1)肺脏中的15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-23的治 疗效果图。图11为，在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠(DBA/1)脾脏中的15K颗粒溶素的体 内表达载体和IL-23的治疗效果图。图12为，在气溶胶感染了结核杆菌的小鼠(BALB/c) 肺脏中的15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-27的治疗效果图。图13为，在气溶胶感染了结核 杆菌的小鼠(DBA/1)肝脏中的15K颗粒溶素的体内表达载体和HSP65DNA和IL-12DNA体内 表达载体的治疗效果图。
具体实施例方式以下对本发明的实施方式进行说明。作为本治疗剂的有效成分所使用的15K颗 粒溶素，虽然能够从生体中分离使用，但因为是生体微量成分，因而优选为，使用作为使编码15K颗粒溶素的基因表达所获得的重组蛋白质。而且，优选的方法为，将插入了对15K颗 粒溶素进行编码的基因的15K颗粒溶素的体内表达载体作为有效成分，并使其在体内产生 15K颗粒溶素。(15K颗粒溶素的重组蛋白质的制备方法)编码15K颗粒溶素的基因序列已经被报 导，根据该序列，能有效地制备编码15K颗粒溶素的基因，通过使该基因表达，从而能够制 备15K颗粒溶素的重组蛋白质。具体而言，将与编码15K颗粒溶素的基因序列的两端互补的核苷酸链作为扩增引 物，通过PCR法等基因扩增方法，从而制备编码15K颗粒溶素基因的基因扩增产物。将其插 入合适的基因表达载体中，从利用重组载体进行了转化的大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫 细胞等合适的宿主中，能够获得所希望的15K颗粒溶素。在这里所用的基因表达载体，优选使用在通常要表达的基因的上游区域中拥有启 动子、增强子、以及在下游区域中拥有转录终止序列等的载体。而且，15K颗粒溶素基因的表达，可以不限于直接表达系统，例如有利用了 β _半 乳糖苷酶基因、谷胱甘肽-S-转移酶基因或硫氧还蛋白基因的融合蛋白表达系统。作为基因表达载体，例如可以包括用大肠杆菌作为宿主的pQE、pGEX、pT7-7、pMAL、 pTrxFus、pET、pNT26C II等。而且，还可以包括用枯草杆菌作为宿主的pPL608、pNC3、pSM23、 pKH80 等。另外，基因表达载体可以包括用酵母作为宿主的pGT5、pDB248X、pARTl、pREPl、 YEpl3、YRp7、YCp50 等。而且，基因表达载体可以包括用哺乳动物细胞或昆虫细胞作为宿主的p91023、 pCDM8, pcDL-SRa 296、pBCMGSNeo、pSV2dhfr, pSVdhfr, pAc373、pAcYMl、pRc/CMV、pREP4、 pcDNAI 等。根据表达15K颗粒溶素的目的，可以选择这些基因表达载体。例如，在表达15K颗 粒溶素的情况下，优选选择能够选定为宿主的大肠杆菌、枯草杆菌或酵母等基因表达载体， 在表达15K颗粒溶素以使其即使少量也可靠地具有活性的情况下，优选选择能够选定为宿 主的哺乳动物细胞或昆虫细胞的基因表达载体。而且，虽然能够选择如上所述的现有的基因表达载体，但当然也能够根据目的来 制备合适的基因表达载体，并使用该基因表达载体。将插入了 15K颗粒溶素基因的所述基因表达载体向宿主细胞的导入及其转化方 法，能够根据一般的方法进行，例如在宿主细胞是大肠杆菌或枯草杆菌的情况下，能够根据 氯化钙方法和电穿孔方法等方法进行，在宿主 胞是哺乳动物细胞或昆虫细胞的情况下， 能够根据磷酸钙方法、电穿孔方法或脂质体方法等方法进行。通过将由此所获得的转化体根据常规方法进行培养，从而蓄积所希望的15K颗粒 溶素。用于培养的培养基，能够根据宿主的性质进行适当选择，例如在宿主细胞是大肠杆菌 的情况下，可以适当使用LB培养基或TB培养基，在宿主是哺乳动物细胞的情况下，可以适 当使用RPMI1640培养基等。根据常规方法，能够对通过该培养所得的培养物中的15K颗粒溶素进行分离以及 提纯，例如能够使用培养物，并进行利用了 15K颗粒溶素的物理以及/或化学性质的各种处
