用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物的制作方法

专利名称：用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及包括半胱氨酸蛋白酶变应原用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物。
背景技术：
过敏症是全世界的主要健康问题。特应性疾病例如变应性鼻炎、哮喘和特应性湿 疹已成为慢性健康不良的主因之一。目前，术语‘过敏症’通常与IgE介导的疾病相联系。 每个人每天都遭受可能的变应原。许多变应原是在干燥颗粒例如猫毛屑、房尘螨的粪便或 花粉粒上携带的小的高可溶蛋白质。当我们呼吸时，这些颗粒遭遇气道粘液。某些人具有关于产生针对变应原的速发型超敏反应的遗传倾向。这称为特应性， 并且特应性个体具有在其循环中比非特应性个体更高水平的嗜酸性粒细胞和更高的IgE 总水平。它们还通常具有超过一种特应性疾病。暴露于变应原可以导致称为变态反应或超敏反应的免疫系统过度反应。超敏反应 分成4个类别1型超敏性是由IgE介导的速发型超敏反应，并且主要是变应性鼻炎、哮喘 和全身性过敏反应的原因。当暴露于变应原时，非特应性个体将仅发动弱免疫应答，产生变 应原特异性IgGl和IgG4抗体(Thl应答)。然而，当它是病原体时，特应性个体对变应原有 反应。B细胞因此受刺激产生IgE而不是产生IgG (Th2应答)。IgE随后通过高亲和力IgE 受体Fc ε RI与肥大细胞结合。个体第二次遇到相同变应原时，它导致超敏反应。2个肥大 细胞结合的IgE分子与单个变应原交联，刺激毒性介质例如组胺和肝素、细胞因子和酶从 肥大细胞的颗粒中的释放。组胺的释放导致增加的血管通透性、血管舒张(局部血管膨胀) 和平滑肌收缩。所有这些因素相组合导致变态反应。对气道的作用是哮鸣、咳嗽和喷嚏，并 且在胃肠道中，它通常将引起腹泻与呕吐。由来自房尘螨的变应原介导的变应性应答是I型超敏性。在全世界的潮湿区 域中，尘螨到处都是。已鉴定了在室尘中生活的高达13个不同物种，并且80%的所有这 些螨由3个最常见HDM物种代表屋尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)、粉尘螨 (Dermatophagoidesfarinae)和宇尘螨(Euroglyphus maynei)。在这些暖湿地理区域中， 尘螨物种占大约30%的人口中的阳性皮肤测试反应。HDMs被视为过敏症的主要原因之一。螨粪便和螨尸体是引发变应性应答的变应原来源。螨粪便团块的大小是 10-20 μ m，这使得它易于空气传播。迄今为止，鉴定了来自屋尘螨也称为欧洲房尘螨的14 个不同变应原组。在螨变应性个体组中，Der pi和Der p2将在超过60%的个体中与来自血清的IgE 结合。它们因此被视为主要变应原。Per piDer pi是主要房尘螨变应原，并且当提及尘螨特异性IgE介导的超敏性时，被视 为主要免疫显性变应原之一。它是25371Da半胱氨酸蛋白酶，并且属于异种集团(clan) CA——木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。它作为320个氨基酸的失活前体合成。为了使蛋白 质变得成熟，前肽的切割是必需的，变成长222个氨基酸的蛋白质。Der pi仅在屋尘螨粪便 颗粒中以其成熟形式发现，并且因此它是组成变应原的成熟蛋白质。
木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶的催化活性依赖于称为催化三联体的3个残基。它 们是半胱氨酸、组氨酸和天冬酰胺。催化半胱氨酸必须还原以便使酶活化。半胱氨酸蛋白 酶可以由E64(L-反式环氧丁二酰基-亮氨酰氨(4-胍基)丁烷)不可逆地抑制。人体外研究已显示Der pi可以切割许多蛋白质，导致增强的Th2应答。此外，在 小鼠中的体内研究已显示，当致敏小鼠鼻内暴露于蛋白水解活性的Der pi时，循环中的总 IgE水平变得明显更高，与暴露于由E64不可逆地灭活的Der pi的小鼠相反。此外，肺炎症 对于暴露于蛋白水解活性的Der pi的小鼠显著更高。这些研究指出Der pi蛋白水解活性可能在引发变应性应答中起作用。先前出版物Wan 等人(The Journal of Clinical Investigation，1999 年 7 月，第 104 卷， Number 1，123-133)公开了 Der pi在经上皮递送中的作用的体外研究，并且发现Der pi引 起细胞间紧密连接的断裂，所述细胞间紧密连接是上皮细胞旁通透性屏障的主组分。特别 地，发现Der pi导致在汇合气道上皮细胞中紧密连接粘着蛋白质咬合的切割。紧密连接破 坏非特异性增加的上皮通透性，允许Der pi跨越上皮屏障并且到达树突状抗原呈递细胞。 推测Der pi的作用可能是哮喘发展中的第一步。Kauffman等人(Clinical and Molecular Allergy 2006,4 5)公开了与上述Wan 等人相同的发现。它进一步提及用gluthathione (谷胱甘肽)还原天然Der pi产生其最 活跃的还原形式。Takai 等人(Int Arch Allergy Immunol 2005 ；137 194-200)公开了制备正确折 叠的活性重组Der pi和Der fl的系统，及其蛋白水解活性研究，这指出在过敏症的发病机 理中具有重要性。它提及所制备的重组分子由还原剂例如DTT和L-半胱氨酸活化。提及 较早研究，其中推测天然Der pi的半胱氨酸蛋白酶活性可以由谷胱甘肽在体内活化。本发明的目的是提供改良的过敏症疫苗组合物。发明概述本发明的第一个方面涉及包括处于还原活性状态的半胱氨酸蛋白酶变应原用于 粘膜施用的过敏症疫苗组合物。本发明的第一个方面还涉及包括处于氧化无活性状态的半 胱氨酸蛋白酶变应原用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物。在第一个方面，本发明基于下述认识1)在半胱氨酸蛋白酶变应原作为用于粘膜 施用的变应原疫苗中的活性物质的用途中，半胱氨酸蛋白酶变应原是处于其还原活性还是 处于其氧化无活性状态的问题是重要问题，因为活性半胱氨酸蛋白酶在与粘膜施用结合中 具有增强的免疫活性并且因此增强的效力，和2)控制用于粘膜施用的变应原疫苗中半胱 氨酸蛋白酶的还原/氧化状态事实上是可能且有利的。因此，通过控制半胱氨酸蛋白酶的 还原/氧化状态，可以更精确地控制疫苗的免疫活性并且因此控制效力。在常规过敏症疫 苗中，半胱氨酸蛋白酶的还原/氧化状态不受控制，并且因此存在疫苗的还原/氧化状态和 因此效力可能改变的危险。特别地，本发明已提供了通过使用活性半胱氨酸蛋白酶制备具 有增强的免疫活性和效力用于粘膜施用的过敏症疫苗的可能性。需要时，可以使用无活性 半胱氨酸蛋白酶，这可能是某些应用例如对于非常有效的变应原希望的，或为了减少与粘 膜施用结合的副作用例如搔痒的危险。本发明的第一个方面进一步基于下述认识给过敏症疫苗组合物添加谷胱甘肽将导致疫苗的免疫活性和效力的增强，因为它将刺激氧化的无活性半胱氨酸蛋白酶转化成活 性的还原半胱氨酸蛋白酶，或确保还原的活性半胱氨酸蛋白酶不转化成氧化的无活性半胱 氨酸蛋白酶。因此，半胱氨酸蛋白酶分子在体内的氧化/还原状态由分子微环境的氧化/ 还原状态决定。因此，当疫苗施用于患者的粘膜时，半胱氨酸蛋白酶可能充分暴露于氧化微 环境，并且此类氧化微环境的作用可能通过谷胱甘肽的局部存在得到阻止或减少，所述谷 胱甘肽具有还原作用。另外，本发明的第一个方面基于下述实验发现谷胱甘肽S-转移酶对于谷胱甘肽 对半胱氨酸蛋白酶的还原活性具有出乎意料的强催化作用。此外，它基于下述认识如对于 谷胱甘肽的添加，参见上文，给过敏症疫苗组合物添加谷胱甘肽S-转移酶将导致疫苗的免 疫活性和效力的增强，因为它将刺激氧化的无活性半胱氨酸蛋白酶转化成活性的还原半胱 氨酸蛋白酶，或确保还原的活性半胱氨酸蛋白酶不转化成氧化的无活性半胱氨酸蛋白酶。本发明的第二个方面涉及用于在包括半胱氨酸蛋白酶用于粘膜施用的疫苗中使 用的佐剂系统。本发明的第二个方面进一步涉及根据包括本发明的抗原和佐剂系统用于粘 膜施用的抗原疫苗组合物。本发明的第二个方面基于下述认识半胱氨酸蛋白酶可以用作疫苗组合物中的佐 剂，因为如上所述的半胱氨酸蛋白酶被认为在借助于其蛋白水解活性引发免疫应答中起作 用。此外，本发明的这个方面基于半胱氨酸蛋白酶作为佐剂的用途可以通过包括单独或与 谷胱甘肽S-转移酶相组合的谷胱甘肽得到增强，以便最佳化处于其还原状态的半胱氨酸 蛋白酶的体内浓度。附图简述

