基于人类notch3的融合蛋白作为notch3信号的诱饵抑制剂的制作方法

专利名称：：基于人类notch3的融合蛋白作为notch3信号的诱饵抑制剂的制作方法基于人类N0TCH3的融合蛋白作为N0TCH3信号的诱饵抑制剂本发明所公开的技术得到了美国政府的支持，包括来自美国国立卫生研究院的授权码ROlHL62454以及来自美国国防部的授权码DAMRDCW81XWH-04-1-054，因此，美国政府对本专利拥有一定的专利权。在整个申请文件中，通过括号内的阿拉伯数字或者在括号内标注作者和出版日期的形式，引用了各种出版物。这些出版物的完整的引用信息在说明书的末尾有记载。为了更加充分的描述本发明所属的领域，这些出版物所公开的内容在本申请中被引用。
背景技术：
：血管发育在哺乳动物胚胎发育过程中，血管系统的形成是一个早期的和必要的过程。在胚胎阶段，血管发育是从起源于近轴和侧板中胚层的多功能成血管细胞开始的。成血管细胞有潜力分化成造血祖细胞或内皮祖细胞，被称为成血管细胞。血管发育起始于一个称为血管生成的过程，由此成血管细胞分化为内皮细胞并迁移到一起以形成原始血管丛。该初始的血管网络由大小均勻、并全部由内皮细胞组成的血管构成。该血管丛然后通过血管生成而重塑。血管生成包括新血管的萌发、这些心血管迁移进入无血管区，以及辅助细胞、周细胞和平滑肌细胞的募集补充(GaleandYancopoulos，1999)，这些分化并形成收缩血管壁的平滑肌细胞起源于多种祖细胞，这些祖细胞包括神经嵴细胞、间质细胞、甚至内皮细胞(Owens,1995)。在成人阶段，血管生成涉及卵泡发育、伤口愈合和病变过程比如肿瘤血管生成以及心脏病。Notch家族和Notch配体对于果蝇、线虫、斑马鱼和哺乳动物的研究表明，Notch途径是一种进化上保守的信号机制，其对于调整许多的细胞命运决定(cell-fatedecisions)起作用。需要Notch信号来从所有三个胚层起源合适的构建细胞。根据不同的细胞环境，Notch信号可能会抑制和诱导分化、诱导增殖和促进细胞存活(Artavanis-Tsakonas等，1995；Lewis,1998；Weinmaster,1997)。在果蝇中，单个Notch蛋白被2个配体激活，这两个配体是Serrate和Delta。在哺乳动物中，这些家族已经被扩展到4个Notch基因(Notchl，Notch2,Notch3和Notch4)，以及5个配体，即2个类似于Serrate配体(即Jaggedl-2)，3个Delta配体(即Dll,3,4)(Bettenhausen等，1995；Dunwoodie等，1997；Gallahan和Callahan,1997；Lardelli等，1994；Lindsell等，1995；Shawber等，1996a；Shutter等，2000a；Uyttendaele等，1996；Weinmaster等，1992；Weinmaster等，1991)。在胚胎发育过程中，Notch受体和配体都在动态空间和时间形式上得以表达。但是，是否所有的配体激活了所有的受体是未知的。Notch信号和功能Notch信号影响许多不同类型的细胞命运决定，其影响的途径为根据不同的环境提供抑制、诱导或者增殖信号(参见Artavanis-Tsakonas等，1995；Greenwald,1998；Robey,1997；Vervoort等，1997)。这种多效性的功能表明，Notch通过时空的方式调节多种信号途径。与Notch调节细胞命运决定一致，无论是受体还是配体都是具有单跨膜结构域的细胞表面蛋白(图1)。Notch蛋白的调整性的胞外域主要由串联排列的表皮生长因子样(EGF-Iike)的重复片段组成，这对于配体结合是必需的(Artavanis-Tsakonas等，1995；Weinmaster,1998)。表皮生长因子样的重复片段的C-端是另外三个富含半胱氨酸的重复片段，指定了Lmi2/Notch重复片段(LNR)(Greenwald,1994)。下游的LNR位于具有解蛋白的裂解序列(RXRR)，该裂解序列被弗林蛋白酶样转化酶所识别。对于Notchl，在该位点的裂解产生180KD(千道尔顿)的细胞外肽和120KD的细胞内肽，其聚在一起在细胞表面产生异二聚体受体(Blaumueller等，1997；Kopan等，1996；Logeat等，1998).Notch的细胞内域(NotchI⑶，图1)救援功能缺失的Notch显型表明这种形式的Notch信号构成的(FortiniandArtavanis-Tsakonas,1993；LymanandYoung,1993；Rebay等，1993；Struhl等，1993)。Notch的细胞质域包含三个可识别的域RAM域、锚蛋白重复域和C-末端PEST域(见图1)。在配体激活之上Notch经历两个额外的解蛋白裂解，这种裂解导致胞质域的释放(Weinmaster，1998)。Notch肽移位到核，与被称为CSL(￡BF，Su(H)，Lag-2)的转录抑制因子相互作用，并将其转换为转录激活因子。CSL与Notch的相互作用取决于Notch的RAM域的存在；同时，转录激活也需要锚蛋白重复域的存在(Hsieh等，1996；Hsieh等，1997；Roehl等，1996；Tamura等，1995；Wettstein等，1997)。体内和体外研究都表明，HES和Hey基因是Notch/CSL依赖信号的直接目标(BaileyandPosakony,1995；Eastman等，1997；Henderson等，2001Jarriault等，1995；Nakagawa等，2000；Wettstein等，1997)。HES和Hey基因是与DNA在N-盒结合的bHLH转录抑制因子(Nakagawa等，2000；Sasai等，1992；Tietze等，1992)。Notch也被提出通过独立于CSL的途径表征信号。事实上，对于某些形式的Notch信号，仅仅锚蛋白重复域的表达是必要和充分的(Lieber等，1993；Matsuno等，1997；Shawber等，1996b)。最后，PEST域被暗示与蛋白转换有关，这种蛋白转换通过SEL-IO/泛素依赖的途径进行(Greenwald,1994；Oberg等，2001；Rogers等，1986；Wu等，1998；Wu等，2001)。与受体相似的，Notch配体的胞外域也主要是由串联排列的表皮生长因子样重复片段组成(图1)，这些重复片段的上游是分开的表皮生长因子样重复片段已知的DSL(2elta，Serrate,Lag-2)的，这在与配体结合和激活受体时是必需的(Artavanis-Tsakonas等，1995)。Notch信号与血管发育虽然已经确定很多基因都具有诱导血管生成和血管再生的功能，但是对于在血管发育过程中细胞命运决定是如何被指定的却了解很少。很多观察显示，Notch信号途径可能在细胞命运决定和血管系统的构建中起作用。Notchl，Notch4,Jaggedl和D114都在脉管系统发育中被表达，而Notch3则在附属的平滑肌细胞中被表达(Krebs等，2000；Shutter等，2000b；Uyttendaele等，1996；Villa等，2001;Xue等，1999)。小鼠缺乏Jaggedl会致胚胎死亡，同时有严重的血管缺陷(Xue等，1999)。缺乏Notchl的小鼠会致胚胎死亡，并会死于严重的神经缺陷，还有血管生成缺陷(Krebs等，2000；Swiatek等，1994)。缺乏Notch4的小鼠出生后看似正常，但是已经失去Notchl和Notch4的胚胎，因为严重出血和血管构建缺陷，死于E9.5，这表明Notchl和Notch4可能在血管发明过程中有其他的功能(Krebs等，2000)。在内皮细胞层的Notch4以活化形式的外源表达也会导致血管缺陷，这种血管缺陷类似于在同时缺失Notchl和Notch4的小鼠上观察到的，所以，这些现在表明合适水平的Notch信号在胚胎脉管系统发育过程中是至关重要的(Uyttendaele等，2001)。综上，因为Notch/Ntch信号成分而造成的小鼠突变的数据揭示了依赖于Notch的几个过程，包括血管重塑、动脉静脉定型、血管平滑肌细胞的募集补充和心脏/心脏流出血管发育。最近的实验已经暗示Notch信号在动脉/静脉内皮细胞的定型。在E13.5胚胎的原位分析发现，Notchl，Notch3,Notch4,D14，Jaggedl和Jagged2的表达被限制在动脉而不在静脉表达(Villa等，2001)。与表达数据一致，在斑马鱼上的Notch信号干扰与缺失动脉标记ephrinB2有关；而激活形式的Notch的异位表达导致静脉细胞内的标记EphB4在背大动脉的缺失(Lawson等，2001)。这些数据表明，Notch信号可能有助于血管生成过程中动脉和静脉细胞的定型。综上，因为Notch/Notch信号成分而造成的小鼠突变的数据揭示了依赖于Notch的几个过程，包括血管重塑、动脉静脉定型、血管平滑肌细胞的募集补充和心脏/心脏流出血管发育。有人认为Notch信号在成人血管系统中也起作用。在人类中，在Notch3的胞外域的错义突变与变性的血管疾病CADASIL的发展有关(Caronti等，1998；Desmond等，1998；Joutel等，2000Joutel等，1996)。在伤口愈合模型中，伤口边缘的内皮细胞的再生中观察到Jaggedl表达的增加，这表明Notch信号可能在成人的血管生成过程中起作用(Lindner等，2001)。综上，这些数据表明Notch信号在血管发育的许多重要步骤中起作用，这些步骤包括血管再生、血管构建/血管生成、动脉/静脉定型。但是，Notch信号途径影响这些不同的步骤的分子机制尚未阐明。意义Shimizu等(J.Biol.Chem.274(46):32961_32969(1999))描述了NotchlECD/Fc、Notch2E⑶/Fe和Notch3E⑶/Fe在结合研究中的用途，然而，Shimizu等没有提及这些蛋白在抑制血管生成中的作用。美国专利号为6，379，925、于2002年4月30号公告的专利中，Kitajewski等描述了小鼠Notch4。但是，它没有描述像本申请提出的基于Notch的融合蛋白。Notch蛋白在发育的决策中起着关键的作用，涉及脉管系统、造血系统和神经系统。因此，对他们的功能的认识是认识如何进行细胞命运决定和在发育以及成人组织中如何控制任务的关键。到目前为止，若干关于Notch或Notch配体基因破坏的报道已经描述了血管表型，并强调这一途径是指导血管发育的基本机制。异常Notch活动已被证实与人类疾病，包括癌症和血管疾病(CADASIL)有关。Notch在肿瘤血管生成中的分析最近才刚刚开始，但是，我们对Notch的潜在的下游目标的发现表明了其在血管生成相关的病理过程中的作用。比如，VEGFR-3已经被认为与肿瘤血管的生成和肿瘤淋巴管生成有关。几个其他潜在的Notch目标的表达或者功能也已经与肿瘤血管的生产联系起来，包括印hrinB2，Id3，血管生成素1，andPDGF-B。这些Notch基因功能的见解，有助于将来明确Notch在人类疾病中的作用。