理操作。
具体而言，利用蛋白质沉淀剂的处理、超滤、凝胶过滤、高速液相色谱、离心分离、 电泳、使用了特异抗体的亲合色谱法、透析法等，可以单独或者组合使用这些方法。(15K颗粒溶素的体内表达载体的制备方法)该方式的本治疗剂的有效成分为重 组载体，其将用于所述重组蛋白质表达的编码15K颗粒溶素的基因，插入到体内表达载体 中。作为体内表达载体，例如包括腺病毒载体、逆转录病毒载体等，但并不限定于这些 载体。体内表达载体为，例如在插入了所述病毒基因的粘粒载体上，再插入能够表达15K 颗粒溶素的基因，通过将该粘粒载体、以及进行了限制性内切酶处理的亲本病毒DNA-TP，在 293细胞上进行转染，从而在该293细胞内产生相同的重组，并产生所希望的体内表达载 体。(将15K颗粒溶素重组蛋白质和15K颗粒溶素的体内表达载体作为有效成分的本 治疗剂)通过使用15K颗粒溶素的重组蛋白质和15K颗粒溶素的体内表达载体的两种物 质，从而能够获得比单独使用所述物质具有更强的杀伤被巨噬细胞吞入的结核杆菌等细菌 的效果。能够在15K颗粒溶素中混合适当的医药制剂载体而制备成制剂组合物的形式(当 然仅有15K颗粒溶素也能够制备)。作为医药制剂载体，例如能够根据具体的剂型，自由选 择作为适当的医药制剂载体而常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、稳定剂、增溶剂、崩 解剂、表面活性剂等赋形剂和稀释剂。只要能够在传染病的治疗用途中有效地使用15K颗 粒溶素，就对制剂组合物的形式没有特别限制，例如可以是片剂、粉剂、颗粒剂、丸剂等固体 剂型，也可以是液剂、混悬剂、乳剂等注射剂的形式。而且，通过在15K颗粒溶素中添加适当 的载体，也能够制成在使用时成为液体状的干燥品。15K颗粒溶素的体内表达载体是对上述所制备的体内表达载体进行分离和提纯而 成的，通过在生体内投入该15K颗粒溶素的体内表达载体，从而在生体内产生15K颗粒溶 素，并能够发挥该15K颗粒溶素的药理效果。给药量可以根据剂型的给药方法、给药形式、患者的症状等进行适当选择，对其没 有特别限制，优选为，有效成分的15K颗粒溶素重组蛋白质10000 y g/50kg以一天一次或者 一天分数次给药，而且，15K颗粒溶素的体内表达载体2000 u g/50kg以一天一次、分别间隔 数天给药六次。另外，由于15K颗粒溶素的体内表达载体为一般的注射剂形式，因此，通过在15K 颗粒溶素的重组蛋白质中添加适当的载体，从而能够作为注射剂的形式在静脉内、肌肉内、 骨内、关节内、皮下、皮内、腹腔内同时或者分间隔地交替投入15K颗粒溶素重组蛋白质以 及15K颗粒溶素的体内表达载体。(将15K颗粒溶素的重组蛋白质、以及IL-6、IL-23、IL_27中的任意一个作为有效 成分的本治疗剂)通过使用15K颗粒溶素的重组蛋白质、以及IL-6或IL-23或IL-27中的 任意一个，从而能够获得比单独使用所述物质具有更强的杀伤被巨噬细胞吞入的结核杆菌 等细菌的效果。15K颗粒溶素的重组蛋白质以及IL-6或IL-23或IL-27能够混合适当的医药制剂 载体，将其制备成制剂组合物的形式。作为医药制剂载体，例如根据具体的剂型，可以自由 选择作为适当的医药制剂载体常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、稳定剂、增溶剂、崩
7解剂、表面活性剂等赋形剂和稀释剂。只要能够在传染病的治疗用途中有效地使用15K颗 粒溶素的重组蛋白质、以及IL-6或IL-23或IL-27中的任意一个，就对制剂组合物的形式 没有特别限制，例如可以是片剂、粉剂、颗粒剂、丸剂等固体剂型，也可以是液剂、混悬剂、乳 剂等注射剂的形式。而且，通过在15K颗粒溶素的重组蛋白质、以及IL-6或IL-23或IL-27 中的任意一个内添加适当的载体，也能够制成在使用时成为液体状的干燥品。通过上述方式所得的本治疗剂的给药量，可以根据剂型的给药方法、给药形式、 患者的症状等进行适当选择，对其没有特别限制，优选为，在有效成分的15K颗粒溶素重 组蛋白质为 10000 μ g/50kg、IL-6 为 2500 μ g/50kg、IL-23 为 5000 μ g/50kg、IL-27 为 2500μ g/50kg的情况下，以一天一次或者一天分数次给药、间隔数天到一周以上给药六次。 