图1 在半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64的存在或不存在下，在库1和2中经纯化的 nDer pi的蛋白水解活性。评估了 Der ρ提取物以及对照的活性。图2 通过GSH的nDer pi活化。该图显示通过增加浓度的GSH的nDer pi活化 的时间过程。图3:图2的特写。图4 通过GSH的nDer pi活化mDer pi活性的发展曲线的初速率针对用于活化 的GSH浓度进行标绘。图5 :nDer p8催化通过GSH的Der pi活化的能力。活性用0. ImM GSH和不同浓 度的nDer p8进行测试。图6 通过Der p8和GSH的Der pi活化。发展曲线的初速率针对nDer p8浓度 进行标绘。发明详述半胱氨酸蛋白酶半胱氨酸蛋白酶是蛋白酶，其中亲核基团是Cys残基的硫氢基。第一个明确识别 出的半胱氨酸蛋白酶是木瓜蛋白酶。已测定了木瓜蛋白酶和某些紧密相关的半胱氨酸蛋白 酶的晶体结构。类似木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶被称为木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。 认为木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶共享催化位点的Cys，His 二联体。木瓜蛋白酶样半胱 氨酸蛋白酶分类在CA异种集团和CC异种集团(病毒木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶)中， 其中CA异种集团包括家族C1、C2、C10、C12和C19，并且其中异种集团CC包括家族C6、C7、
6C8、C9、C16、C21、C23、C27、C28、C29、C31、C32、C33、C34、C35、C36、C41、C42 和 C43。特异的 木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶在例如所参考的由Alan J.Barrett等人，Academic Press、 1998编辑的Handbook ofProteolytic Enzymes中列出。本发明的疫苗组合物的半胱氨酸 蛋白酶是异种集团CA或异种集团CC的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶。前Der pi的三维结构与成熟Der pi的三维结构紧密对应。这个事实例如通过 各种半胱氨酸蛋白酶的前体形式和成熟形式结构的比较得到证明。2种同源半胱氨酸蛋白 酶caricain和组织蛋白酶K的晶体结构对于这些蛋白质的前体和成熟形式已得到测定。 在2种情况下，在前体形式内成熟区域的结构与成熟形式的那种基本上等同(Groves等人， Structure, 1996，第 4 卷，第 1193 页和 LaLonde 等人，Biochemistry，1999，第 38 卷，第 862 页)。半胱氨酸蛋白酶变应原根据本发明的半胱氨酸蛋白酶变应原是如本说明书其他地方定义的半胱氨酸蛋 白酶，它也是如本说明书其他地方定义的变应原。变应原可以是吸入性变应原，即空气传播 变应原，这可以与个体的气道系统的粘膜相接触。变应原也可以是食物变应原，这可以与个 体的消化系统的粘膜相接触。在本发明的一个具体实施方案中，半胱氨酸蛋白酶变应原选自Ale oU Aca si、 Blo tl、Der f1> Der pi、Der ml、Der si、Eur ml、Gly dl、Lep dl、Pso ol、Sui ml 禾口 Tyr Pl，特别是Der pi。在本发明的一个实施方案中，用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物包括处于还原活 性状态的半胱氨酸蛋白酶变应原。认为处于还原活性状态的半胱氨酸蛋白酶变应原在粘 膜施用中具有增强的免疫活性和效力，因为变应原的蛋白水解活性切割粘膜组织的紧密连 接，允许变应原跨越粘膜且接触树突状抗原呈递细胞。此类增强的免疫活性和效力将潜在 增强过敏症疫苗的疗效。疫苗的此类增强的疗效可以用于减少疫苗中的变应原剂量，并且 因此减少任何不希望有的副作用例如对于舌下疫苗的搔痒，或增加疫苗的疗效。 在本发明的一个具体实施方案中，70 %的半胱氨酸蛋白酶变应原、优选80 %、更优 选90 %、更优选95 %、更优选98 %处于还原活性状态。在本发明的另一个实施方案中，用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物包括处于氧化 无活性状态的半胱氨酸蛋白酶变应原。对于某些疫苗制剂、施用途径和变应原类型，优选使 用处于氧化无活性状态的半胱氨酸蛋白酶变应原，以缓和免疫活性和效力水平，目的在于 控制副作用水平。在本发明的一个具体实施方案中，70 %的半胱氨酸蛋白酶变应原、优选80 %、更优 选90 %、更优选95 %、更优选98 %处于氧化无活性状态。本发明的疫苗组合物的半胱氨酸蛋白酶可以通过任何常规方法获得，包括重组技 术和从生物材料中纯化。本发明的半胱氨酸蛋白酶变应原可以以变应原提取物、变应原提 取物的纯化馏分、经修饰的变应原、重组变应原或具有至少某些蛋白水解活性的重组变应 原的突变体的形式。变应原提取物可以天然包含相同变应原的一个或多个同种型，而重组 变应原一般仅代表变应原的一个同种型。突变型变应原可以是低I gE结合突变体，例如根 据WO 99/47680,WO 02/40676或W003/096869A2的低IgE结合变应原。在本发明的一个优 选实施方案中，变应原组合物是变应原提取物、变应原提取物的纯化馏分或重组变应原。