发明内容本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的I-X表皮生长因子重复片段(EGFrepeats1_X)，其中X是12_34的任意整数；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的I-X表皮生长因子重复片段，其中X是1-10的任意整数；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体的胞外域的至少12个表皮生长因子重复片段；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的表皮生长因子重复片段，其中至少有12个重复片段；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明提供一种治疗患有癌症的主体的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以治疗主体，从而治疗患有癌症的主体。本发明提供一种抑制主体血管生成的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制血管生成，从而抑制主体血管生成。本发明提供一种治疗患有卵巢癌的主体的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以治疗主体，从而治疗患有卵巢癌的主体。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用。本发明提供上述融合蛋白在制备用于抑制血管生成的药物组合物中的应用。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗卵巢癌的药物组合物中的应用。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗代谢紊乱的药物组合物中的应用。本发明提供一种抑制主体生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成。本发明提供一种抑制主体肿瘤转移的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体肿瘤转移。本发明提供一种抑制主体继发性肿瘤生长的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体继发性肿瘤生长。本发明提供一种抑制主体血管被肿瘤共择的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体血管被肿瘤共择。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的VEGF受体抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的血小板衍生生长因子(PDGF)抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的PDGF受体拮抗剂以治疗患有肿瘤的主体。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的HER2/neU抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。本发明提供一种治疗患有乳腺癌的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以治疗患有乳腺癌的主体。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。S1本图显示了Notch和Notch配体的概要结构Notchl，Notch2,Notch3,Notch4,Jagged-I,Jagged-2,Delta-#1(Delta-like1)，Delta-#3,Delta-#4。S2本图显示了基于Notch的融合蛋白(NotchE⑶/Fe)的方案设计。包含了EGF重复片段的Notchl，Notch2,Notch3或Notch4的胞外域被融合到抗体的Fc部分。图3本图显示了一个共培养实验，以便于测试基于Notch的融合蛋白的活性。Notch和Notch响应转录报告都在一个“Notch响应”细胞中表达，HeLa.Notch配体，Jagged-I,Delta-样1，或Delta-样4都在一个“配体呈现”细胞中表达，293。表达被个别细胞群的转染介导调节，细胞被共同培养，然后测试依赖于Notch的报告的活性。图4本图显示了基于Notch的融合蛋白相对于在Notch和Notch配体相互作用下的Notch信号的抑制活性。通过共同培养Notchl和3类型的Notch配体表达细胞发现了Notch信号的诱导现象，同时，基于Notch的融合蛋白表达载体进入Notchl表达细胞的共同转染对这种诱导现象有抑制作用。因此，基于Notch的融合蛋白能够用于Notch抑制剂，基于抑制Notch和Notch配体相互作用。图5本图显示了基于Notchl的融合蛋白(NotchlECD/Fc)在293位的表达。A在细胞溶解液(Iystates)(Iys)中表达或分泌到培养基(media)(sup)。B在NECD/Fcs的293溶解液中表达，S6本图显示了Notch信号在HUVEC的活化作用，HUVEC被腺病毒编码的VEGF-165感染。通过使用CBFl启动子活性，监测到了Notch信号的活化作用。CBFl启动子的转录活性被Notch-IC与CBFl的结合激活。我们在HUVEC中测量了CBFl启动子活性，其中HUVEC在不同的感染复数下被腺病毒编码的VEGF-165感染。CBFl启动子的诱导作用在被Ad-VEGF感染的HUVEC中发现，与Ad-LacZ感染的细胞在感染复数依赖的方式形成对比。这个数据显示，在HUVEC，VEGF的过度表达能激活Notch信号。S7本图显示基于Notch的融合蛋白对于VEGF诱导的Notch信号的活化作用。基于Ad-Notch的融合蛋白与Ad-VEGF的共同感染，很明显的降低了由Ad-VEGF单独感染诱导的CBFl启动子活性的活化作用。在A中，发现基因转染报告后24小时时有60%的抑制，48小时时有90%的抑制。Notch诱饵的抑制活性取决于基于Ad-Notch融合蛋白的感染复数。图8本图显示了一个实验，该实验评估了基于Notch的融合蛋白对于在HUVEC中过度表达的VEGF-165对萌芽诱导的影响。当感染Ad-VEGF的HUVEC在胶原蛋白凝胶中培养8天，在胶原蛋白凝胶中诱导出了萌芽。过度表达VEGF的萌芽诱导作用被腺病毒编码的基于Notch的融合蛋白的共同感染明显抑制。基于Ad-Notch的融合蛋白本身对于形态几乎没有影响。图9本图显示了在显微镜下每场的萌芽计数结果。感染Ad-VEGF加入HUVEC中增加了萌芽的数量取决于所采用的感染复数。即使有一半感染复数的基于Notch的融合蛋白被使用，与Ad-VEGF相比，Ad-VEGF诱导的萌芽被明显抑制。这些数据显示，通过Notch信号的活化作用，VEGF诱导了HUVEC萌芽，同时，基于Notch的融合蛋白能抑制VEGF诱导的萌芽。图10本图显示了大鼠(rat)Notchl蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO1)和一个连接子(linker)序列(SEQIDNO:2)。图11本图显示了大鼠Notch2蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO3)和一个连接子序列(SEQIDNO:2)。图12本图显示了鼠(mouse)Notch3蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO:4)。图13本图显示了鼠Notch4蛋白的胞外域的氨基酸序列(SEQIDNO5)和一个连接子序歹丨J(SEQIDNO:2)。图14A和14B本图显示了大鼠Notchl基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO6)。图15A和15B本图显示了大鼠Notch2基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO7)。图16A和16B本图显示了鼠Notch3基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO8)。图17A和17B本图显示了鼠Notch4基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO9)和一个连接子序列的核苷酸序列(SEQIDNO10)和氨基酸序列(SEQIDNO:2)。图18A和18B本图显示了人类Notchl基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO11)。图19A和19B本图显示了人类Notch2基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO12)。图20A和20B本图显示了人类Notch3基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDNO13)。图21A和21B本图显示了人类Notch4基因的胞外域的核苷酸序列(SEQIDN0:14)。图22A-22I这些图显示了VEGF激活Notch信号来诱导HUVEC萌芽。HUVEC在感染复数为40(图22A，22H，221)或20(图22C，22G)的情况下与Ad-VEGF进行转导。为了得到相同数量的腺病毒总数，在感染复数为60(图22G)、80(图22A)和100(图22H，22I)情况下，Ad-LacZ被共同转导给HUVEC。图22A显示了Notch和Notch配体表达的RT-PCR分析。数字表示PCR周期。图22B显示了转导的VEGF对CSL报告活性的影响。图22C显示了SU5416对CSL报告活性的影响，CSL报告活性被Ad-VEGF反式激活。图22D显示了Notch诱饵(NlE⑶Fe)的构建。图22E显示了来自HUVEC的NIECDFc的分泌，其中HUVEC被Ad-NlECDFc转导。图22F显示了在共同培养法中，NlE⑶Fc对抗配体介导的CSL报告活性的影响(□:(_)；·0.33ngPHyTC-NlECDFc；·0.67ngpHyTC-NlECDFc)。图22G-I显示了NIECDFc对抗Ad-VEGF转导的HUVEC的影响。在缺少或者存在指明的剂量的Ad-NlECDFc共同转导的情况下，在HUVEC中Ad-VEGF的转导激活Notch信号。图22G显示了NlE⑶Fc对CSL报告活性的影响，CSL报告活性被Ad-VEGF反式激活。图22H显示了在感染复数为40的条件下，Ad-VEGF转导的HUVEC和Ad-NlE⑶Fc的共同转导的萌芽的抑制作用。图221显示了NlE⑶Fc对Ad-VEGF转导的HUVEC的萌芽的影响的量化情况(口萌芽；·细胞数)。图23A-23J这些图显示了Notch信号上调Fltl表达来诱导HUVEC萌芽。在感染复数为40的条件下，HUVEC被Ad-LacZ或Ad-NlIC转导。图23A-23C显示了受体酪氨酸激酶抑制剂对Notch诱导的HUVEC萌芽的影响。图23A是一张Ad-NlIC转导的HUVEC萌芽的照片，该HUVEC采用了1μM的PD166866，1μM的ZD1893和0.5μM的SU5416进行处理。图23Β显示了以IyM的抑制剂的效果的量化情况(口萌芽；·细胞数)。图23C显示了SU5416的效果的剂量依赖性(口萌芽；·细胞数)。图23D-E显示了Flt-I表达在Ad-NlIC转导的HUVEC的诱导作用。图23D显示了Flt-ImRNA表达的RT-PCR分析。图23Ε显示了Flt-I蛋白表达的WB分析。图23F-G显示了在PlGF刺激下，Notch诱导的HUVEC萌芽的增加。Ad-NlIC转导的HUVEC用SFM而不是完全培养基，培养在胶原蛋白凝胶中，加入或者不加入50ng/ml的P1GF。图23F显示了PlGF诱导Ad-NlIC转导的HUVEC的萌芽(箭头头部单丝状伪足芽；箭头多丝状伪足芽)。图23G显示了PlGF对Ad-NlIC转导的HUVEC萌芽的影响的量化情况(口多个；·总计)。图23H-I显示了Flt-IsiRNA转染对Fltl表达的影响。Ad-NlIC转导的HUVEC用200pmol的对照(control)(CT)或者Flt-IsiRNA转染。图23H显示了Flt-ImRNA表达的减少。图231显示了Flt-I蛋白表达的减少。图23J显示了Flt-IsiRNA转染对Notch诱导的HUVEC萌芽的影响。Ad-NlIC转导的HUVEC被100或者200pmol的siRNA转染，并在胶原蛋白凝胶中培养2天。图24A-24E这些图显示了通过采用上调MMP-9和MTl-MMP的方式，VEGF通过Notch信号调节明胶酶活性。图24A-B显示了由在HUVEC中的VEGF刺激的MMP-9和MMP-2的活性的明胶酶谱分析。图24A显示了NlE⑶Fc对MMP-9活性的影响。将被转导的HUVEC培养在纤维蛋白凝胶中，培养指定的天数(即2天，4天，6天，8天)。使用胶原蛋白凝胶培养也得到了相似的结果，虽然MMP-9的诱导作用在纤维蛋白凝胶中比在胶原蛋白凝胶中强(数据没有显示出来)。图24B显示了NlE⑶Fc对MMP-2活性的影响。在指定的剂量下HUVEC被Ad-NlE⑶Fc转导，并且第4天收集在胶原蛋白凝胶中培养HUVEC的条件培养基。图24C-D显示了用Notch信号上调MMP-9和MT1-MMP。在感染复数为40的条件下，HUVEC被Ad-LacZ或Ad-NlIC转导。数据显示了PCR周期。图24C显示了Notch信号对MMP-9和MMP-2表达的影响的RT-PCR分析。