而且，能够同时或者分间隔地交替投入两种物质。另外，由于15K颗粒溶素蛋白质和白细胞介素的组合，对被巨噬细胞吞入的结核 杆菌等细菌具有很强的杀伤效果，因而能够将治疗次数减少为三次。各种形式的医药制剂，根据其形式使用适当的给药途径，例如在注射剂形式的情 况下，通过静脉内、肌肉内、骨内、关节内、皮下、皮内、腹腔内给药等进行给药，在固体制剂 的情况下，通过口服和经肠道给药等进行给药。(将15K颗粒溶素的体内表达载体、以及IL-6、IL-23、IL_27中的任意一个作为有 效成分的本治疗剂)通过使用15K颗粒溶素的体内表达载体、以及IL-6和IL-23和IL-27 中的任意一个，从而能够获得比单独使用所述物质具有更强的杀伤被巨噬细胞吞入的结核 杆菌等细菌的效果。在15K颗粒溶素的体内表达载体以及IL-6或IL-23或IL-27中，能够混合所述适 当的医药制剂载体，并能调节使用制剂组合物的形式。上述所得的本治疗剂的给药量，可以 根据剂型的给药方法、给药形式、患者的症状等进行适当选择，对其没有特别限制，优选为， 在有效成分的15K颗粒溶素的体内表达载体为2000 μ g/50kg的情况下以一天一次给药、以 及分别间隔数天到一周以上给药六次。在IL-6为2500 μ g/50kg、IL-23为5000 μ g/50kg、 IL-27为2500μ g/50kg的情况下，以一天一次或者一天分数次给药、分别间隔数天到一周 以上给药六次。另外，由于15K颗粒溶素的体内表达载体为一般的注射剂形式，因此，通过在 IL-6、IL-23、IL-27中的任意一个内添加适当的载体，从而能够以注射剂的形式同时或者交 替投入这两种物质。(将15K颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载体作 为有效成分的本治疗剂)15K颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表 达载体的给药形式，一般是注射剂形式，其能够通过静脉内、肌肉内、骨内、关节内、皮下、皮 内、腹腔内给药等进行给药。所述本治疗剂的给药量，可以根据剂型的给药方法、给药形式、 患者的症状等进行适当选择，对其没有特别限制。一般优选为，在作为有效成分的15K颗粒溶素的体内表达载体为2000μ g/50kg、 以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载体为2000 μ g/50kg时，以一天一次，间隔数天给药 六次。另外，由于15K颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载 体的组合，对被巨噬细胞吞入的结核杆菌等细菌具有较强的杀伤效果，因而能够将治疗次数减少为三次。 [实施例]以下记载了本发明的实施例。在使用了以下物质时对细菌杀伤效果的提高进行说明，S卩、(1)15K颗粒溶素重 组蛋白质和15Κ颗粒溶素的体内表达载体；(2) 15Κ颗粒溶素重组蛋白质和IL-6、IL-23、 IL-27中的任意一个；(3) 15Κ颗粒溶素的体内表达载体和IL-6、IL-23、IL-27中的任意一 个；(4) 15Κ颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载体。以下所使用的协同效果的术语是指，与单独使用各个物质相比，组合使用两个物 质能够提高对细菌的杀伤效果。以下的表1表示在实验中所使用的Gl组到GlO组。[表 1] (使用试剂等)15K颗粒溶素重组蛋白质使用了R&D Systems公司的精制蛋白质。 IL-6 使用了 Miltenyi Biotec (Auburn, CA)公司的精制蛋白质。IL-23、IL-27 使用了 R&D Systems公司的重组小鼠(recombinant mouse) IL-23以及重组小鼠IL-27的精制蛋白质。15K颗粒溶素的体内表达载体，是在CAG载体上连接15K颗粒溶素的基因，再将其 插入到仙台病毒(HVJ)的被膜上。