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本发明的疫苗组合物的还原半胱氨酸蛋白酶可以通过用任何合适的还原剂处理 半胱氨酸蛋白酶来获得，所述还原剂包括无机、有机和生物还原剂。优选使用药学上可接 受的还原剂，例如半胱氨酸、谷胱甘肽、谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶的组合、二硫苏糖醇 (DTT)、半胱胺、硫氧还蛋白、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、α -硫辛酸、2_巯基乙醇、2-巯基 乙磺酸、巯基-propionyglycine 或三(2-羧乙基)phophine (膦)(TCEP)。本发明的疫苗组合物的氧化半胱氨酸蛋白酶可以通过用任何合适的氧化剂处理 半胱氨酸蛋白酶来获得，所述氧化剂包括无机、有机和生物氧化剂。优选使用药学上可接受 的氧化剂，例如谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、胱氨酸或胱胺。谷胱甘肽(GSH)谷胱甘肽是三肽(C10H17N306S，CAS NO. 70-18-8)，它由L-半胱氨酸、L-谷氨酸 盐(酯)和甘氨酸形成。谷胱甘肽在许多动物中发现，其中它主要以还原形式存在。在健 康细胞和组织中，超过90%的总谷胱甘肽poll是还原形式(GSH)，并且小于10%以活性形 式(GSSG)存在。谷胱甘肽以100-500mM的细胞外浓度存在于人气道系统的肺液体中。还 原的谷胱甘肽充当抗氧化剂。大多数真核生物和某些细菌能够合成谷胱甘肽。在还原状态 中，半胱氨酸的硫醇基能够将电子(H+)贡献给其他不稳定的分子，例如活性氧种类。在贡 献电子中，谷胱甘肽其自身变得是反应型的，但容易与另一个反应型谷胱甘肽反应，以形成 谷胱甘肽二硫化物(GSSG)。GSH可以通过谷胱甘肽还原酶由GSSG再生。本发明的疫苗组合物的谷胱甘肽可以是谷胱甘肽或其对半胱氨酸蛋白酶具有相 同还原活性的衍生物。本发明的疫苗的谷胱甘肽可以通过可获得谷胱甘肽的任何常规方法进行制备，包 括化学合成、酶促合成和从生物材料中纯化。本发明的疫苗的谷胱甘肽处于与还原的半胱 氨酸蛋白酶相组合的还原形式(GSH)。当包括还原的半胱氨酸蛋白酶和还原的谷胱甘肽的 组合的疫苗组合物施用于个体时，疫苗组合物中还原的谷胱甘肽的包括将确保还原的半胱 氨酸蛋白酶周围的微环境中的还原的谷胱甘肽水平很高，并且因此还原的半胱氨酸蛋白酶 将以其还原状态逗留。在不存在谷胱甘肽的情况下，半胱氨酸蛋白酶的部分将遭受氧化环 境，并且因此转化成氧化的半胱氨酸蛋白酶。药学上可接警的还原剂尽管本发明在本说明书的其他地方就谷胱甘肽而言进行描述，但使用任何其他药 学上可接受的还原剂代替谷胱甘肽或除谷胱甘肽外还使用任何其他药学上可接受的还原 剂在本发明的范围内，所述药学上可接受的还原剂能够获得处于还原活性状态的半胱氨酸 蛋白酶或使半胱氨酸蛋白酶维持在其还原活性状态中。在本发明的一个优选实施方案中， 药学上可接受的还原剂选自半胱氨酸、谷胱甘肽、谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶的组合、 二硫苏糖醇(DTT)、半胱胺、硫氧还蛋白、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)、α-硫辛酸、2-巯基 乙醇、2-巯基乙磺酸、巯基-propionyglycine、三(2-羧乙基)phophine (膦)(TCEP)及其 组合。谷胱甘肽S-转移酶(GST)谷胱甘肽S-转移酶是包括细胞溶质、线粒体和微粒体蛋白质的长列表的酶家族， 其能够与大量内源和外来的substractes (底物)多重反应。谷胱甘肽S-转移酶催化还原 的谷胱甘肽(GSH)经由硫氢基与广泛多样底物上的亲电子中心的缀合。在这个过程中，GSH转变成氧化的谷胱甘肽(GSSG)。本发明的疫苗组合物的谷胱甘肽S-转移酶可以是任何已知的天然存在的谷胱甘 肽S-转移酶或其具有相同酶促活性的突变体。天然存在的谷胱甘肽S-转移酶可以源自包 含此类酶的任何生物学生物体。谷胱甘肽S-转移酶存在于大量生物学生物体中，包括一 般而言的哺乳动物、鱼类、昆虫、植物等。此类生物体的特别例子是房尘螨Dermaphagoides pteronyssinus (Der ρ)禾口人类。因此，本发明的疫苗组合物的谷胱甘肽S-转移酶可以通过任何常规方法获得，包 括重组技术和从生物材料中纯化。本发明的谷胱甘肽S-转移酶可以以提取物、提取物的纯 化馏分、经修饰的蛋白质、重组蛋白质或具有至少某些保留酶促活性水平的重组蛋白质的 突变体的形式。在本发明的一个优选实施方案中，谷胱甘肽S-转移酶以提取物、提取物的 纯化馏分或重组蛋白质的形式。谷胱甘肽S-转移酶的特别例子是来自Dermaphagoidespteronyssinus的谷胱 甘肽S-转移酶，Der ρ8。如同Der pl，它在来自Der ρ的粪便团块中发现。Der ρ8具有 25589Da的分子量，并且是219个氨基酸的蛋白质。因为特定水平的谷胱甘肽在人中发现，所以尽管疫苗组合物不包含任何谷胱甘 肽，但在疫苗组合物中包括谷胱甘肽转移酶将具有作用。同样地，因为特定水平的谷胱甘肽 S-转移酶在人中发现，所以尽管疫苗组合物不包含任何谷胱甘肽S-转移酶，但在疫苗组合 物中包括谷胱甘肽将具有作用。处千氧概■贼醉胱氡厕a ft当在本发明的疫苗组合物中使用的半胱氨酸蛋白酶处于氧化无活性形式时，疫苗 组合物可以进一步包括任何药学上可接受的氧化剂，其能够获得处于氧化无活性状态的半 胱氨酸蛋白酶或使半胱氨酸蛋白酶维持在其氧化无活性状态中。在本发明的一个优选实施 方案中，药学上可接受的氧化剂选自谷胱甘肽二硫化物(GSSG)、胱氨酸和胱胺。粘膜施用过敏症疫苗组合物施用于其的粘膜可以是任何合适的粘膜，并且施用包括经口 (经由消化系统的粘膜)、鼻、阴道、舌下、目艮睛、直肠、尿道、乳房内、肺、Otolar (即经由耳) 和颊部施用，优选颊部或舌下施用(口腔粘膜(oromucosal)施用)。过敏症疫苗组合物可 以以喷雾剂、气溶胶、混合物、悬浮液、分散系、乳剂、凝胶剂、糊剂、糖浆剂、乳膏、软膏、埋植 剂(耳、眼、皮肤、鼻、直肠和阴道)、乳房内制剂、vagitories、栓剂或uteritories的形式。已推测执行疫苗经由粘膜的粘膜施用是优选的，这实施对变应原的天然暴露。因 此，对于针对空气传播的粘膜抗原因子的变态反应，优选使用经由呼吸系统的施用，优选口 腔粘膜施用。在本发明的一个实施方案中，对受试者实施包括疫苗的每天施用的疫苗接种方 案。在本发明的另一个实施方案中，疫苗接种方案包括每第二天、每第三天或每第四天的疫 苗施用。例如，疫苗接种方案包括超过4周、优选超过8周、更优选超过12周、更优选超过 16周、更优选超过20周、更优选超过24周、更优选超过30周且最优选超过36周时间段的 疫苗施用。施用时期可以是连续时期。备选地，施用时期是由一个或多个非施用时期间断的 不连续时期。优选地，非施用(总)时期短于施用(总)时期。
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在本发明的一个进一步实施方案中，疫苗每天施用于患者一次。备选地，疫苗每天 施用于患者2次。疫苗可以是单剂量疫苗。口腔粘膜施用口腔粘膜施用可以使用任何可用的口腔粘膜施用制剂来执行，包括溶液、悬浮液、 快速分配剂型、滴剂和锭剂。在本发明的一个优选实施方案中，使用舌下免疫疗法(SLIT)，在这种情况下快速 分配剂型、滴剂和锭剂是优选制剂。快速分配剂型的例子是在US-A-5, 648，093、WO 00/51568、W002/13858、 W099/21579.W0 00/44351、US_A_4，371，516 和 EP-278877，以及以 ALK-AbelΙ Α/S 的代理名 提交的WO 2004/047794和W02004/075875中公开的那些。优选的快速分配剂型是通过冷