图24D显示了在Notch信号作用下转录物和蛋白的MTl-MMP表达的诱导作用。图24E显示了用Ad-NlECDFc的共同转导下在Ad-VEGF-HUVEC中MMP-9和MTl-MMP表达的RT-PCR分析。在各自感染复数为40下，在不存在或存在Ad-NlE⑶Fc共同转导时，HUVEC被Ad-VEGF转导。为了得到相同总数的腺病毒，在感染复数为80的条件下Ad-LacZ被共同转导。图25A-25D这些图显示了Notch信号在依赖VEGF体内血管生成中所扮演的角色。图25A-25D显示了在小鼠的DAS试验中，NlE⑶Fc对VEDF诱导的血管生成的抑制作用。显示了代表性的照片。图25A显示了用293/VEGF转染子皮下诱导血管生成，与293/VEGF表达Notch诱饵(基于Notch的融合蛋白)N1E⑶Fc形成对比。图25B显示了在对照组用293/VEGF诱导的血管化的量化等级，与293表达Notch诱饵(基于Notch的融合蛋白)NlECDFc形成对比。图25C显示了用Ad-LacZ感染的MDA-MB-231细胞皮下诱导的血管生成，与Ad-NlE⑶Fc(基于Notch的融合蛋白)感染的MDA-MB-231细胞形成对比。MDA-MB-231乳腺癌细胞产生VEGF(数据没有显示出来)。图25D显示了用Ad-LacZ感染的MDA-MB-231细胞诱导的血管化的量化等级，与Ad-NlECDFc(基于Notch的融合蛋白)感染的MDA-MB-231细胞形成对比。图26A和26B这些图显示了Ad_VEGF165转导的HUVEC增殖情况。在指定的剂量下，HUVEC被Ad-VEGF165转导。为了达到相同总数的腺病毒，在感染复数为40pfu/细胞的条件下，Ad-LacZ被共同感染。将HUVEC悬浮于增加了FBS的SFM中，然后接种于1x104细胞/孔的24孔的板上，并加入0.4ml培养基。4天后，使用CCK-8试剂盒来确定细胞数量，其结果以测定的细胞数量与对照组细胞数量的比率的形式显示，该对照组在感染复数为40pfu/细胞的条件下被Ad-GFP转导。图26A显示了转导的VEGF对增殖的影响。图26B显示了SU5416的抑制效果。在指定的剂量下，Ad-VEGF转导的HUVEC采用SU5416进行处理。图27A和图27B这些图显示了在I型胶原蛋白凝胶中HUVEC萌芽的诱导作用。在指定的剂量下，HUVEC被Ad-VEGF165或AD-NlIC转导。为了达到相同总数的腺病毒，在感染复数为40pfu/细胞的条件下，Ad-LacZ被共同感染。被转导的HUVEC用完全培养基中在胶原蛋白凝胶中进行培养。第7天在显微镜下观察萌芽的数量。图28A和28B这些图显示了Notch信号的改变对细胞增殖的影响。这些细胞都被指定的腺病毒转导。为了达到相同总数的腺病毒，在感染复数为60pfu/细胞的条件下，Ad-GFP被共同感染。4天后，使用CCK-8试剂盒来确定细胞数量，其结果以测定的细胞数量与对照组细胞数量的比率的形式显示，该对照组在感染复数为60pfu/细胞的条件下被AD-GFP转导。图28A显示了被转导的miC和Notch融合蛋白对HUVEC增殖的影响。将转导的HUVEC悬浮于完全培养基，然后接种于1x104细胞/孔的24孔的板上，并加入0.4ml指定的培养基(口Ad-NlIC；■:Ad-NlECDFc)。图28B显示了Notch融合蛋白对KP1/VEGF转染子增殖的影响。将被转导的KP1/VEGF转染子悬浮于RPMI1640培养基中，然后接种于2x104细胞/孔的24孔的板上，并加入0.5ml培养基。图29本图显示了PIGF表达在Ad-NlIC转导的HUVEC的诱导作用的RT-PCR分析。在感染复数为40pfu/细胞的条件下，HUVEC被Ad-LacZ或Ad-NlIC感染。总RNA从被转导的HUVEC中分离出来，其中所述的HUVEC用完整的培养基中在胶原蛋白凝胶中培养5天。图30A-30C这些图显示了Ad-NlIC或者Ad-VEGF转导的由Flk-IsiRNA转染的HUVEC的萌芽抑制作用。图30A显示了在用200pmol的Flk-IsiRNA转染的Ad-VEGF-HUVEC中Flk-ImRNA和蛋白表达的减少。在感染复数为40pfu/细胞的条件下，Ad-VEGF-HUVEC被200pmol的控制剂(CT)或Flk-IsiRNA转染。转染后48小时总RNA被分离。转染48小时后，用SFM从血清饥饿细胞中收集总细胞裂解液。图30B和30C显示了Flk-IsiRNA转染对VEGF或Notch诱导的HUVEC萌芽的抑制作用。在感染复数为40pfu/细胞的条件下，Ad-NlIC或Ad-VEGF-HUVEC被转染，转染时采用200pmol的siRNA并在胶原蛋白凝胶中培养5天。图30B显示了Flk-IsiRNA转染对HUVEC萌芽的影响(口Ad_VEGF；·=Ad-NlIC)。图30C显示了Flk-IsiRNA转染抑制效果的定量情况。图31A和31B这些图显示了对采用基质金属蛋白酶抑制剂GM6001处理的Ad-NlIC转导的HUVEC的萌芽抑制。在感染复数为40pfu/细胞的条件下，将EitherAd-LacZ或Ad-NlIC-HUVEC在胶原蛋白凝胶中培养5天，培养时不加或者加入50μm的GM6001。图31A显示了GM6001对Notch诱导的HUVEC萌芽的影响。图31B显示了GM6001抑制效果的量化情况。图32A、32B和32C本图显示了人类Notch3全长核苷酸序列(SEQIDNO15)，起始于ATG(nt1)，以TGA(nt6964)结束。信号肽和第一个34EGF样重复域在这个序列的nt1-4158得到体现。核苷酸1-4158用于设计人类Notch3诱饵蛋白，在这里有描述。包含EGF样重复片段1_34的核苷酸有下划线。图33本图显示了人类Notch3全长氨基酸(aa)序列(SEQIDNO16)，从aal(M为蛋氨酸)，到aa2555(K为赖氨酸)。信号肽和第一个34EGF样重复域在这个序列的aa1-1386得到体现。氨基酸1-1386用于设计人类Notch3诱饵蛋白，在接下来的部分有描述。包含EGF样重复片段1-34的氨基酸有下划线。图34本图显示了两个人类Notch3诱饵蛋白的图示，即h_Notch3(1_34)诱饵和h-spHC-Notch3(1-34)诱饵。图35本图显示了用人类Fc核苷酸序列在Notch3诱饵蛋白(SEQIDNO17)上产生Fc标记。人类Fc的713核苷酸，被融合到Notch3诱饵构建的3‘端，刚好是Notch3EGF样重复的下游。人类Fc区域便于Notch诱饵的检测和纯化，并用于稳定分泌的人类Notch3-人类Fc融合蛋白。图36本图显示了用人类Fc氨基酸序列在Notch3诱饵蛋白(SEQIDNO18)上产生Fc标记。人类Fc的237氨基酸，被融合到所有Notch诱饵构建的C端，刚好是Notch3EGF样重复的下游。人类Fc区域便于Notch诱饵的检测和纯化，并用于稳定分泌的人类Notch3-人类Fc融合蛋白。图37本图显示了人类Notch3/Fc融合序列构建人类Notch3的EGF重复片段34位的末端。图38本图显示了被预计包含人类Notch3的氨基酸1-40的人类Notch3信号肽的信号序列分析。本测定是采用丹麦科技大学提供的IP3.0服务器程序进行的。这些结果预测位于丙氨酸39(A39)和丙氨酸40(A40)之间的裂解的主要位点。如图所示，在人类Notch3的氨基酸序列1-40中用“/”将该裂解位点隔开。图39本图显示了被预计包含人类Hc的氨基酸1-22的人类Hc信号肽的信号序列分析。本测定是采用丹麦科技大学提供的IP3.0服务器程序进行的。这些结果预测位于丙氨酸21(A21)和丙氨酸22(A22)之间的裂解的主要位点。如图所示，在人类Hc的氨基酸序列1-22中用“/’将该裂解位点隔开。图40A和40B本图显示了h-N0tch3a_34)诱饵蛋白(SEQIDNO31)的核苷酸序列。预测的人类Notch3信号肽有下划线(nt1-120)。Notch3EGF重复片段1-34是从nt121-4158编码。融合连接点、BglII位于nt4158-4163。Fc标记序列为斜体并有下划线。图41本图显示了h-Notch3(1-34)诱饵蛋白(SEQIDNO32)的氨基酸序列。预测的人类Notch3信号肽有下划线(AA1-40)。Notch3EGF重复片段1-34是从aa41-1386编码。Fc标记序列为斜体并有下划线。图42本图显示了h-spHGN0tch3(1_34)诱饵蛋白(SEQIDNO33)的氨基酸序列。预测的人类Notch3信号肽有下划线(AA1-22)。Notch3EGF重复片段1-34是从aa22-1386编码。Fc标记序列为斜体并有下划线。图43A和43B本图显示了h-SpHGN0tch3(1_34)诱饵蛋白(SEQIDNO34)的核苷酸序列。预测的人类HC信号肽有下划线(nt1-66)。Notch3EGF重复片段是从nt67-4104编码。融合链接点，BglII位点为nt5004到5009。Fc标记序列为斜体并有下划线。图44本图显示了Notch蛋白和配体在血液和淋巴内皮细胞中的表达。对由HMVEC纯化得到的淋巴内皮细胞(LEC)和血液内皮细胞(BEC)的RNA中的Notchl-4，Dili，D114和Jaggedl进行了RT-PCR实验。Notchl，Notch2,Notch4,D114和Jaggedl在BEC和LEC都有相似水平的表达。Notch3的表达看似被限定在LEC，暗示Notch3信号在淋巴内皮细胞中起作用。图45本图显示在胚胎的胚龄13.5天，Notch3与淋巴内皮细胞标记LYVE-I和Proxl—起共同表达。胚龄13.5天的小鼠胚胎的10微米的连续切片被LYVE-l，Proxl或Notch3免疫染色。Notch3被表达在同时表达了淋巴内皮细胞标记LYVE-I和ftOxl的细胞上。图46本图显示了在血管内皮细胞中ftOxl诱导Notch3表达。(A).检验了的异位表达是否会改变Notch蛋白或者配体的表达。腺病毒感染Ad-Proxl或Ad-LacZM小时后，HUVEC总RNA被分离，并进行了Notchl-4，D114和Jaggedl的定量RT-PCR。有力地上调了Notch3的表达。Notchl、Notch2、Notch4、D114和Jaggedl表达没有被明显地影响。(B).化合物E(cE)，抑制Notch信号的早老素(I^resenlin)抑制剂，在Ad-LacZ或Ad-Proxl感染的HUVEC中孵育M小时。分离总RNA，并做了定量PCR实验以便于测定Notch3的表达。Proxl诱导Notch3的表达，而且这个诱导通过添加化合物E而被抑制。这表明Notch3的Proxl诱导取决于Notch信号的活化作用。图47本图显示了在血液内皮细胞中ftOxl诱导Notch靶向基因。HUVEC被腺病毒编码、LacZ,ProxUNlIC或N4/int_3感染，感染M小时后分离总RNA。为了测定内皮的Notch靶向基因、VEGFR-3、EphrinB2、Heyl和Hey2，进行了定量RT-PCR实验。与Notchl和Notch4信号活化作用相似，Proxl诱导了所有4个基因(A和B)。Heyl和Hey2在淋巴内皮细胞中的表达未知。图48本图显示了Proxl诱导Notch靶向基因取决于在血液内皮细胞中的Notch信号。HUVEC被腺病毒编码、LacZJroxljllc或N4/int_3感染。化合物E(cE)，抑制Notch信号的早老素抑制剂，在Ad-LacZ或Ad-Proxl感染的HUVEC中孵育M小时，然后分离总RNA。为了测定内皮的Notch靶向基因、VEGFR-3、EphrinB2和Hey2，进行了定量RT-PCR实验。Prox-I介导的诱导Notch靶向基因、印hrinB2、VEGFR_3和Hey2被抑制，通过添加Notch信号抑制剂化合物E。因此，Proxl通过Notch调节印hrinB2、VEGFR-3和Hey2的表达。图49本图显示了一个miC敲入的示意图。活化形式的Notchl被插入到EFlα基因座(locus)位于两个LoxP位点侧面。当Cre重组酶的表达时，neo/tpA盒丢失，并且在无处不在的EFlα启动子的控制下miC被表达。图50本图显示了胚胎发育10.5天前，Notch的活化作用在SM22表达的血管平滑肌细胞导致胚胎死亡。在出生后21天(P21)，，没有发现成活SM22Cre/+；EFlαNlIC/+小鼠，P值小于0.001。在胚胎发育的9.5天(Ε9.5)，观察到了SM22Cre/+；EFlαNlIC/+胚胎的可预测数量，但是与它们处于对照的同伴相比，它们生长严重迟缓(下面的图)。