而且，HSP65DNA和IL-12DNA的体内表达载体，使用了在 pcDNA3*l载体上连接了各自的基因再插入到仙台病毒(HVJ)的被膜上。小鼠使用了 DBA/1 和BALB/c。这些小鼠都容易感染结核杆菌。显著性差异检验使用了 t检验。在以下的实验中，当投入15K颗粒溶素重组蛋白质时，每只鼠(20g) —天投入 4yg。当投入15K颗粒溶素的体内表达载体时，每只鼠(20g) —天为100 μ g/0. 2ml，以各 50 μ g对两侧下肢的胫骨前肌进行肌肉注射给药。IL-6为每只鼠(20g) —天1μ g(彡5X104 国际单位)，IL-23为每只鼠(20g) —天2 μ g(彡5X IO4国际单位)，IL-27为每只鼠(20g) 一天1 μ g( > 5X IO4国际单位)，将上述物质分成三次各以1/3进行了腹腔内给药。感染的细菌使用了人型结核杆菌H37Rv。当腹腔内感染结核杆菌时，将1 X IO7CFU 悬浮于0.2ml生理盐水中，对其进行了腹腔内给药。当肺感染结核杆菌时，在气雾室中，由 小鼠气道内投入了 1X103CFU。(实验1)(关于在腹腔内感染时，15K颗粒溶素重组蛋白质和15K颗粒溶素的体内 表达载体对结核杆菌的协同效果)使8周的DBA/1小鼠腹腔内感染了结核杆菌。将小鼠分 成了未给药的组(Gl组)、投入15K颗粒溶素重组蛋白质和15K颗粒溶素的体内表达载体的 组(G2组)、仅投入15K颗粒溶素重组蛋白质的组(G5组)、仅投入15K颗粒溶素的体内表 达载体的组(G6组)。对G2组分间隔地投入了四次15K颗粒溶素重组蛋白质。而且，分间隔地投入了七 次15K颗粒溶素的体内表达载体。在与G2组的同一天，对G5组仅投入了 15K颗粒溶素重 组蛋白质，并对G6组仅投入了 15K颗粒溶素的体内表达载体。对Gl组未给药。其后进行解剖，将肝脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，G2组的菌落数要比G5组、G6组都少，将各组的每三只鼠的菌落数改 为对数(Iogltl)并进行了显著性差异检验，G2组相对于G5组、G6组，具有统计学上的显著 性差异(P < 0. 05)即结核杆菌数的减少。而且，对于对照的Gl组以及G2组、G5组、G6组，利用相同的方法进行了显著性差 异检验，其结果证实，所有的G2组、G5组、G6组都对Gl组具有统计学上的显著性差异(ρ < 0. 05)即结核杆菌数的减少(图1)。因此可以明确，15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒溶素的体内表达载体在肝脏 中，即使分别被单独使用也有效果，若组合使用，则具有显著提高杀伤结核杆菌的协同效果。(实验2)(关于在DBA/1小鼠中15K颗粒溶素重组蛋白质和IL_6对结核杆菌的协 同效果)在气雾室中，使8周的DBA/1小鼠肺感染了结核杆菌。将小鼠分成了未给药的组 (Gl组)、投入15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-6的组(G3组)、仅投入15K颗粒溶素重组蛋 白质的组(G5组)、仅投入IL-6的组(G7组)。对G3组，分别交替地投入了六次15K颗粒溶素重组蛋白质和IL_6。分别对G5组 分六次仅投入了 15K颗粒溶素重组蛋白质，对G7组分六次仅投入了 IL-6。对Gl组未给药。其后进行解剖，将脾脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，G3组的菌落数要比G5组和G7组都少，将各组的每三只鼠的菌落数 作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G3组相对于G5组、G7组，具有统计学上的显著 性差异(P < 0. 05)即结核杆菌数的减少。而且，对于对照的Gl组和G3组、G5组、G7组，利用相同的方法进行了显著性差 异检验，其结果证实，所有的G3组、G5组、G7组都对Gl组具有统计学上的显著性差异(ρ < 0. 05)、即结核杆菌数的减少(图2)。因此可以明确，15Κ颗粒溶素重组蛋白质和IL-6在脾脏中，即使分别被单独使用 也有效果，若组合使用，则具有显著提高杀伤结核杆菌的协同效果。