冻干燥产生的那些。优选的基质成形试剂是鱼明胶和变性淀粉。以水溶液或快速分配片剂形式的过敏症疫苗，参照WO 04/047794，特别合适于颊 部和舌下施用。其中疫苗组合物中的变应原剂量增加至特定最大值的常规递增剂量脱敏作用可 以在本发明中使用。疫苗组合物的单位剂量的优选效力是150-1000000SQ-U，更优选地效力 是 500-500000SQ-U，并且更优选地效力是 1000-250000SQ-U，更加优选 1500-125000SQ-U, 最优选 1500-75000SQ-U。在本发明的另一个实施方案中，疫苗组合物是反复的单剂量，优选在 1500-125000SQ-U 范围内，更优选 1500-75000SQ-U。与给定效力水平相对应的变应原的量强烈依赖于变应原种类而改变。在本发明 的一个进一步实施方案中，预期用于每天施用的单剂量中的主要变应原浓度是0. 05至 50 μ g,更优选0. 05至30 μ g,更优选0. 06至25 μ g,更优选0. 07至20 μ g,更优选0. 08至 15 μ g,更优选0. 09至10 μ g且最优选0. 1至7 μ g。在本发明的方法中使用的过敏症疫苗组合物可以是适合于施用于粘膜表面的任 何制剂的形式，包括喷雾剂、气溶胶、混合物、片剂(肠包衣和非肠包衣的)、胶囊(硬和软 的、肠包衣和非肠包衣的)、悬浮液、分散系、粒剂、粉剂、溶液、乳剂、咀嚼片、滴剂、凝胶剂、 糊剂、糖浆剂、乳膏、锭剂(粉剂、粒剂、片剂)、快速分配片剂、灌注液、气体、蒸汽、软膏、棒、 埋植剂(耳、眼、皮肤、鼻、直肠和阴道)、乳房内制剂、vagitories、栓剂或uteritories。应当理解本发明的疫苗可以进一步包括适合于此类类型制剂的另外佐剂和其他 赋形剂。此类另外的佐剂和赋形剂是本领域技术人员众所周知的，并且包括溶剂、乳化剂、 湿润剂、成形剂、染料、填充剂、防腐剂、粘度调整剂、缓冲剂、粘膜粘着物质等等。配制策略 的例子是本领域技术人员众所周知的。在本发明的一个优选实施方案中，谷胱甘肽S-转移酶以这样的量包括在疫苗组 合物中，使得谷胱甘肽S-转移酶与半胱氨酸蛋白酶的摩尔比是0. 001至1000、优选0. 01至 100、更优选0. 02至50、更优选0. 05至20、更优选0. 1至10且最优选0. 2至5。在本发明的一个优选实施方案中，谷胱甘肽以这样的量包括在疫苗组合物中，使 得谷胱甘肽与谷胱甘肽S-转移酶的摩尔比是0. 1至100000、优选1至10000、更优选2至 5000、更优选5至2000、更优选10至1000且最优选20至500。佐剂
过敏症疫苗组合物可以包括佐剂，这可以是任何常规佐剂，包括含氧金属盐、不 耐热肠毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、霍乱毒素B亚单位(CTB)、聚合脂质体、突变型毒素例如 LTK63 和 LTR72、微胶囊、白介素(例如 IL-I β、IL-2、IL-7、IL-12、INF γ )、GM-CSF, MDF 衍
生物、CpG 寡核苷酸、LPS、MPL、phosphophazenes (磷腈)、Adju- Ph0S 、葡聚糖、抗原制 剂、脂质体、DDE、DHEA、DMPC、DMPG、D0C/铝复合物、弗氏不完全佐剂、ISC0Ms 、LT经口佐 剂、胞壁酰二肽、单磷酰脂质A、胞壁酰三肽和phospatidylethanolamind磷脂酰乙醇胺)。含氧金属盐可以是提供所需效应的任何含氧金属盐。在一个优选实施方案中，含 氧金属盐的阳离子选自 Al、K、Ca、Mg、Zn、Ba、Na、Li、B、Be、Fe、Si、Co、Cu、Ni、Ag、Au 和 Cr。在一个优选实施方案中，含氧金属盐的阴离子选自硫酸盐、羟化物、磷酸盐、硝酸盐、碘 酸盐、溴酸盐、碳酸盐、水合物、乙酸盐、柠檬酸盐、草酸盐和酒石酸盐及其混合形式。例子是 氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝、硫酸铝钾、磷酸钙、Maalox (氢氧化铝和氢氧化镁的混合物)、氢 氧化铍、氢氧化锌、碳酸锌、氯化锌和硫酸钡。疫苗佐剂系统本发明进一步涉及用于在包括半胱氨酸蛋白酶用于粘膜施用的疫苗中使用的佐 剂系统。在根据本发明的佐剂系统的一个实施方案中，半胱氨酸蛋白酶处于还原活性状 态。在本发明的一个具体实施方案中，佐剂系统进一步包括还原的谷胱甘肽。在本发明的 一个进一步具体实施方案中，佐剂系统进一步包括谷胱甘肽S-转移酶。特别地，谷胱甘肽 S-转移酶是Der p8。在本发明的第二个实施方案中，半胱氨酸蛋白酶处于氧化无活性状态。本发明的佐剂系统的半胱氨酸蛋白酶可以是如本发明其他地方定义且描述的任 何半胱氨酸蛋白酶。在本发明的一个特别实施方案中，半胱氨酸蛋白酶选自Aca si、Blo tUDer fl、Der pi、Eur ml、Gly dl、L印 dl、Pso ο 1 禾口 Tye pi。特别地，半胱氨酸蛋白酶 变应原是Der pi。抗原疫苗组合物本发明进一步涉及包括根据本发明的抗原和佐剂系统用于粘膜施用的抗原疫苗 组合物。本发明的抗原疫苗组合物适合于针对由组合物的抗原引起的任何疾病的疫苗接 种。^M变应原在本发明的一个实施方案中，抗原疫苗组合物的抗原是变应原。在本发明的一个实施方案中，变应原是变应原，其与受试者的粘膜相接触，包括呼 吸系统的粘膜、消化系统的粘膜、直肠粘膜和生殖器粘膜。根据本发明的变应原可以是任何天然存在的蛋白质，其已被报道在其反复暴露于 个体后诱导变应性、即IgE介导的反应。天然存在的变应原的例子包括花粉变应原(乔木、 草本植物、杂草和草花粉变应原)、昆虫变应原(吸入剂、唾液和毒液变应原，例如螨变应 原、蟑螂和蠓变应原、hymenopthera(膜翅目)毒液变应原)、动物毛发和头皮屑变应原(来 自例如犬、猫、马、大鼠、小鼠等)和食物变应原。来自乔木、草和草本植物的重要花粉变应 原是源自山毛榉目(Fagales)、木犀目(Oleales)、松目(Pinales)和悬铃木科的分类学目的那些，包括桦树(桦木属(Betula)、桤木(桤木属(Alnus))、榛(榛属(Corylus))、角树 (鹅耳枥(Carpinus))和橄榄(木犀榄属(Olea))、雪松(柳杉属(Cryptomeria)和刺柏属 (Juniperus))、悬铃树(悬铃木属(Platanus))，禾本目(Poales)包括黑麦草属(Lolium)、 梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、狗牙根属(Cynodon)、鸭茅属(Dactylis)、绒毛草属 (Holcus)、薦草属(Phalaris)、黑麦属(Secale)和高粱属(Sorghum)，菊目(Asterales)和 荨麻目(Urticales)包括豚草属(Ambrosia)、蒿属(Artemisia)和墙草属(Parietaria) 的草本植物。其他重要的吸入性变应原是来自表皮螨属(Dermatophagoides)和嗜 霉螨属(Euroglyphus)的房尘螨，储藏螨例如L印idoglyphys (害嗜鳞螨)、食甜螨 属(Glycyphagus)和食酪螨属(Tyrophagus)，来自蟑螂、蠓和蚤的那些，例如小蠊属 (Blatella) > ^ftM (Periplaneta)(Chironomus)禾口 CtenocepphaIides (木节 +δ