图51本图显示了Notch的活化作用在SM22表达的血管平滑肌细胞改变α平滑肌细胞肌动蛋白的表达。胚龄9.5天的胚胎α平滑肌细胞肌动蛋白被整体免疫染色。与WT对照组相比，α平滑肌细胞肌动蛋白的表达在SM22Cre/+;EFlamiC/+胚胎中改变。因此，在血管平滑肌细胞中的Notch信号的活化作用破坏了心血管生长。具体实施例方式术语本申请中使用的下列用语，除另有明确说明外，应具有以下所列的含义“给药”可以用本领域技术人员熟知的任何方法来实现或完成。这些方法比如包括病灶内、肌肉、皮下、静脉、腹腔内、脂质体介导、经粘膜、肠、外用、鼻腔、口腔、肛门、眼或耳等给药途径。“附着”是指以任何方式连接。在一个实施例中，附着是指由共价键连接，在另一个实施例中，附着是指以非共价键连接。“氨基酸”、“氨基酸残基”和“残基”在此互换使用是指一种氨基酸与蛋白质、多肽或者肽结合。氨基酸，例如，可以是一种天然氨基酸，或者是一个能起类似于天然氨基酸的作用的天然氨基酸类似物。“抗体“应包括但不限于(a)包括两个重链和轻链以及识别抗原的免疫球蛋白分子；(b)多克隆或单克隆免疫球蛋白分子；及(c)一价或二价片段。免疫球蛋白分子可能来自任何常见的种类，包括但不限于IgA，分泌型IgA，IgG,IgE和IgM。IgG亚类是本领域所熟知的，包括但不限于，人类IgGl，IgG2，IgG3和IgG4。抗体可以是天然存在的和非天然存在的。此外，抗体包括嵌合抗体(chimericantibodies)，全合成抗体，单链抗体和其片段。抗体可能是人类抗体或非人类抗体。非人类抗体可能通过重组方法进行人源化，以减少其对人类的免疫原性。抗体片段包括但不限Fab和Fc片段。“抗体的Fc部分”，在一个实施例中，是一个可结晶片段，该可结晶片段通过免疫球蛋白的木瓜蛋白酶消化得到的，该免疫球蛋白是由通过二硫键连接的两个重链的一半C-末端和以“效应物区域”“effectorregion”著称的的免疫球蛋白组成的。在另一个实施例中，“抗体的Fc部分”是指全部或实质上全部的，一个重链的一半C-末端。“人源化”，对于抗体来说，是指抗体CDR域外部的某些、大部分或者全部氨基酸被相应的来源于人类免疫球蛋白分子取代。只要不废除抗体与特定抗原结合的能力，氨基酸小的添加、删除、插入、替换或修改是允许的。合适的人类免疫球蛋白分子包括但不限于IgGl,IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgM分子。各种出版物描述了如何制造人源化抗体，例如，美国专利号4816567，5225539，5585089和5693761，和PCT国际公布号W090/07861的出版物。本申请中所使用的术语“组合物”，作为药物组合物，是包含由有效成分和非有效成分构成的载体的产品，以及任何直接或者间接通过两个或者多个组分化合、络合或者聚合得到的产品，或由一个或更多的成分分解得到的产品，或从一个或多个成分通过其他类型的反应或相互作用得到的产品。在本申请中，“有效量”指的能治疗患有肿瘤、疾病或紊乱的主体的使用量。因此，有效量将随主体的不同和治疗的条件的不同而改变。本领域的普通技术人员可以进行常规滴定实验，以确定这种有效量。一个化合物的有效量将因主体的不同和给药途径的不同而变化。根据不同化合物，给药量可不断输送，如通过连续输送，或每隔一段时间(比如一个或多个分开的时机)。某一特定化合物的多种剂量所需的时间间隔可以通过本领域的技术人员通过适当的实验测得。在一个实施例中，有效量约为1μg/kg-10mg/kg。在另一个实施例中，有效量约为10μg/kg-lmg/kg。在进一步的实施例中，有效量约为100μg/kg。用于与Notch受体蛋白有关的“胞外域”“Extracellulardomain"是指全部或部分(i)存在于细胞外(即既不作为一个跨膜部分也不作为细胞内部分存在)的Notch和(ii)结合到与完整的Notch受体蛋白结合的胞外配体的Notch。Notch的胞外域可以选择性的包括一个信号肽。“胞外域”，“E⑶”和“胞外区”“Ectodomain"是同义的。“半衰期增加部分”是指一部分当其可操作地连接到第二部分，增加第二部分的体内半衰期。半衰期增加部分包括，例如，抗体的Fc部分，糖基化标记(glycosylationtags)(即糖化多肽)，聚乙二醇(PEG)，连接有PEG的多肽及脂质修饰的多肽。“抑制”一种疾病或不良的生物过程的发作意味着减轻这种疾病或过程发作的可能性，或完全防止这种疾病或过程的发作。在优选实施例中，抑制疾病或者过程的发作意味着完全阻止其发作。“Notch”，“Notch蛋白”和“Notch受体蛋白”是同义的。此外，术语“基于Notch的融合蛋白”与“Notch诱饵”(“Notchdecoy”)是同义的。下面的Notch氨基酸序列是已知的，在此列出供参考=Notchl(美国国立卫生研究院维护的基因序列数据库(Genbank)登录号S18188(大鼠))；Notch2(Genbank登录号NP_077334(大鼠))；Notch3(Genbank登录号Q61982(鼠))；和Notch4(Genbank登录号T09059(鼠))。下面的Notch氨基酸序列是已知的，在此列出供参考Notchl(Genbank登录号XM_342392(大鼠)和NM_017617(人类))；Notch2(Genbank登录号NM_024358(鼠)，M99437(人类和AF3O86Ol(人类))；Notch3(Genbank登录号NM_008716(鼠)和XM_009303(人类))；和Notch4(Genbank登录号匪_010汜9(鼠)和NM_004557(人类))。术语“核酸”，“多核苷酸”和“核酸序列”在本申请中互换使用，每个都指的是脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸聚合物。该脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸可以是天然的或人工合成的类似物。“核酸”是指任何核酸，其中包括但不限于，DNA，RNA和其杂交物。形成核酸分子的核酸碱基可以是A，C，T和U碱基，以及其衍生物。这些碱基的衍生物都是本领域公知的，并在PCR系统，试剂和耗材(PerkinElmerCatalogue1996-1997年，罗氏分子系统公司，Branchburg，新泽西州，美国)中有例证。核酸包括但不限于反义分子(anti-sensemolecules)和催化核酸分子，比如核酶(ribozymes)和脱氧核酶(DNAzymes)。核酸也包括为肽类似物，碎片或衍生物编码的核酸，所述衍生物不同于天然存在的形式，为一个或多个氨基酸残基(删除的类似物包含少于全部指定的残基；取代的类似物，其中一个或多个残基被一个或多个残留替换；和加成类似物，其中一个或多个残基添加到肽末端或肽中间部分)，它们具有部分或者全部的天然存在形式的核酸的性质。“可操作地连接”(〃operablyaffixed")是指，对于第一个部分，连接到第二个部分，其连接的方式，允许第一个部分具有其不被连接时的功能(例如结合性能)。术语“多肽”、”肽”和“蛋白质”在本申请中可互换使用，每个都指的是氨基酸残基的聚合物。氨基酸残基可以是天然存在的或其化学类似物。多肽，肽和蛋白质也可以包括比如糖基化、脂质附着、硫酸化、羟基化和ADP-核糖基化作用的变体。本申请中使用的“药学上可接收的载体”，是指与剂型的其他成分相容的并对其接受者无害的载体，包括任何标准的药学上可接受的载体。这些载体包括，例如，0.01-0.IM最好是0.05M的磷酸盐缓冲液或者是0.8%盐水。此外，这些药学上可接受的载体，可以是水或者非水溶液，悬浮液和乳液。非水溶剂比如丙二醇，聚乙二醇，橄榄油等植物油，以及可注射有机酯比如油酸乙酯。水性载体，包括水，酒精/水溶液，乳液和悬浮液，包括盐水和缓冲介质。非肠道途径包括氯化钠溶液，林格氏葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸林格氏和不挥发性油。静脉内途径包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，如以林格氏葡萄糖为基础的物质，及其类似物。防腐剂和其他添加剂也可能存在，例如，抗菌药、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等等。“主体”是指任何有机体，包括但不限于哺乳动物如鼠，大鼠，狗，豚鼠，雪貂，兔子和灵长类动物。在优选实施例中，主体是指人类。“治疗”是指减慢、停止或逆转疾病或紊乱的进程。本申请中，“治疗”也指与疾病或紊乱有关的症状的改善。疾病包括但不限于肿瘤血管生成，动脉粥样硬化，伤口愈合，黄斑变性，早产儿视网膜病变，先兆子痫，糖尿病视网膜病变，缺血，中风，心血管疾病和牛皮癣。在伤口愈合过程中、女性月经周期、子宫内膜重塑，以及在胚胎发育和器官生长中会遇到血管生成。在病理环境中，血管生成在不同疾病，比如类风湿关节炎，牛皮癣，黄斑变性，糖尿病视网膜病变和肿瘤生长中起着重要的作用。目前已经有大量的体内证据，包括临床观察，显示不正常的血管生成与大量的疾病有关，其中包括类风湿性关节炎，炎症，癌症，牛皮癣，退化性眼部疾病等。单位、前缀和符号可以用国际单位制允许的形式表示。除非另有说明，核酸序列都是从左到右5'到3'方向书写，氨基酸序列从左至右按氨基到羧基端的方向书写。氨基酸可以用UPAC-IUB生化命名委员会推荐的公知的三个字母符号或一个字母符号的形式表示。同样，核苷可以用普遍接受的单字母代码表示。以下是在本申请中的缩写E⑶胞外域；IC胞内域；NE⑶/Fe基于Notch的融合蛋白；Nl=Notchl；N2:Notch2；N3:Notch3；N4=Notch4；Dll=Delta样(Delta-like)；EC内皮细胞；FGF成纤维细胞生长因子；FGFR成纤维细胞生长因子受体；HUVEC人类脐静脉内皮细胞；m.ο.i.感染复数；VMC血管壁细胞；VEGF血管内皮细胞生长因子；VEGFR血管内皮细胞生长因子受体；sp信号肽；HC或Hc重链IgG；PDGF血小板衍生生长因子；PlGF胎盘生长因子。发明实施例本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的I-X表皮生长因子重复片段，其中X是12-34的任意整数；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的I-X表皮生长因子重复片段，其中X是1-10的任意整数；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体的胞外域至少12个表皮生长因子重复片段；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的表皮生长因子重复片段，其中至少有12个重复片段；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。在这种融合蛋白的一个实施例中，Notch3受体蛋白的胞外域包括表皮生长因子样重复片段1-34。在这种融合蛋白的一个实施例中，抗体的Fc片段是人类抗体的Fc片段。在这种融合蛋白的一个实施例中，信号肽是Notch3或一个抗体的Hc(HC；重链)片段的信号肽。在一个实施例中，融合蛋白包括连续氨基酸，连续氨基酸的序列在SEQIDN0:32中列出。在另一个实施例中，连续氨基酸的序列在SEQIDN0:33中列出。在一个实施例中，融合蛋白由连续的核苷酸编码，核苷酸的序列在SEQIDNO31中列出。在另一个实施例中，融合蛋白由连续的核苷酸编码，核苷酸的序列在SEQIDNO34中列出。本发明提供一种治疗患有癌症的主体的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以治疗主体，从而治疗患有癌症的主体。本发明提供一种抑制主体血管生成的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制血管生成，从而抑制主体血管生成。本发明提供一种治疗患有卵巢癌的主体的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以治疗主体，从而治疗患有卵巢癌的主体。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗心血管疾病的药物组合物中的应用。在一个实施例中，心血管疾病是动脉粥样硬化、缺血或中风。