(实验3)(关于15Κ颗粒溶素的体内表达载体和IL-6对结核杆菌的协同效果)在 气雾室中，使8周的DBA/1小鼠肺感染了结核杆菌，将小鼠分成了未给药的组(Gl组)、投入 15Κ颗粒溶素的体内表达载体和IL-6的组(G9组)、仅投入15Κ颗粒溶素的体内表达载体 的组(G6组)、仅投入IL-6的组(G10组)。对G9组分别投入了六次15Κ颗粒溶素的体内表达载体和IL_6。在全部实验期间 的前半程投入了 15K颗粒溶素的体内表达载体，在后半程投入了 IL-6。对G6组分六次仅投 入了 15K颗粒溶素的体内表达载体，对GlO组分六次仅投入了 IL-6。对Gl组未给药。其后进行解剖，将脾脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，G9组的菌落数要比G6组和GlO组都少，将各组的每三只鼠的菌落数 作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G9组相对于G6组、GlO组，具有统计学上的显著 性差异(P < 0. 05)即结核杆菌数的减少。而且，对于对照的Gl组和G9、G6、G10组，利用相同的方法进行了显著性差异检验， 其结果证实，所有的G9组、G6组、GlO组都对Gl组具有统计学上的显著性差异(ρ < 0. 05)、 即结核杆菌数的减少(图3)。因此可以明确，15Κ颗粒溶素的体内表达载体和IL-6的组合在脾脏中，要比分别 单独使用具有显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。(实验4)(关于在BALB/c小鼠中15K颗粒溶素重组蛋白质和IL_6对结核杆菌的 协同效果)在气雾室中，使常用于结核感染实验的BALB/c小鼠肺感染了结核杆菌。将这些 小鼠分成了未给药的组(Gl组)、投入15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-6的组(G3组)、仅投 入15K颗粒溶素重组蛋白质的组(G5组)、仅投入IL-6的组(G7组)。对G3组分别交替地投入了六次15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-6。分别对G5组分六次仅投入了 15K颗粒溶素重组蛋白质，对G7组分六次仅投入了 IL-6。对Gl组未给药。其后进行解剖，将肝脏和肺脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14天，并测量 了结核杆菌的菌落数。
其结果证实，G3组的菌落数要比G5组和G7组都少，将各组的每三只鼠的菌落数 作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G3组相对于G5组、G7组，具有统计学上的显著 性差异(P < 0. 05)即结核杆菌数的减少。而且，对于对照的Gl组和G3、G5、G7组，利用相同的方法进行了显著性差异检验， 其结果证实，所有的G3组、G5组、G7组都对Gl组具有统计学上的显著性差异(ρ < 0. 05)、 即结核杆菌数的减少(肝脏(图4)、肺脏(图5))。因此可以明确，15Κ颗粒溶素和IL-6在肝脏和肺脏中，即使分别被单独使用也有 效果，若组合使用，则具有显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。(实验5)(关于在肺感染中，DBA/1小鼠中的15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒 溶素的体内表达载体对结核杆菌的协同效果)在气雾室中，使8周的DBA/1小鼠肺感染了 结核杆菌。将这些小鼠分成了投入15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒溶素的体内表达载 体的组(G2组)、仅投15Κ颗粒溶素重组蛋白质的组(G5组)、仅投入15Κ颗粒溶素的体内 表达载体的组(G6组)。对G2组分间隔地、且在同一天投入了六次15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒溶 素的体内表达载体。