属)，以及来自哺乳动物例如猫、犬和马的那些，毒液变应原包括源自蛰刺或叮咬昆虫的那 些，例如来自膜翅目(Hymenoptera)的分类学目的那些，包括蜜蜂(总科蜜蜂科(Apidae))、 黄蜂(总科Vespidea(胡蜂科))和蚂蚁(总科Formicoidae (蚁科))。来自真菌的重要吸 入性变应原是源自链格孢属(Alternaria)和枝孢属(Cladosporium)的那些。在本发明的一个具体实施方案中，变应原是Bet vl、Aln gl、Cor al和Car bl、 Que al>Cry j1>Cry j2>Cup al>Cup s1>Jun al>Jun a2>jun a3>01e el>Lig vl>Pla 11、 Plaa2、Amb al、Amb a2、Amb t5、Art vUArt v2 Par j 1 >Par j2、Par j3、Sal kUAve el、 Cyn dU Cyn d7、Dac gl、Fes pi、Hol 11、Lol pi 禾口 5、Pha al、Pas nl、Phl ρ、Phl p5、 Phl p6> Poa pi、Poa p5> Sec cl> Sec c5> Sor hi、Der f1> Der f2> Der pi、Der p2>> Der p7、Der ml>Eur m2>Gly dl、Lep d2、Blo tl>Tyr p2、Bla gl、Bla g2、Per al、Fel dl>Can f1> Can f2> Bos d2、Equ cl、Equ c2、Equ c3、Mus ml、Rat nl、Apis ml、Api m2> Ves vl、 Ves v2>Ves v5、Dol ml、Dil m2、Dol m5、Pol aUPol a2>Pol a5>Sol iUSol i2>Sol i3 和 Sol i4、Alt al, ClahU Asp f U Bos d4、Mal dl、Gly ml、Gly m2、Gly m3、Ara hi、Ara h2、Ara h3、Ara h4、Ara h5或来自这些中的任何的分子育种的shufflant杂种。在本发明的一个优选实施方案中，变应原是草花粉变应原或尘螨变应原或豚草变 应原或雪松花粉或猫变应原或桦树变应原。在本发明的另外一个实施方案中，变应原是源自相同变应原来源或源自不同变应 原来源的至少2个不同类型的变应原的组合，例如分别来自不同螨和草物种的草组1和草 组5变应原或螨组1和组2变应原，杂草抗原如短和巨豚草变应原，不同真菌变应原如链格 孢属和枝孢属、乔木变应原如桦树、榛、角树、橡树和桤木变应原，食物变应原如花生、大豆 和乳变应原。掺入本发明的抗原疫苗组合物内的变应原可以以提取物、经纯化的变应原、经修 饰的变应原、重组变应原或重组变应原的突变体的形式。变应原提取物可以天然包含相同 变应原的一个或多个同种型，而重组变应原一般仅代表变应原的一个同种型。在一个优选 实施方案中，变应原以提取物的形式。在另一个优选实施方案中，变应原是重组变应原。在 一个进一步优选的实施方案中，变应原是天然存在的IgE结合突变体或重组低IgE结合突 变体。变应原可以以等摩尔量存在，或存在的变应原比可以改变，优选高达1 20。感染
在本发明的第二个实施方案中，抗原疫苗组合物的抗原是微生物抗原。微生物抗原可以是这样的抗原，其与受试者的粘膜相接触，包括呼吸系统的粘膜、 消化系统的粘膜、直肠粘膜和生殖器粘膜。在一个具体实施方案中，微生物抗原是病毒、细菌、真菌、寄生虫或其任何部分。微生物抗原的例子是弧菌属(Vibrio)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、博 德特菌属(Bordetella)物种、嗜血菌属(Haemophilus)物种、鼠弓形虫(Toxoplasmosis gondii)、巨细胞病毒、衣原体属(Chlamydia)物种、链球菌属(Sti^ptococcal)物种、诺 瓦克病毒、大肠埃希杆菌(Escherischia coli)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、猫 胃螺杆菌(Helicobacter felis)、轮状病毒属(Rotavirus)、Neisseria gonorrhae (淋 病奈瑟球菌)、Neisseria meningiditis (脑膜炎奈瑟球菌)、腺病毒、EB病毒、日本脑炎 病毒、Pneumocystis carini (卡氏肺囊虫)、单纯疱疹、梭状芽孢杆菌属(Clostridia) 物种、呼吸道合胞病毒、Klebsiella(克雷伯氏菌属)物种、志贺氏菌属(Shigella)物 禾中、tM M fi Hfi (Pseudomonas aeruginosa)、_/]、__ M (Parvovirus)、胃曲木干胃 属(Campylobacter)物种、立克次氏体属(Rickettsia)物种、水痘带状疱疹、耶尔森氏 菌(Yersinia)物种、罗斯河病毒、J. C.病毒、马红球菌(Rhodococcus equi)、粘膜炎莫 拉菌(Moraxellacatarrhalis)、■{白氏疏电累旋体(Borrelia burgdorferi)、溶血巴斯德菌 (Pasteurella haemolytica)、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和 肠炎沙门氏菌亚属伤寒血清变型(Salmonella enterica serovar Typhi) 微生物抗原的进一步例子是阻止或减少下述疾病的症状的那些流感，肺结核，结 核性脑膜炎，肝炎，百日咳，脊髓灰质炎，破伤风，白喉，疟疾，霍舌L疱疹，伤寒，HIV，AIDS，麻 疹，莱姆病，旅行者腹泻，甲型、乙型和丙型肝炎，中耳炎，登革热，狂犬病，副流感，风疹，黄 热病，痢疾，军团菌病，弓形体病，Q型热，出血热，阿根廷出血热，骨疽，美洲锥虫病，由大肠 杆菌(E. coli)引起的尿道感染，Pneumoccoccal (肺炎球菌)病，腮腺炎和Chikungunya。定义与本发明结合使用下述术语和表达表述“异种集团CA或异种集团CC的木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶”意指在由Alan J. Barrett 等人，Academic Press、1998 编辑的 Handbook of Proteolytic Enzymes 中作为 属于异种集团CA和CC定义且列出的蛋白酶，以及属于CA和CC异种集团的目前未知的蛋 白酶。术语“变应原”意指能够引发如下定义的过敏症的任何化合物。术语“过敏症”意指由免疫机制介导的针对环境变应原的任何类型的超敏反应，包 括I-IV型超敏反应，包括变应性鼻炎、哮喘和特应性皮炎。术语“过敏症疫苗组合物”意指用于治疗或预防过敏症的疫苗组合物。术语“治疗”意指部分或完全治愈或减轻症状，或抑制症状的原因。术语“预防”意指任何类型的预防处理，包括部分或完全预防或抑制症状的发展或 症状的原因的发展。术语“ 口腔粘膜施用，，指其中剂型放置在舌下或口腔中的其他任何地方(颊部施 用)的施用途径，以允许活性成分与患者口腔或喉的粘膜相接触，以便获得活性成分的局 部或全身效应。口腔粘膜施用途径的例子是舌下施用。
术语“舌下施用”指其中剂型放置在舌下以便获得活性成分的局部或全身效应的 施用途径。术语“SQ-u”意指SQ-单位SQ_单位依照ALK-AbelΙ Α/S' s "SQ生物效力”-标 准化方法进行测定，其中100，000SQ单位等于标准皮下维持剂量。通常Img提取物包含 100, 000-1，000，000SQ-单位，依赖于它们源自于其的变应原来源和所使用的制造过程。精 确的变应原量可以借助于免疫测定法即主要变应原总含量和变应原总活性进行测定。