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用。本发明提供上述融合蛋白在制备用于抑制血管生成的药物组合物中的应用。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗卵巢癌的药物组合物中的应用。本发明提供一种抑制主体生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成。在一个实施例中，病理淋巴管是肿瘤淋巴管生成或者是可能依赖肿瘤淋巴管生成的淋巴结转移。本发明提供一种抑制主体肿瘤转移的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体肿瘤转移。在一个实施例中，肿瘤转移是通过血管、淋巴脉管系统或淋巴结。肿瘤转移是癌症从一个器官扩散到另一个不相邻的器官。本发明提供一种抑制主体继发性肿瘤生长的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体继发性肿瘤生长。也可能是对与继发性或转移性肿瘤相关的肿瘤血管生成的抑制。在一个实施例中，通过与继发性肿瘤相关的血管生成的抑制作用，继发性的肿瘤生长得到抑制。本发明提供一种抑制主体血管被肿瘤共择的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以抑制主体血管被肿瘤共择。血管共择的过程是一个肿瘤细胞与在先存在的血管联合并在共择血管的协助下生长的过程。肿瘤依赖共择血管的生长可能在缺乏、先于或者与肿瘤血管生成一起进行。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。在一个实施例中，VEGF抑制剂是VEGF-A抑制剂、PGIF抑制剂、VEGF-B抑制剂、VEGF-C抑制剂或者VEGF-D抑制剂。VEGF抑制剂的例子包括但不限于贝伐单抗(bevacizumab)，PTK787，Bay43-9006，SUl1248，AG013676，ZD6474，VEGF-诱饵(VEGF-trap)和抗VEGFR2。这些的抑制剂的例子在下列文献中有详细描述Ferrara等，(2004)NatureReviewsDrugDiscovery,Vol.3:391-400和Ellis等.(2008)NatureReviewsCancerVol8:579_591，其目录并入参考文献中。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体的方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。在一个实施例中，VEGF受体抑制剂是VEGFR-I抑制剂，VEGFR-2抑制剂，VEGFR-3抑制剂或任何VEGFR类组合的抑制剂。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的血小板衍生生长因子(PDGF)抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。在一个实施例中，PDGF抑制剂是PDGF-A抑制剂或者PDGF-B抑制剂。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的PDGF受体拮抗剂以治疗患有肿瘤的主体。在一个实施例中，PDGF受体拮抗剂是PDGF受体-B拮抗剂。本发明提供一种治疗患有肿瘤的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白和有效剂量的HER2/neU抑制剂以治疗患有肿瘤的主体。本发明提供一种治疗患有乳腺癌的主体方法，包括给主体采用有效剂量的上述融合蛋白以治疗患有乳腺癌的主体。本发明提供上述融合蛋白在制备用于治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。本发明提供的第一种方法是用于治疗患有癌症的主体，所述方法包括给主体采用有效剂量的物质，这种物质是由Notch受体蛋白的胞外域可操作地连接到半衰期增加的部分组成，从而治疗主体。本发明也提供了第二种方法是用于抑制主体的血管生成，所述方法包括给主体采用有效剂量的物质，这种物质是由Notch受体蛋白的胞外域可操作地连接到半衰期增加的部分组成，从而抑制主体的血管生成。在上述方法的第一个实施例中，Notch受体蛋白是Notchl受体蛋白。在一个实施例中，Notchl受体蛋白是人类Notchl受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述方法的第二个实施例中，Notch受体蛋白是Notch2受体蛋白。在一个实施例中，Notch2受体蛋白是人类Notch2受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述方法的第三个实施例中，Notch受体蛋白是Notch3受体蛋白。在一个实施例中，Notch3受体蛋白是人类Notch3受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述方法的第四个实施例中，Notch受体蛋白是Notch4受体蛋白。在一个实施例中，Notch4受体蛋白是人类Notch4受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述方法的第五个实施例中，主体是哺乳动物。在一个实施例中，哺乳动物是人。在上述方法的第六个实施例中，血管生成是肿瘤血管生成。在第二种方法的进一步的实施例中，主体患有肿瘤。在另一个实施例中，主体患有病理性血管增生。在一个实施例中，病理性血管增生是良性血管瘤。在进一步的实施例中，主体患有淋巴血管增生性疾病。本发明提供了第一种组合物，它是由Notch4受体蛋白的胞外域可操作地连接到半衰期增加的部分组成。在一个实施例中，胞外域是通过共价键结合到半衰期增加的部分上的。在另一个实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。本发明提供了第二种组合物，它包括由Notch4受体蛋白的胞外域可操作地连接到半衰期增加的部分的物质和药学上可接受的载体组成。本发明进一步提供了生产条款，包括(i)一种包装材料，这种材料其中包含Notch受体蛋白的胞外域可操作地连接到一个半衰期增加的部分上的组合物和(ii)一个标签，该标签显示了这种组合物是可通过抑制主体的血管生成用于治疗患有肿瘤或其他疾病的主体。在上述条款的第一个实施例中，Notch受体蛋白是Notchl受体蛋白。在一个实施例中，Notchl受体蛋白是人类Notchl受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述条款的第二个实施例中，Notch受体蛋白是Notch2受体蛋白。在一个实施例中，Notch2受体蛋白是人类Notch2受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述条款的第三个实施例中，Notch受体蛋白是Notch3受体蛋白。在一个实施例中，Notch3受体蛋白是人类Notch3受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述条款的第四个实施例中，Notch受体蛋白是Notch4受体蛋白。在一个实施例中，Notch4受体蛋白是人类Notch4受体蛋白。在另一个实施例中，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例中，抗体的Fc部分是人类抗体的Fc部分。在进一步的实施例中，胞外域和半衰期增加的部分在相同的多肽链内。在上述条款的另一个实施例中，组合物混合了药学上可接受的载体。在最后的实施例中，主体是人。本发明提供了一种编码多肽的可复制的载体，该多肽包括Notch3受体蛋白胞外域可操作地连接到一个半衰期增加的部分上。在一个实施例里面，半衰期增加的部分是抗体的Fc部分。在另一个实施例里面，载体包括但不限于质粒、黏粒、反转录病毒、腺病毒、噬菌体或者YAC。本发明还提供一个宿主载体系统，该系统包括一个可复制的载体，该载体编码一个多肽，该多肽包括Notch受体蛋白的胞外域可操作地连接到一个半衰期增加的部分和一个合适的宿主细胞上。在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞。在另一个实施例中，真核细胞是CHO细胞。在另一个实施例中，真核细胞是HeLa细胞。在进一步的实施例中，宿主细胞是一种细菌细胞。最后，本发明提供了第三种方法，这种方法是生产一种多肽，这种多肽包括增长一个宿主载体系统，该系统包括一个可复制的载体，该载体编码一个多肽，该多肽包括Notch受体蛋白的胞外域可操作地连接到一个半衰期增加的部分和一个合适的宿主细胞上，在允许生产该多肽的条件下进行，并再生所生产的多肽。在下述的详细实验部分将对本发明进行解释说明。这部分是用于帮助理解本发明而不是、也不应该解释为以任何方式对本发明作出限制，本发明的权利要求在详细实验部分的后面提出。详细实验第一部分实骑人类Notch3融合蛋白(Notch诱饵)Notch3诱饵的组装是使用序列编码一个信号肽，一个包含所有ECF样的重复域的Notch3胞外域部分，以及人类Fc蛋白(1-237氨基酸)的一部分。图32显示了人类Notch3的完整的全长核苷酸序列。图33显示了人类Notch3的完整的全长氨基酸序列。利用的信号肽可以是原生Notch3信号肽或者人类Hc信号肽，两者分别融合到一个Notch3域。信号肽允许Notch诱饵蛋白的分泌。使用的Notch3胞外域被设计成与Notch配体结合，并且由人类Notch3蛋白的34EGF样重复域的全部或者子集组成。Fc标记(Fetag)融合到人类Notch3的给定的EGF样重复片段的C端，以便Notch3诱饵蛋白的纯化、监测和稳定。人类Notch3诱饵的总体设计，两种配方，编码为(1)信号肽，以便Notch3诱饵蛋白分泌到真核细胞的胞外媒介，用于产生蛋白；(2)全部人类Notch3的ER；样重复片段的胞外域的一部分，以便与Notch配体关联和(人类Fc蛋白的一部分，以便用于检测。下面描述了人类Notch3诱饵的两种配方，并在图34中表示出来。l)h-Notch3(1-34)诱饵4)h-spHCNotch3(1_34)诱饵人类Notch3序列人类Notch3全长核苷酸(nt)序列，如图32所示，起始于ATG(nt1)，以TGA(nt6964)结束。信号肽和第一个34EGF样重复域在这个序列的nt1-4158得到体现。核苷酸1-4158用于设计人类Notch3诱饵蛋白，在接下来的部分有描述。包含EGF样重复片段1_34的核苷酸有下划线。人类Notch3全长氨基酸(aa)序列，如图33所示，从aal(M为蛋氨酸)，到aa2555(K为赖氨酸)。信号肽和第一个34EGF样重复域在这个序列的aa1-1386得到体现。氨基酸1-1386用于设计人类Notch3诱饵蛋白，在接下来的部分有描述。包含EGF样重复片段1-34的氨基酸有下划线。人类Fc序列用于在Notch3诱饵蛋白上产牛Fc标记图35显示了人类Fc的713核苷酸，被融合到Notch3诱饵构建的3'端，刚好是Notch3EGF样重复片段的下游。人类Fc区域便于Notch诱饵的检测和纯化，并用于稳定分泌的人类Notch3-人类Fc融合蛋白。图36显示了人类Fc的237氨基酸，被融合到所有Notch诱饵构建的C端，刚好是Notch3EGF样重复片段的下游。人类Fc区域便于Notch诱饵的检测和纯化，并用于稳定分泌的人类Notch3-人类Fc融合蛋白。信号肽用于Notch3诱饵蛋白两个不同的信号肽序列被纳入人Notchl诱饵蛋白的设计。第一个是人类Notch3itm，其预计将包含人类Notch3的氨基酸1-40。本测定是采用丹麦科技大学提供的信号IP3.0服务器程序进行的。第二个是人类Hc信号妝，其预计将句,含人IgG重链(HC)信号肽的氨基酸1-22。1.人类Notch3信号肽(ntl-20)MGPGARGRRRRRRPMSPPPPPPPVRALPLLLLLAGPGAA/A(SEQIDNO:27)图37显示了预测的人类Notch3信号肽的氨基酸序列。分析的预测结果是利用丹麦科技大学在线提供的信号IP3.0服务器得到的，如图37所示。这些结果预测位于丙氨酸39(A39)和丙氨酸40(A40)之间的裂解的主要位点。