对G5组分六次仅投入了 15Κ颗粒溶素重组蛋白质，对G6组分六次仅 投入了 15Κ颗粒溶素的体内表达载体。其后进行解剖，将肝脏的细胞在7Η11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，G2组的菌落数要比G5组、G6组都少，将各组的每三只鼠的菌落数作 为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G2组相对于G5组、G6组，具有统计学上的显著性 差异(ρ < 0. 05)，即结核杆菌数的减少(图6)。因此可以明确，15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒溶素的体内表达载体在肝脏 中，若组合使用，则具有显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。(实验6)(关于在肺感染中15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒溶素的体内表达 载体对结核杆菌的协同效果)在气雾室中，使8周的DBA/1小鼠肺感染了结核杆菌。将这 些小鼠分成了未给药的组(Gl组)、投入15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒溶素的体内表 达载体的组(G2组)、仅投入15Κ颗粒溶素重组蛋白质的组(G5组)、仅投入15Κ颗粒溶素 的体内表达载体的组(G6组)。对G2组分间隔地、且在同一天分六次投入了 15Κ颗粒溶素重组蛋白质和15Κ颗粒 溶素的体内表达载体。对G5组分六次仅投入了 15Κ颗粒溶素重组蛋白质，对G6组分六次 仅投入了 15Κ颗粒溶素的体内表达载体。对Gl组未给药。其后进行解剖，将脾脏的细胞在7Η11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，G2组的菌落数要比G5组、G6组都少，将各组的每三只鼠的菌落数作 为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G2组相对于G5组、G6组，具有统计学上的显著性 差异(ρ < 0. 05)即结核杆菌数的减少。
而且，对于作为对照的Gl组和G2、G5、G6组，利用相同的方法将各组的每三只鼠的 菌落数作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，其结果证实，所有的G2组、G5组、G6组都 对Gl组具有统计学上的显著性差异(ρ <0.05)、即结核杆菌数的减少(图7)。因此可以明确，15K颗粒溶素重组蛋白质和15K颗粒溶素的体内表达载体在脾脏 中，即使分别被单独使用也有效果，若组合使用，则具有显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。(实验7)(关于15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-23对结核杆菌的协同效果)在气 雾室中，使DBA/1小鼠肺感染了结核杆菌。将这些小鼠分成了未给药的组(Gl组)、投入15K 颗粒溶素重组蛋白质和IL-23的组(G3组)、仅投入15K颗粒溶素重组蛋白质的组(G5组)、 仅投入IL-23的组(G7组)。对G3组分别交替地投入了六次15K颗粒溶素重组蛋白质和IL-23。分别对G5组 分六次仅投入了 15K颗粒溶素重组蛋白质，对G7组分六次仅投入了 IL-23。对Gl组未给 药。其后进行解剖，将脾脏、肝脏以及肺脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14 天，并测量了结核杆菌的菌落数。其结果证实，在所有的脾脏、肝脏以及肺脏中，G3组的菌落数要比G5组和G7组都 少，将各组的每三只鼠的菌落数作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G3组相对于G5 组、G7组，具有统计学上的显著性差异(ρ < 0. 05)，即结核杆菌数的减少。