实施例材料与方法nDer pi 的纯化nDer pi的纯化在2个连续亲和色谱法步骤中完成。使534mg 屋尘螨 (D. pteronyssinus)溶解于约9. 5ml结合缓冲液(PBS、pH 7. 2)中，并且通过0. 45 μ m截止 滤器(Mi 1 lex -HV, MILLIP0RE)过滤，以去除不可溶化合物。使用包含具有针对Der pi的单克隆抗体(4C1、IndoorBiotechnologies)的琼脂 糖的7ml柱。使柱与人1^4 1^1^仏111吐吐膽 11虹111￡1(^￡1生物技术产品)相连接。在将样品 装载到环内且将其注射到柱内之前，使柱在结合缓冲液中平衡。在施加整个样品后，用3柱体积结合缓冲液充分洗涤柱。随后通过将线性NaCl/ 甘氨酸梯度施加到洗脱缓冲液(0. IM甘氨酸pH ll、0.5NaCl)使蛋白质洗脱5分钟，这引起 Der pi从抗体中释放。将洗脱物收集到Iml馏分中。为了中和碱性洗脱物，将200μ IlM NaAcetat (pH 5.0)加入所有收集管。蛋白质洗脱随后为监控洗脱馏分在280nm(A280)处的吸收。随后 合并包含洗脱峰的馏分。随后，使用5kDa截止旋转滤器(MILLIPORE，AmicOIl Ultra， Centrifugal Filter Devices)使包含 Der pi 的库浓缩至 2ml。先前研究已显示丝氨酸蛋白酶Der p3与Der pi—起从4C1-琼脂糖柱中共 洗脱。因此，对包含洗脱峰的样品实施在包含SBTI (大豆胰蛋白酶抑制剂-琼脂糖、 SIGMA-ALDRICH)的琼脂糖柱上的新亲和色谱。SBTI是丝氨酸蛋白酶的抑制剂。用于这的缓冲液与用于4C1-琼脂糖柱的相同。预期Der pi在流出物中，因为该 柱仅结合Der p3。通过测量A280鉴定包含非结合蛋白质的馏分且合并。在色谱法过程中，柱和所有缓冲液一直维持在4°C。nDer p8 的纯化nDer p8的纯化在一个亲和色谱法步骤中完成，使用GSTrap HPUml Hi Trap亲和 柱(Amersham Biosciences)。遵循制造商的指导。使来自屋尘螨(D. pteronyssinus)的486mg提取物溶解于9. 6ml结合缓冲液 (PBS，pH 7.2)中，并且经过 0.45 μ m 截止滤器(Mi 1 lex _HV，MILLIP0RE)。柱保留 nDer p8，这随后洗脱(洗脱缓冲液50mMTris-HCl、10mM还原的谷胱甘肽，pH 8.0)。蛋白质洗脱 之后为测量馏分的A280，并且合并包含洗脱峰的那些。通过透析(参见下文的进一步操作)去除GSH，并且将样品分成等分试样且维持 在-20 0C οUV/VIS吸收光谱
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在蛋白质nDer pi和Der p8的纯化过程中反复测量在280nm处的吸光度，以便鉴 定哪个馏分包含蛋白质。记录经纯化的nDer pi或nDer p8的最终制剂在220nm和350nm 之间的UV/VIS吸收光谱，以便计算蛋白质浓度，使用朗伯_比尔(Lambert-Beers)定律。测量用PerkinElmer 仪器(型号Lambda 800UV/VISSpectrometer)来完成，并 且所使用的比色皿具有Icm的径长(Hel 1 ma 、石英杯比色皿)。在读数前，使分光光度计针对空白样品调零。当测量nDer pi的吸光度时，洗脱缓 冲液用作参考。对于nDer p8，参考是不包含蛋白质的洗脱馏分之一。在每次读数之间，用 2% Helmax (helmanex)溶液和milliQ水充分清洗比色皿，并且用高气压进行干燥。nDer p8 的诱析为了研究Der pi的活性是否依赖于GSH，并且nDer p8是否能够催化该过程，从 nDer p8 库中去除 GSH。这通过应用透析盒(Slide-A-Lyser Dialysis 10K, PIERCE 产 品)来完成。通过将盒放置在浮筒中并且随后将其放置在milliQ水中30秒而使膜水合。随 后通过注射器来注射Der p8制剂，去除过量空气。然后，将盒放置在1升透析缓冲液(PBS、 PH 7.2)中，并且放置在磁力搅拌上用于循环。在21/2小时后，将盒放置到另一升透析缓 冲液中。另一个21/2小时后，从盒中去除制剂，并且测量UV/VIS吸收且计算Der p8浓度。 随后将Der p8库分成等分试样且维持在-20°C。SDS-PAGE使13 μ 1目的样品与5μ 1样品缓冲液χ 4 (NllP AGE , Invitrogen)相混合。依 赖于SDS-PAGE应在还原还是应在非还原条件下进行，通过应用2μ 1还原剂(NuPAGE ， Invitrogen)相应制备样品。在非还原条件下，还原剂由2 μ 1 milliQ水替代。随后使 样品在70°C下加热10分钟并且随后旋转10秒。使40ml运行缓冲液χ 20 (NuPAGE , Invitrogen) % 800 μ 1 milliQ水相混合，以制备电泳缓冲液。将凝胶(NuPAGE 10% Bis-Tris 凝胶，Invitrogen)放置到 XCell Surelock 电泳槽(Invitrogen)中，并且将 600ml电泳缓冲液插入外室内。将0.5ml抗氧化剂(NuPAGE ，Invitrogen)加入其余 200ml电泳缓冲液中，并且将这个溶液倾入内室内。Mf 分子量标记(SeeBlue Plus 2 Pre—Stained Standard, InVitrogen)禾口 15 μ 1 每种样品装载到凝胶内后，在200V的恒压下使电泳运行40分钟。SDS-PAGE 凝胶染饩在电泳后，根据下述方案用银染色法使凝胶染色固定溶液30分钟；温育溶液 (50ml温育缓冲液+260 μ 1 25% glutaraldehyd (戊二醛)30分钟；在milliQ水中洗涤 3X10分钟；银溶液(50ml银溶液+10 μ 1 37%甲醛)40分钟；在milliQ水中洗涤小于 1分钟；显色溶液(50ml显色溶液+5 μ 1 37%甲醛)直至条带变得可见；用停止溶液来停 止反应10分钟；在milliQ水中洗涤；2X 5分钟；贮藏在贮藏缓冲液中。固定溶液40%乙醇，10%乙酸温育缓冲液30%乙醇，0，83M乙酸钠，8mM硫代磷酸钠银溶液5.9mM硝酸银显色溶液0. 24M碳酸钠停止溶液39mM EDTA
蛋白质印迹.为了验证在SDS-PAGE中施加的样品中的蛋白质特性，对凝胶实施蛋白质印迹。通 过蛋白质印迹将通过电泳在凝胶中分开的蛋白质转移至PVDF膜。整个过程在室温下执行。4个印迹垫(Blotting Pads)首先在milliQ水中洗涤，并且随后浸泡在转移 缓冲液(转移缓冲液(20x) (NuPAGE )、96%乙醇(Spiritus Fortis DLS)、抗氧化剂 (NuPAGE )和milli-Q/JO中。将空气压出印迹垫，并且将2个放置在XCell II Blot Module中。在其施加在XCell上之前，将滤纸也浸泡在转移缓冲液中。将来自电泳的凝胶放 置在滤纸顶上。使PVDF膜(Invitrogen)在乙醇中浸泡30秒，随后在mi 11 iQ水中漂洗，并且 在平放到转移缓冲液中数分钟后最后放置在凝胶上。将另一片湿滤纸放置在膜的顶上，并 且随后加入2个另外的印迹垫。使器械装配且放置在XCell Surelock电泳槽(Invitrogen) 中。使内室充满转移缓冲液，并且使外室充满milliQ水。印迹在30V下进行1小时。根据下述免疫印迹操作，膜随后进行处理且染色以揭示Der pi的存在封闭(洗 涤缓冲液+2% Tween):不超过2分钟；用洗涤缓冲液洗涤5分钟；一抗(兔α -Der pi, ALK-Abell ) =I1/2小时；用洗涤缓冲液洗涤3Χ5分钟；二抗(猪α -兔，Dako) :1小时；用 洗涤缓冲液洗涤3X5分钟；显现(使1片BCIP/NBT (Sigma)溶解于IOml milliQ水中) 直至条带变得可见；用miliQ水停止反应；膜在滤纸上干燥。