这些裂解位点用“/”在人类Notch3的氨基酸序列1-40中标出，如上所示。2.人类Hc信号肽(aal-22)预测的人类Hc信号肽的氨基酸序列是MWGWKCLLFWAVLVTATLCTA/R(SEQIDNO:29)。预测的人类Hc信号肽的核苷酸序列是分析的预测结果是利用丹麦科技大学在线提供的信号IP3.0服务器得到的，如上所示。这些结果预测位于丙氨酸21(A21)和丙氨酸22(A22)之间的裂解的主要位点。这个裂解位点用“/”在人类Hc的氨基酸序列1-22中标出，如上所示。h-NotchS11^诱饵h-Notchl(1_34)诱饵表示包括Notch3的EGF样重复片段1_；34的人类Notch3诱饵。图41显示了h-N0tch3a_34)诱饵蛋白的氨基酸序列。预测的人类Notch3信号肽有下划线(AA1-40)。Notch3EGF重复片段1_；34被从aa41_1386编码。Fc标记序列为下划线并且斜体。图40显示了h_Notch3(1_34)诱饵蛋白的核苷酸序列。预测的人类Notch3信号肽有下划线(ntl-120)。Notch3EGF重复片段1-；34被从ntl21-4158编码。融合链接点，BglII位点为nt4158到4163。Fc标记序列为下划线并且斜体。Ii-SPlisNotchI11zm诱饵h-spHcNotchl(1-34)诱饵表示包括EGF样重复片段1_；34的人类Notch3诱饵。简写的spHe表示人类Hc信号肽。图42显示了h-Notch3(1_34)诱饵蛋白的氨基酸序列。预测的人类Hc信号肽有下划线(AA1-22)。Notch3EGF重复片段1_；34被从aa22_1386编码。Fc标记序列为下划线并且斜体。图43显示了h-Notch3(1_34)诱饵蛋白的核苷酸序列。预测的人类Hc信号肽有下划线(ntl-66)。Notch3EGF重复片段1-34被从nt67-4104编码。融合链接点，BglII位点为nt4104到4109。Fc标记序列为下划线并且斜体。Tffe人类Notch3诱饵的构建来自于人主动脉平滑肌细胞(aorticsmoothmusclecells)(AoSMC)或过度表达Proxl的人脐静脉内皮细胞(umbilicalvenousendothelialcells)(HUVEC)的总RNA被用于产生人类Notch3诱饵变种。总RNA与M-MLV反转录酶和随机引物或Notch3诱饵特异性引物反转录。合成的cDNA然后和Notch3诱饵特异性上游(正义)引物和下游(反义)引物扩增。Notch3诱饵由4个单独的扩增子构建而来。3-prime扩增子与下游引物一起扩增，该下游引物编码BglII限制位点，在5-prime端连接在Fc序列的BglII位点，以便于产生一个人类Notch3/Fc嵌合体。在Notch3诱饵在核苷酸序列编码EGF样重复片段34后产生融合的情况下，BglII位点将被生成以创造融合位点，提供该融合序列(Notch3，图37)。这适合于形成h-N0tch3a_34)诱饵和h-SpHGN0tch3a_34)诱饵。扩增的PCR产品被亚克隆到epBluescriptSKIIFe，以产生不同的人类Notch3/Fc嵌合体。人类Notch3/Fc诱饵序列然后被穿梭到哺乳动物表达载体(pAd-lox，pCCL或pcDNA3)以便于人类Notch3诱饵蛋白的表达和纯化。第二部分实验材料和方法质粒构建腺病毒构建编码LacZ，全长Notch4，或已如前所述的活化形式的Notch4/int3(Shawber等，2003)。一活化型的NotchlcDNA与6myc标记同框融合(Kopan等，1994)被克隆到腺病毒表达载体，pAd-lox。VEGF165和WE⑶Fc也都被克隆到pAd-lox。如前所述产生并滴定检测了腺病毒家族(Hardy等，1997)。之前已描述，逆转录病毒表达载体pHyTc编码LacZ，Notch4/int3的活化形式，JLDlll和D114(Uyttendaele等，2000,Shawber等，2003，Das等，2004年已出版)。质粒编码Notchl的胞内域(bp5479_7833，Genbank登录号X57405)和D114胞外域(bpl_lM5，Genbank登录号AF253468，由Chiron公司提供)与myc/His标记同框融合，被设计成为pHyTC。NotchIECD，Notch2ECD,Notch3ECD和Notch4ECD被设计到Fe，该Fc包含质粒pCMX-sFRl-IgG，使用了Clin.Exp.Immunol.(1992)87(1):105-110中提出的方法，以创造基于Notch的融合蛋白，即NotchlECD/Fc，Notch2ECD/Fc，Notch3ECD/Fc和Notch4ECD/Fc。腺病毒基因转移在腺病毒感染前，在第三通道的7.5XIO5的HUVEC细胞被接种于I型胶原蛋白涂层的6孔板上。在指示的感染复数下，腺病毒感染与Ad-lacZ，Ad-VEGF165或Ad-NlE⑶Fc一起感染，并且在随机旋转的板子上，在37°C下孵育1小时。荧光素酶报告分析为了测定配体诱导的Notch信号，采用HeLa和四3_衍生的Bosc细胞进行了共同培养实验。通过磷酸钙沉淀进行了瞬时转染实验。1天前以1.5XIO6接种于IOcm板上的Hela细胞与333ng的pBOSNotchl转染，333ng的pGA981_6和83ngpLNCIacZ与666ng的pCMV-Fc或pHyTC-NlECDFc(333ngX1，666ngX2)转染。1天前以4XIO6接种于IOcm板上的Bosc细胞与680ng的pHyiTc-Jaggedl，pHyTc-Dll1，pHyiTc-Dl14，或pHyiTc-X(空载体)进行转染。转染一天后，一式三份(HeLaBosc,12)，细胞在12孔板上共同培养M小时。转染两天后，收获细胞并且采用增强的荧光素酶检测试剂盒(BDPharMingen)进行荧光素酶活性测定，并采用乳光加强试剂盒(Galacto-LightPluskit)(ΡΕBiosysterns)测定半乳糖苷酶的活性。所有的实验都是在Berthold复式喷射光度计下进行的。为了测定VEGF诱导的Notch信号，使用感染了腺病毒的HUVEC。1天前以8.OXIO5接种于6孔板上的HUVEC与Ad-LacZ作为对照或与Ad-VEGF在指示的感染复数下被感染，在存在或不存在Ad-NIECD/Fc的条件下。感染两天后，被感染的HUVEC被重新接种于M孔板的1.5XIO5细胞，一式三份，并培育对小时，然后用转染试剂Oliagen)与12.5ng的PRL-SV40(Promega)和137.5ng的pGA981_6进行转染。转染后1天或者2天，收获细胞，并且采用双荧光素酶报告分析系统(!Iomega)检测荧光素酶的活性。萌芽实骑为了制得胶原蛋白凝胶，猪I型胶原蛋白(Nitta明胶，东京，日本)冰冷溶液与10XRPMI1640培养基以及中和缓冲溶液以811的比例混合。400μ1胶原蛋白凝胶等份加入到M孔板并让凝胶在37°C下放1小时。在腺病毒感染之后(上面)，收获HUVEC并被接种在1.3XIO5细胞/孔胶原蛋白凝胶上面，在M孔板上在0.8ml的EGM2培养基中。种植48小时后HUVEC变得几乎融合。播种后，在1周内每两天改变一次培养基。8天后，用安装了显微镜的奥林巴斯数码相机观察萌芽并拍照。为了将萌芽的数量进行量化，每孔随机选择了5个场，两个观察者用盲法在显微镜下数萌芽的个数。结果与讨论NOTCHECD/Fc融合蛋白作为Notch拮抗剂的功能Notch拮抗剂-NotchECD/Fc融合蛋白我们制得了若干Notch拮抗剂(图幻。我们的策略是融合编码序列到人或者鼠的Fc结构域，所述的编码序列是在胞外域(EOT)的NotchEGF重复片段的编码序列。这个设计制得了没有信号功能但保留了配体结合结构域的分泌蛋白，因此它可以结合并抑制配体功能。我们把这些蛋白称为“NotchECD/Fc”，并且制得了所有四个N0tchl-4ECD/Fc。Fc结构域促进了采用免疫印迹法或者免疫组织化学法进行的亲和纯化和蛋白检测。测定Notch抗体—个体外共培养系统(图幻用于测定Notch途径的转录活性，该体外共培养系统有表达于一个细胞的配体和活性标记在另一个细胞的Notch受体。我们利用这个共培养实验来显示NotchIE⑶/Fe对配体依赖的Notch信号起阻碍作用(图4)。NlE⑶/Fe表达载体以不同的比率与全长Notchl和在Hela细胞中报告的CSL-荧光素酶共转染，然后与表达293细胞的配体共培养。我们观察到，Notch配体的Notchl信号的活化作用被WE⑶/Fe表达减弱。这种效应显示出了浓度依赖性，NlE⑶/Fe与Notchl以21的比率时比11的比率时能更有效抑制信号。NotchlECD/Fc能由Jaggedl，Delta样l(Delta-like1)或Delta样4(Delta-like4)介导阻碍信号。表汰和纯化Notch拮抗剂为了纯化蛋白的目的，通过使用逆转录病毒载体我们制得了CHO和HeLa细胞系表达NotchECD/FCs。N1ECD/Fc被分泌(图5)，见收集于HeLa-NotchECD/Fc系的条件培养基，并用蛋白-A(pA)琼脂糖进行纯化。pA纯化样品(Sup)和整个细胞溶解产物(Lys)都与α-Fc抗体一起进行免疫印迹，(图5，Α)证明NlE⑶/Fe被分泌到培养基。NotchE⑶/Fe的腺病毒载体被用于感染HeLa细胞，并且来自于这些细胞的溶解产物都与α-Fc抗体一起进行免疫印迹，证明他们表达NotchE⑶/Fe(1，2，3，4)蛋白(图5，Β)。我们目前正在用pA亲和色谱法纯化来自于CHO细胞条件培养基的NIECD/Fc。使用Notch融合蛋白定义血管牛成抑制Notch信号的活化作用可以诵过#用CBFl启动子活件来检测丨通过测量CBFl启动子的转录活性，可以测量Notch信号功能，CBFl启动子是通过Notch-IC与CBFl的结合而被激活。我们在HUVEC中测定CBFl启动子活性，该HUVEC与在不同的感染复数(MOI)下的腺病毒编码的VEGF-165进行感染(图6)。CBFl启动子的诱导作用在Ad-VEGF感染的HUVEC中可以清楚检测到，相对于Ad-LacZ-感染的细胞在MOI上的依赖行为。这个数据显示VEGF的过度表达可以活化HUVEC中的Notch信号。因此，VEGF诱导了Notch信号的活性。我们想考察Notch融合蛋白是否会阻碍Notch信号的VEGF诱导的活化作用。Ad-Notch融合蛋白与Ad-VEGF的共同感染明显的减小了由Ad-VEGF单独感染诱导的CBFl启动子活性的活化作用(图7)。在每个腺病毒在感染复数为40的感染的情况下(图7，A)，发现报告基因转染后M小时时有60%的抑制，48小时时有90%的抑制，同样Notch诱饵的抑制活性取决于基于Ad-Notch融合蛋白的感染复数。Notch融合蛋白阻碍由VEGF诱导的血管牛成萌芽的启动在本实验中，我们用HUVEC中过度表达的VEGF-165评估了Notch诱饵对萌芽(萌芽的启动)诱导的影响。当Ad-VEGF感染的HUVEC在胶原蛋白凝胶中培养8天，在胶原蛋白凝胶中萌芽被诱导。过度表达VEGF的萌芽诱导作用被腺病毒编码的Notch融合蛋白的共同感染明显抑制(图8)。Ad-Notch融合蛋白自身在形态上几乎没有影响。在图9中我们采用显微镜对每场的萌芽进行了计数。Ad-VEGF感染进入HUVEC增加了萌芽数，取决于所采用的感染复数。Ad-VEGF诱导的萌芽被明显抑制。这些数据表明，VEGF通过Notch信号的活化作用诱导了HUVEC的萌芽，并且Notch融合蛋白能抑制VEGF诱导的萌芽。第二部分实验中引用的参考文献1.Artavanis-Tsakonas,S.，K.Matsuno,andΜ.Ε.Fortini.1995.Notchsignaling.Science268:225-232.2.Bailey,A.M.，andJ.W.Posakony.1995.SuppressorofhairlessdirectlyactivatestranscriptionofenhancerofsplitcomplexgenesinresponsetoNotchreceptoractivity.Genes&Development9:2609-22.3.Bettenhausen,B.，M.HrabedeAngelis,D.Simon，J.L.Guenet,andA.Gossler.1995.TransientandrestrictedexpressionduringmouseembryogenesisofDII，amurinegenecloselyrelatedtoDrosophilaDelta.Development1212407-18.4.Blaumueller,CM.