而且，对于作为对照的Gl组和G3、G5、G7组，利用相同的方法对各组的每三只鼠进 行了显著性差异检验，其结果证实，所有的G3组、G5组、G7组都对Gl组具有统计学上的显 著性差异(P < 0. 05)、即结核杆菌数的减少(脾脏(图8)、肝脏(图9)、肺脏(图10))。因此可以明确，15K颗粒溶素和IL-23在所有的脾脏、肝脏和肺脏中，即使分别被 单独使用也有效果，若组合使用，则具有显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。(实验8)(关于15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-23对结核杆菌的协同效果) 在气雾室中，使DBA/1小鼠肺感染了结核杆菌，将这些小鼠分成了未给药的组(Gl组)、投入 15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-23的组(G4组)、仅投入15K颗粒溶素的体内表达载体 的组(G6组)、仅投入IL-23的组(G7组)。对G4组分别交替地投入了六次15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-23。分别对 G6组分六次仅投入了 15K颗粒溶素的体内表达载体，对G7组分六次仅投入了 IL-23。对Gl 组未给药。其后进行解剖，将脾脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，G4组的菌落数要比G6组和G7组都少，将各组的每三只鼠的菌落数 作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G4组相对于G6组、G7组，具有统计学上的显著 性差异(P < 0. 05)，即结核杆菌数的减少。而且，对于作为对照的Gl组和G4、G6、G7组，利用相同的方法进行了显著性差 异检验，其结果证实，所有的G4组、G6组、G7组都对Gl组具有统计学上的显著性差异(ρ < 0. 05)、即结核杆菌数的减少(图11)。因此可以明确，15Κ颗粒溶素的体内表达载体和IL-23在脾脏中，即使分别被单独使用也有效果，若组合使用，则具有显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。(实验9)(关于15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-27对结核杆菌的协同效果) 在气雾室中，使BALB/c小鼠肺感染了结核杆菌，将这些小鼠分成了投入15K颗粒溶素的体 内表达载体和IL-27的组(G4组)、仅投入15K颗粒溶素的体内表达载体的组(G6组)、仅 投入IL-27的组(G7组)。对G4组分别交替地投入了六次15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-27。分别对 G6组分六次仅投入了 15K颗粒溶素的体内表达载体，对G7组分六次仅投入了 IL-27。其后进行解剖 ，将肺脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，G4组的菌落数要比G6组和G7组都少，将各组的每三只鼠的菌落数 作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，G4组相对于G6组、G7组，具有统计学上的显著 性差异(P < 0. 05)即结核杆菌数的减少(图12)。因此可以明确，15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-27在肺脏中，若组合使用，则 具有显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。(实验10)(关于15K颗粒溶素的体内表达载体和HSP65DNA和IL-12DNA体内表 达载体对结核杆菌的协同效果)在气雾室中，使8周的DBA/1小鼠肺感染了结核杆菌，将这 些小鼠分成了投入15K颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载 体的组(Gll组)、仅投入15K颗粒溶素的体内表达载体的组(G6组)、仅投入HSP65DNA和 IL-12DNA体内表达载体的组(G12组)。