洗涤缓冲液50mM Tris、150mM氯化钠蛋白水解活性的测定法使用与荧光基团AMC连接的肽底物Z-LLE评估nDer pi的酶促活性。当与肽连接 时，AMC猝灭，并且仅显示极少荧光。当加入Der pi时，它切割AMC和肽序列之间的键，并 且荧光大量增加。因此，就荧光中的增加而言评估产物形成。所有活性测定法在SpectraMax仪器(GeminiXS MolecularDevises)上在37°C下 进行。使用350nm的激发波长(λ ex)和450nm的发射波长(λ em)测量荧光。Spectra Max 仪器设定为在第一次阅读前和阅读之间自动混合。酶促活性以RFU相对荧光单位进行测 量。使用软件SoftMax PR0 4. 3LS，根据发展曲线的最大斜率评估反应的初速度(VO)。测定缓冲液(50mMTris (Sigma)、5mM EDTA (Fluka))的母液和 IM DTT (Merck)制 备一次且分别维持在+5°C和-20°C。DTT以55 μ 1等分试样维持，并且需要时，紧在使用前 将DTT加入测定缓冲液中。对于微量滴定板(Corning，96孔非结合黑色聚苯乙烯板)中的每个孔施加的总体 积总计为200 μ 1。反应总是通过添加在测定缓冲液中稀释的50 μ 1 0. ImM或ImM底物起 始，并且荧光连续测量20-90分钟。使用在半胱氨酸蛋白酶特异性抑制剂Ε64的存在或不存在下的酶促测定法，以便 验证经纯化的蛋白质作为半胱氨酸蛋白酶的特性。使一个等分试样的nDer pi在37°C与 溶解于测定缓冲液中的25 μ M Ε64预温育1小时，而另一个等分试样则不是。然后加入以 0. ImM浓度的底物。荧光测量20分钟。测定法中的nDer pi浓度是2，6 μ M。测试谷胱甘肽(GSH)是否能够活化nDer pl，并且活化是否是剂量依赖性的。在 0. 5mM、l. OmM,5. OmMUO. OmM 和 25. OmM 的不同 GSH 浓度的存在下测定 1，3 μ MnDer pl 的活 性。作为对照，还在5mM DTT的存在下测量活性。荧光测量90分钟。评估nDer p8作为谷胱甘肽S-转移酶是否能够催化nDer pl通过GSH的活化。在
16这个测定法中，nDer pi维持在1，3 μ M，并且GSH浓度维持在100 μ Μ(在气道中的生理学浓 度)。nDer p8以4个不同浓度加入0，4 μ M、0，6 μ M、0，8 μ M和1，2 μ M。加入孔中的最后 2个组分是GSH紧接着是底物。反应在90分钟过程中进行监视。结果nDer pi 纯化nDer pi在2个亲和色谱法步骤中进行纯化。在第一个中，使用4C1-琼脂糖柱。 收集且浓缩洗脱峰中的馏分。在浓缩后，对制剂实施在SBTI-琼脂糖柱上的第二次色谱法。 nDer pi流出柱而不结合并且在2个峰中出现。将来自每个峰的馏分集合在2个分开库—— 库1和库2中。在SDS-PAGE后分别通过银染色法或蛋白质印迹评估经纯化的蛋白质的纯度和特 性，其中使用多克隆单特异性Der pi抗体。2个库都包含在 25kDa处的主要条带，这通过抗体识别为Der pi。抗体还识别 较低分子量的一些条带，这可能是Der pi的降解片段。在SDS-PAGE上在约10_16kDa之间 的污点不由抗体识别，并且可能由污染物或起因于nDer pi降解的小片段引起。约55kDa 的高分子量条带由抗体识别，并且可能代表某些Der pi 二聚体。Der pi的酶促活性在2个库中在半胱氨酸蛋白酶抑制剂E 64的存在以及不存在 下进行评估，用DTT作为还原剂。第一个库显示明确活性，而第二个库未显示任何显著活 性。结果在图1中描绘。因为Z-LLE-AMC是关于半胱氨酸蛋白酶的特异性底物(WiIlenbrock H和 Sierakowska A，2002，Masther Thesis)，并且因为该活性被半胱氨酸蛋白酶抑制剂E64完 全抑制，并且Der pi是据报告存在于屋尘螨(D. pteronyssinus)粪便颗粒中的唯一半胱氨 酸蛋白酶，所以这些数据证实经纯化的蛋白质是Der pi。测量2个库的UV/VIS吸收谱，并且根据在280nm处的吸收计算浓度，其中使用朗 伯_比尔定律，用Icm的光径长和1. 73的摩尔消光系数。浓度对于库1是0. 259mg/ml，并 且对于库2是0. 0943mg/ml。nDer p8 的纯化nDer p8在GSTrap HP, Hi Trap亲和柱上进行纯化。与洗脱峰相对应的馏分的 SDS-PAGE凝胶分析显示具有约25kDa分子量的唯一一个条带。在纯化后，预期蛋白质制剂具有与洗脱缓冲液相同的GSH浓度；这是IOmM GSH。为 了测试GSH是否能够以在肺的气道中发现的相同浓度活化Der pl，并且Der p8是否能够催 化这个反应，从nDer p8制剂中去除GSH是重要的。这通过透析来完成。然后，使用在280nm 处的消光系数伍°’1%) 1.576(1^/1111)-1011-1，通过而八13吸收光谱法计算110吐p8浓度。最 终 nDer p8 浓度是 0. 121mg/ml。通过GSH的nDer pi活化图2和3显示nDer pi可以通过GSH活化，并且活化实际上是剂量依赖性的。因 此，更大的GSH浓度导致更高的活性，并且像这样当不存在GSH时，没有活性。看起来好像通 过GSH的活化比通过DTT的活化慢。事实上，通过在气道中生理学浓度的GSH(0，1-0. 5mM) 的活化具有约30分钟的滞后时间(检测酶活性所需的时间)。用5. OmMGSH的浓度，活性 在约8分钟后进展，而使用10. OmM GSH,活性在6分钟后加强。在最高的GSG浓度(这是25. OmM)下，活性在仅3分钟后显著增加。图4显示在活性的初速率和GSH浓度之间存在近似线性相关。用Der p8的酶促活件测定已知nDer pi可以通过GSH活化，测试nDer p8作为谷胱甘肽S-转移酶是否能够 催化该过程是恰当的。人类气道上皮衬里液中的GSH生理学水平是100 μ Μ-500 μ Μ。nDer p8的效应在 最低水平ΙΟΟμΜ下进行测试。图5显示来自活性测定的结果。Der pi单独不具有活性。即使存在底物，在Der pi通过还原剂例如GSH活化前， 它也不能被切割。当Der pi通过0. ImM GSH活化时，该活性很低并且它在约30分钟的长 滞后时间后开始。在DerpS的存在下，活性较高并且滞后时间更短。这2种效应都是剂量 依赖性的。反应速率在测定的最终进行测量。图6显示速率在更高的nDerpS浓度下如何 显著增加。结果讨论通过亲和色谱法纯化来自屋尘螨(D. pteronyssinus)的2种变应原nDer pi和 nDer p8。在第一个纯化步骤后，将nDer pi施加于SBTI柱，以去除污染丝氨酸蛋白酶(Der p3)，产生包含nDer pi的2个库，如通过蛋白质印迹验证的。因此，纯化产生分别具有 0. 259mg/ml 禾口 0. 094mg/ml 的 nDer pi 浓度的 2 个库。因为SBTI柱将仅结合Der p3，所以Der pi应运行通过。因此，预期在一个峰中回 收nDer pi。Der pi为何在2个峰中从SBTI琼脂糖柱中洗脱可能存在不同原因。该柱人工 填充，因此存在在填充柱的过程中产生某些误差的可能性。如果柱是异质的，那么nDer pi 分子可能具有通过柱中的更密集区域的困难，并且因此，它们将以不同速率洗脱。另一个可 能的解释是2个不同类型的nDer pi分子的存在，其中之一不知何故能够与柱相互作用，导 致其洗脱中的延迟。除验证经纯化的主要蛋白质是nDer pi外，蛋白质印迹还显示nDer pi的某些降 解片段，以及低分子量的其他次要蛋白质。