，H.Qi,P.Zagouras,andS.Artavanis-Tsakonas.1997.IntracellularcleavageofNotchleadstoaheterodimericreceptorontheplasmamembrane.Cell90:281-91.5.Caronti，B.，L.Calandriello，A.Francia，L.Scorretti，M.Manfredi，T.Sansolini，Ε.M.Pennisi，C.Calderarο，andG.Palladini.1998.Cerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleucoencephalopathy(CADASIL).Neuropathologicalandinvitrostudiesofabnormalelastogenesis.ActaNeurolScand.98:259-67.6.Desmond，D.W.，J.T.Moroney,T.Lynch,S.Chan，S.S.Chin，D.C.Shungu,A.B.Naini，andJ.P.Mohr.1998.CADASILinaNorthAmericanfamily:clinical，pathologic，andradiologicfindings[seecomments].Neurology51:844-9.7.Dunwoodie，S.L.，D.Henrique，S.M.Harrison，andR.S.Beddintron.1997.MouseD113:anoveldivergentDeltagenewhichmaycomplementthefunctionofotherDeltahomologuesduringearlypatternformationinthemouseembryo.Development124:3065-76.8.Eastman，D.S.，R.Slee，E.Skoufοs,L.Bangalore，S.Bray,andC.Delidakis.1997.SynergybetweensuppressorofHairlessandNotchinregulationofEnhancerofsplitmgammaandmdeltaexpression.MolCellBiol.17:5620-5634.9.Fortini，Μ.E.，andS.Artavanis-Tsakonas.1993.Notch!neurogenesisisonlypartofthepicture.Cell75:1245-7.10.Gale，N.W.，andG.D.Yancopoulos.1999.Growththctorsactingviaendothelialcell-specificreceptortyrosinekinasesVEGFs,Angiopoietins，andephrinsinvasculardevelopment.GenesandDevelopment13:1055-1066.ILGallahan，D.，andR.Callahan.1997.ThemousemammarytumorassociatedgeneINT3isauniquememberoftheNOTCHgenefamily(N0TCH4).Oncogene141883-90.12.Greenwald,I.1994.Structure/functionstudiesoflin-12/Notchproteins.CurrentOpinioninGenetics&Development4:556-62.13.Greenwald，I.1998.LIN-12/Notchsignaling:lessonsfromwormsandflies.GenesDev.12:1751-62.14.Henderson，A.M.，S.J.Wang,A.C.Taylor,M.Aitkenhead，andC.C.W.Hughes.2001.Thebasichelix-loop-helixtranscriptionfactorHESRlregulatesendothelialcelltubeformation.JBiolChem.276:6169-6176.15.Hicks,C，S.H.Johnston，G.diSibio，A.Collazo，T.F.Vogt,andG.Weinmaster.2000.FringedifferentiallymodulatesJaggedlandDeltalsignallingthroughNotchlandNotch2.NatureCellBiology2:515-520.16.Hsieh，J.J.，Τ.Henkel,P.Salmon，Ε.Robey,Μ.G.Peterson，andS.D.Hayward.1996.TruncatedmammalianNotchlactivatesCBF1/RBPJk-repressedgenesbyamechanismresemblingthatofEpstein-BarrvirusEBNA2.Molecular&CelllularBiology16:952-9.17.Hsieh,J.J.，D.Ε.Nofziger,G.Weinmaster,andS.D.Hayward.1997.Epstein-Barrνirusimmortaliζation:Notch2interactswithCBFlandblocksdifferentiation.JVirol.71:1938-45.18.Jarriault，S.，C.Brou，F.Logeat,E.H.Schroeter,R.Kopan，andA.Israel.1995.SignalingdownstreamofactivatedmammalianNotch.Nature377355-358.19.Joutel，A.，F.Andreux,S.Gaulis,V.Domenga，M.Cecillon，N.Battail，N.Piga，F.Chapon,C.Godfrain，andE.Tourmier-Lasserve.2000.TheectodomainoftheNotch3receptoraccumulateswithinthecerebrovasculatureofCADASILpatients[seecomments].JClinInvest.105:597-605.20.Joutel,A.，C.Corpechot，A.Ducros，K.Vahedi,H.Chabriat，P.Mouton，S.Alamowitch,V.Domenga,M.Cecillion，E.Marechal,J.Maciazek，C.Vayssiere,C.Cruaud,E.A.Cabanis，Μ.M.Ruchoux，J.Weissenbach,J.F.Bach，M.G.Bousser,andE.Tournier-Lasserve.1996.Notch3mutationsinCADASIL，ahereditaryadult-onsetconditioncausingstrokeanddementia.Nature383:707-10.21.Kopan,R.，Ε.H.Schroeter,H.Weintraub,andJ.S.Nye.1996.SignaltransdnctionbyactivatedmNotchimportanceofproteolyticprocessinganditsregulationbytheextracellulardomain.ProcNatlAcadSciUSA93:1683-8.22.Krebs,LT.，Y.Xue,CR.Norton，J.R.Shutter，M.Maguire，J.P.Sundberg，D.Gallahan,V.Closson，J.Kitajewski,R.Callahan，G.H.Smith，K.L.Stark，andT.Gridley.2000.Notchsignalingisessentialforvascularmorphogenesisinmice.GenesandDevelopment14:1343-1352.23.Lardelli,M.,J.Dahlstrand,andU.Lendahl.1994.ThenovelNotchhomologuemouseNotch3lacksspecificepidermalgrowthfactor-repeatsandisexpressedinproliferatingneuroepithelium.MechanismofDevelopment46123-136.24.Lawso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)实验(19)中，过度表达VEGF121的293细胞Q93/VEGF)的稳定转染显著诱导了体内血管生成(图25A，左图)。该VEGF诱导的血管生成被WE⑶Fc的共同表达所抑制，相对于单独^3/VEGF(图25A)。测量了血管密度，并且在图25B中给出了血管生成指数，显示了^3/VEGF诱导的血管生成被⑶Fc的共同表达所抑制(图25B)。此外，鼠背部气囊实验(DAS)(19)中，人类乳腺癌细胞系，MDA_MB_231，显著诱导了体内血管生成，根据推测可能是通过VEGF的分泌来实现的(图25C，左图)。这个VEGF诱导的血管生成明显被WE⑶Fc的腺病毒调节表达所抑制，相对于腺病毒表达LacZ(图25C)。测量了血管密度，并且在图25D中给出了血管生成指数，显示了MDA-MB-231诱导的血管生成被NlE⑶Fc的表达所抑制。Flkl对于血管生成是一个主要的积极信号转导者，它通过在胚胎中的强大的酪氨酸激酶活性转导，而Fltl被认为是对于血管生成来说是一个消极的信号转导者。但是，在成年鼠中，Flt-I被证明是一个积极的角色，由于在缺乏细胞质Flt-I激酶结构域的小鼠身上，LLC过度表达P1GF2的体内生长被严重地损害00)。Notch可能通过诱导Flt-I信号而改变VEGF信号和中和Flk-I信号起作用，要么诱导丝状伪足扩展或者加强血管生成萌芽，由于PIGF/Flt-Ι信号改变了Flk-I的磷酸化位点，并加强缺血心肌的血管生成Ql)。有趣的是，Notch信号也上调了PlGF表达(图四)。但是，Notch信号的连续激活抑制了多细胞含腔血管生成萌芽的形成，就像以前报道的那样0幻。Notch信号在萌芽或者丝状伪足形成后应该关闭，并且Notch途径可能需要瞬时激活。在胰腺β细胞癌变的转基因老鼠模型(RiplTag2鼠)，其肿瘤血管生成是VEGF依赖的，VEGF表达水平没有增加，但是出现了储存在基质中的胞外VEGF到VEGF受体的移动。MMP-9引起了这个移动的发生，并且，在RiplTag23MMP-9-null双转基因小鼠身上，肿瘤生长被抑制。Notch上调MMP-9表达，并且可能增加血管生成萌芽位点局部的VEGF水平。Notch同时上调MTl-MMP表达，胞外MMP-2可能以Notch激活的内皮细胞的细胞膜为靶点。Notch可能通过调节明胶酶活性和VEGF浓度来决定血管生成萌芽的位点。由于内皮的MMP-9被肺特定转移的Flt-I所调节00)，Flt-I可能间接参与了MMP-9的诱导。