对Gll组分别交替地投入了六次15K颗粒溶素的体内表达载体和HSP65DNA和 IL-12DNA体内表达载体。对G6组分六次仅投入了 15K颗粒溶素的体内表达载体，对G12组 分六次仅投入了 HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载体。其后进行解剖，将肝脏的细胞在7H11平板琼脂培养基中培养14天，并测量了结核 杆菌的菌落数。其结果证实，Gll组的菌落数要比G6组和G12组都少，将各组的每三只鼠的菌落 数作为对数(Iogltl)进行了显著性差异检验，Gll组相对于G6组、G12组，具有统计学上的 显著性差异(P < 0. 05)即结核杆菌数的减少(图13)。因此可以明确，15K颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达 载体的组合在肝脏中，要比分别被单独使用具有更显著提高对结核杆菌杀伤的协同效果。
产业上的可利用性根据本发明，能够提供一种副作用较少、且细菌难以获得耐药性的有效的传染病 治疗剂，该传染病治疗剂的有效成分包含15K颗粒溶素和15Κ颗粒溶素的体内表达载体的 组合；15Κ颗粒溶素和IL-6、IL-23或IL-27的组合；15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-6、 IL-23或IL-27的组合；15K颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达 载体的组合。
权利要求
一种传染病治疗剂，其有效成分包含15K颗粒溶素；以及载体，该载体中插入有对15K颗粒溶素进行编码的基因，从而使15K颗粒溶素在体内表达。
2.一种传染病治疗剂，其有效成分包含15K颗粒溶素；以及以下的物质(a)至(c)中 的任意一个，(a)白细胞介素6、(b)白细胞介素23、(c)白细胞介素27。
3.一种传染病治疗剂，其有效成分包含载体，该载体中插入有对15K颗粒溶素进行编 码的基因，从而使15K颗粒溶素在体内表达；以及以下的物质(a)至(c)中的任意一个，(a)白细胞介素6、(b)白细胞介素23、(c)白细胞介素27。
4.一种传染病治疗剂，其有效成分包含以下的(a)、(b)，(a)插入有对15K颗粒溶素进行编码的基因，从而使15K颗粒溶素在体内表达的载体；(b)在仙台病毒的被膜上，插入对人型结核杆菌H37Rv的65KDa热休克蛋白进行编码 的基因以及对白细胞介素12进行编码的基因，从而使65KDa的热休克蛋白和白细胞介素12 在体内表达的载体。
5.根据权利要求1或2所述的传染病治疗剂，其特征在于，所述15K颗粒溶素是重组蛋 白质。
6.根据权利要求1或2所述的传染病治疗剂，传染病的致病菌是结核杆菌。
7.根据权利要求3或4所述的传染病治疗剂，传染病的致病菌是结核杆菌。
8.根据权利要求5所述的传染病治疗剂，传染病的致病菌是结核杆菌。
全文摘要
本发明的课题在于，提供一种细菌的耐药性较少，并具有与抗生素不同特征的传染病治疗剂，该传染病治疗剂通过组合投入不具有细胞毒性的15K颗粒溶素，从而比单独使用15K颗粒溶素具有更强的杀菌效果。本发明通过提供一种副作用较少，且细菌难以获得耐药性的有效的传染病治疗剂，从而解决了所述课题。该传染病治疗剂的有效成分包含15K颗粒溶素和15K颗粒溶素的体内表达载体的组合；15K颗粒溶素和IL-6、IL-23或IL-27的组合；15K颗粒溶素的体内表达载体和IL-6、IL-23或IL-27的组合；15K颗粒溶素的体内表达载体以及HSP65DNA和IL-12DNA体内表达载体的组合。
文档编号A61P31/06GK101869714SQ200910206609
公开日2010年10月27日 申请日期2009年10月21日 优先权日2009年4月24日
发明者冈田全司, 小川一行, 永田钦也, 高森靖 申请人:独立机构近畿中央胸部疾患中心;冈田全司;株式会社Az生物器材;高森靖