这些是污染物，意指不由所使用的多克隆抗-Der Pl抗体识别。因为Der pi是蛋白酶，所以可能它已通过自溶切割其自身，因此，导致具有 16-24kDa分子量的条带。即使Der pi—直保持冷却，也可能发生某种程度的自溶。第一种酶促活性测定法显示在nDer pi库1中存在活性，并且它被E64完全抑制。 nDer pi库中的杂质因此不引起对nDer pi活性的任何不希望有的贡献。库2未显示任何 活性。可能低nDer pi浓度不允许活性的任何检测，或可能库2包含变性nDer pi。后面这 种可能性也可以证明为何这种nDer pi在与活性nDer pi不同的峰中从SBTI琼脂糖柱中 洗脱。纯化nDer p8，并且这种纯化的SDS-PAGE随后为银染色法显示具有正确分子 量-约25kDa的唯一一个条带。因为经纯化的蛋白质显示所预期的谷胱甘肽S-转移酶活 性，所以蛋白质非常可能事实上是nDer p8。GSH能够活化nDer pl，并且nDer pi的活性与GSH浓度的增加相关地增加GSH浓 度越高，nDer pl活性越高，并且产生nDer pl活化的滞后时间越短。已知蛋白质通过GSH的还原是缓慢且无效率的，并且在其中这种还原发生的代谢过程中，该反应由谷胱甘肽S-转移酶催化。因为Der p8被描述为谷胱甘肽S-转移酶，所 以检查nDer p8是否能够催化通过GSH的nDer pi活化，使得它更有效。因为GSH在人肺 气道中的生理学水平是100μΜ-500μΜ，所以决定检查nDer p8对通过0. lmM(100 μ M)的 GSH浓度的nDer pi活化的作用。这个测定法证明Derp8增强通过GSH的nDer pi活化。 在所使用的最低nDer p8浓度(0，4 μ M)下，它经过30分钟直至活性使其自身与不含nDer P8的测试区分开。用1.2μΜ Der ρ8，活性在约8分钟后增加并且在整个测量期间自始至 终保持增加，这延长至90分钟。图6显示nDe r pi活化的水平和速率在更高的Der p8浓 度下增加。换言之，nDer p8对nDer pi的GSH活化的作用是剂量依赖性的。
总之，呈现的实验明确举例说明nDer pi可以通过在生理学水平下的GSH活化，并 且活性水平和滞后时间是剂量依赖性的。此外，结果已显示由于其谷胱甘肽S-转移酶活 性，在屋尘螨(D.pteronyssinus)粪便团块中与nDer pi—起旅行的nDer p8能够催化该 过程。这种催化是剂量依赖性的。此外，呈现的实验已显示可以在体外制备还原活性Der pl，并且将包含还原活性Der pi的疫苗组合物在体内施用于粘膜表面，同时使Der pi维持 在其还原活性状态中。此外，呈现的实验已显示在疫苗组合物中包括GSH和谷胱甘肽S-转 移酶将帮助在施用后使Der pi维持在其还原活性状态中。
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权利要求
用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物，其包括处于还原活性状态的半胱氨酸蛋白酶变应原。
2.根据权利要求1的组合物，其中70%的所述半胱氨酸蛋白酶变应原、优选80%、更优 选90 %、更优选95 %、更优选98 %处于还原活性状态。
3.根据权利要求1或2的组合物，其进一步包括药学上可接受的还原剂。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述药学上可接受的还原剂选自半胱氨酸、谷胱甘 肽、谷胱甘肽和谷胱甘肽S-转移酶的组合、二硫苏糖醇(DTT)、半胱胺、硫氧还蛋白、N-乙 酰-L-半胱氨酸(NAC)、α -硫辛酸、2-巯基乙醇、2_巯基乙磺酸、巯基-propionyglycine 或三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
5.根据权利要求4的组合物，其中所述药学上可接受的还原剂是还原的谷胱甘肽 (GSH)。
6.根据权利要求1-5中任一项的组合物，其进一步包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)。
7.根据权利要求6的组合物，其中所述谷胱甘肽S-转移酶是DerpS。
8.用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物，其包括处于氧化无活性状态的半胱氨酸蛋白酶 变应原。
9.根据权利要求8的组合物，其中70%的所述半胱氨酸蛋白酶变应原、优选80%、更优 选90 %、更优选95 %、更优选98 %处于氧化无活性状态。
10.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶变应原选自Ale ol、Aca sl、Blo tl、Der fl、Der pi>Der ml>Der sl、Eur ml、Gly dl、Lep dl、Pso ol、Sui ml 和 Tyr pi，特别是 Der pi。
11.根据权利要求10的组合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶变应原是Derpi。
12.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中所述粘膜施用选自经口(经由消化系 统的粘膜)、鼻、阴道、舌下、目艮睛、直肠、尿道、乳房内、肺、Otolar (即经由耳)和颊部施用。
13.根据权利要求12的组合物，其中所述粘膜施用选自舌下和颊部施用。
14.根据前述权利要求中任一项的组合物，其包括佐剂。
15.佐剂系统，其用于在包括半胱氨酸蛋白酶的用于粘膜施用的疫苗中使用。
16.根据权利要求15的佐剂系统，其中所述半胱氨酸蛋白酶处于还原活性状态。
17.根据权利要求15或16的佐剂系统，其中所述佐剂系统进一步包括还原的谷胱甘肽。
18.根据权利要求15-17中任一项的佐剂系统，其中所述佐剂系统进一步包括谷胱甘 肽S-转移酶。
19.根据权利要求18的佐剂系统，其中所述谷胱甘肽S-转移酶是Derp8。
20.根据权利要求15的佐剂系统，其中所述半胱氨酸蛋白酶处于氧化无活性状态。
21.根据权利要求15-20中任一项的佐剂系统，其中所述半胱氨酸蛋白酶变应原选自 Ale ol、Aca sl、Blo tl、Der fKDer piΛDer ml、Der sl、Eur ml、Gly dl、Lep dl、Pso ol、 Sui ml 禾口 Tyr pi。
22.根据权利要求21的佐剂系统，其中所述半胱氨酸蛋白酶变应原是Derpi。
23.用于粘膜施用的抗原疫苗组合物，其包括抗原和根据权利要求15-22中任一项的 佐剂系统。
24.根据权利要求23的组合物，其中所述抗原是变应原。
25.根据权利要求24的组合物，其中所述抗原选自草花粉变应原、尘螨变应原、豚草变 应原、雪松花粉、猫变应原和桦树变应原。
26.预防或治疗有此需要的受试者中的过敏症的方法，其包括给所述受试者施用根据 权利要求1-14或24-25中任一项的疫苗组合物。
全文摘要
本发明涉及包括处于还原活性状态或处于氧化无活性状态的半胱氨酸蛋白酶变应原用于粘膜施用的过敏症疫苗组合物。本发明进一步涉及用于在包括半胱氨酸蛋白酶用于粘膜施用的疫苗中使用的佐剂系统。
文档编号A61K39/39GK101909646SQ200980101639
公开日2010年12月8日 申请日期2009年1月7日 优先权日2008年1月8日
发明者M·M·费雷拉斯戈麦斯 申请人:阿尔克-阿贝洛有限公司