第三部分实验中弓I用的参考文献1.Artavanis-TsakonasS,RandMD,LakeRJ.NotchSignaling:CellFateControlandSignalIntegrationinDevelopment.Science1999；284(5415):770-776.2.ShawberCJ,J.K.Notchfunctioninthevasculature:insightsfromzebrafish,mouseandman.Bioessays.2004；26(3):225-34.3.UyttendaeleH,HoJ,RossantJ,J.K.VascularpatterningdefectsassociatedwithexpressionofactivatedNotch4inembryonicendothelium.ProcNatlAcadSciUSA.2001；98(10):5643-8.4.LawsonND,VogelAM,BM.W.sonichedgehogandvascularendothelialgrowthfactoractupstreamoftheNotchpathwayduringarterialendothelialdifferentiation.DevCell2002；3(1):127-36.5.LiuZJ,ShirakawaΤ,LiY,SomaA,OkaM,DottoGP,etal.RegulationofNotchlandD114byvascularendothelialgrowthfactorinarterialendothelialcells!implicationsformodulatingarteriogenesisandangiogenesis.MolCellBiol.2003；23(1):14-25.6.GaleNff,DominguezMG,NogueraI,PanL,HughesV,ValenzuelaDM,etal.Haploinsufficiencyofdelta-like41igandresultsinembryoniclethalityduetomajordefectsinarterialandvasculardevelopment.ProcNatlAcadSciUSA.2004；101(45):5949-54.7.MontesanoR，L0.Phorbolestersinduceangiogenesisinvitrofromlarge-vesselendothelialcells.JCellPhysiol.1987；130(2):284-91.8.JarriaultS，BrouC，LogeatF，SchroeterEH,KopanR，A.I.SignallingdownstreamofactivatedmammalianNotch.Nature.1995；377(6547):355-8.9.SmallD，KovalenkoD，KacerD，LiawL，LandriscinaM，DiSerioC，etal.SolubleJaggedlrepressesthefunctionofitstransmembraneformtoinducetheformationoftheSrc-dependentchord-likephenotype.JBiolChem2001；276(34):32022-30.10.GerhardtH，GoldingM，FruttigerM，RuhrbergC，LundkvistA，AbramssonA，etal.VEGFguidesangiogenicsproutingutilizingendothelialtipcellfilopodia.JCellBiol2003；161(6):1163-77.11.KoolwijkP,vanErckMG，deVreeWJiVermeerMA，WeichHA，HanemaaijerR，etal.CooperativeeffectofTNFalpha,bFGF,andVEGFontheformationoftubularstructuresofhumanmicrovascularendothelialcellsinafibrinmatrix.Roleofurokinaseactivity.JCellBiol1996；132(6):1177-88.12.DasI,CraigC,FunahashiY,JungKM,KimTW,ByersR，etal.Notchoncoproteinsdependongamma-secretase/presenilinactivityforprocessingandfunction.JBiolChem2004；279(29):30771-80.13.NosedaM，ChangL，McLeanG，GrimJE,ClurmanBE，SmithLL,etal.Notchactivationinducesendothelialcellcyclearrestandparticipatesincontactinhibition:roleofp21Ciplrepression.MolCellBiol2004；24(20):8813-22.14.TaylorKL,HendersonAM，CC.H.NotchactivationduringendothelialcellnetworkformationinvitrotargetsthebasicHLHtranscriptionfactorHESR-IanddownregulatesVEGFR-2/KDRexpression.MicrovascRes2002；64(3)372-83.15.ItokawaT，NokiharaH，NishiokaY，SoneS，IwamotoY，YamadaY，etal.AntiangiogeniceffectbySU5416ispartlyattributabletoinhibitionofFlt-Ireceptorsignaling.MolCancerTher2002；1(5):295-302.16.PepperMS.Roleofthematrixmetalloproteinaseandplasminogenactivator-plasminsystemsinangiogenesis.ArteriosclerThrombVaseBiol2001；21(7):1104-17.17.SeikiM，KoshikawaN，I.Y.Roleofpericellularproteolysisbymembrane-typelmatrixmetalloproteinaseincancerinvasionandangiogenesis.CancerMetastasisRev2003；22(2-3):129-43.18.YamamotoM，TsujishitaH，HoriN，OhishiY，InoueS,IkedaS,etal.Inhibitionofmembrane-type1matrixmetalloproteinasebyhydroxamateinhibitors:anexaminationofthesubsitepocket.JMedChem1998；41(8):1209-17.19.FunahashiY，WakabayashiT，SembaT，SonodaJ，KitohK，K.Y.Establishmentofaquantitativemousedorsalairsacmodelanditsapplicationtoevaluateanewangiogenesisinhibitor.OncolRes.1999；11(7)319-29.20.HiratsukaS,NakamuraK,IwaiS,MurakamiM，ItohT,KijimaH,etal.MMP9inductionbyvascularendothelialgrowthfactorreceptor-1isinvolvedinlung-specificmetastasis.CancerCell2002；2(4):289-300.21.AutieroΜ,WaltenbergerJ,CommuniD,KranzA,MoonsL,LambrechtsD,etal.RoleofPlGFintheintra-andintermolecularcrosstalkbetweentheVEGFreceptorsFltlandFlkl.NatMed2003；9(7):936-43.22.LeongKG,HuXLL,NosedaM,LarriveeB,HullC,HoodL,etal.ActivatedNotch4inhibitsangiogenesis:roleofbeta1-integrinactivation.MolCellBiol2002；22(8):2830-41.23.BergersG,BrekkenR,McMahonG,VuΤΗ,ItohΤ,TamakiK,etal.Matrixmetalloproteinase-9triggerstheangiogenicswitchduringcarcinogenesis.NatCellBiol2000；2(10):737-44.第四部分实骑Notch蛋白和配体在血液和淋巴管内皮细胞中的表汰对由HMVEC纯化得到的淋巴管内皮细胞(LEC)和血液内皮细胞(BEC)的RNA中的Notchl-4，Dill,D114和Jaggedl进行了RT-PCR实验。如图44所示，Notchl,Notch2,Notch4，D114和Jaggedl在BEC和LEC都有相似水平的表达。Notch3的表达看似被限定在LEC,暗示Notch3信号在淋巴管内皮细胞中起作用。在胚胎的胚龄13.5天，Notch3与淋巴管内皮细胞标记LYVE-I和Proxl—起共同表汰胚龄13.5天的小鼠胚胎的10微米的连续切片被LYVE-I，Proxl或Notch3免疫染色。如图45所示，Notch3被表达在同时表达了淋巴管内皮细胞标记LYVE-I和Proxl的细胞上。在血管内皮细胞中Proxl诱导Notch3表达检验了ftOxl的异位表达是否会改变Notch蛋白或者配体的表达。如图46所示，A部分，腺病毒感染Ad-Proxl或Ad-LacZM小时后，HUVEC总RNA被分离，并进行了Notchl-4，D114和Jaggedl的定量RT-PCR。Prox-I有力地上调了Notch3的表达。Notchl、Notch2、Notch4、D114和Jaggedl表达没有被明显地影响。如图46所示，B部分，化合物E(cE)，抑制Notch信号的早老素(I^resenlin)抑制剂，在Ad-LacZ或Ad-Proxl感染的HUVEC中孵育M小时。分离总RNA，并做了定量RT-PCR实验以便于测定Notch3的表达。Proxl诱导Notch3的表达，而且这个诱导通过添加化合物E而被抑制。这表明Notch3的Proxl诱导取决于Notch信号的活化作用。在血液内皮细胞中Proxl诱导Notch靶向基因HUVEC被腺病毒编码、1^02、1^(1、附1(或附八1^-3感染，感染M小时后分离总RNA。为了测定内皮的Notch靶向基因、VEGFR-3、EphrinB2、Hey1和Hey2，进行了定量RT-PCR实验。与Notchl和Notch4信号活化作用相似，Proxl诱导了所有4个基因(图47，A部分和B部分)。Heyl和Hey2在淋巴管内皮细胞中的表达未知。Proxl诱导Notch靶向基因取决于在血液内皮细胞中的Notch信号HUVEC被腺病毒编码、LacZ,ProxUNlIc或N4/int-3感染。化合物E(cE)，抑制Notch信号的早老素抑制剂，在Ad-LacZ或Ad-Prox1感染的HUVEC中孵育M小时，然后分离总RNA。为了测定内皮的Notch靶向基因、VEGFR-3、EphrinB2和Hey2，进行了定量RT-PCR实验。介导的诱导Notch靶向基因、印hrinB2、VEGFR-3和Hey2被抑制，通过添加Notch信号抑制剂化合物E，如图48所示。因此，Proxl通过Notch调节印hrinB2、VEGFR_3和Hey2的表达。·第五部分实骑
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：要深入了解Notch在血管平衡中的作用，可以从人神经血管疾病，伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病(CADASIL)谈起。在大多数患者中，已经发现CADASIL与Notch3的错义突变有关。CADASIL是一种迟发性的(平均发病年龄45岁)常染色体显性遗传疾病，它的特征有偏头痛，经常性中风，导致精神症状，逐渐认知衰退，痴呆和死亡(81)。这些神经病理症状出现继发于缓慢发展动脉病，与脑动脉和细动脉周围的血管平滑肌细胞的解体和破坏有关。血管平滑肌细胞的退化与血管壁的厚度减少、细胞外基质的损失和血管壁薄弱有关(82)。在血管平滑肌细胞，有Notch3的胞外域的积累和在细胞外基质中，颗粒的异常沉积被称为颗粒状渗透材料(GOM)(83)。在这种疾病中，动脉病变并不仅限于大脑，还在皮肤和视网膜动脉发现(83_85)。CADASIL表型与Notch3在血管平滑肌细胞中的表达有关(7°’81)。假说认为，Notch3对保持血管平滑肌细胞与动脉内皮细胞的相互作用或者联系起着作用。最近的一项研究在转基因的小鼠身上重新创造了CADASIL血管病理学说，这种小鼠在血管平滑肌细胞表达Notch3转基因编码CADASILR90C突变(86)。这些小鼠的脉管系统显示了经典的CADASIL动脉病，包括GOM沉积和Notch3累积。但是，这些特点通过停泊干扰和血管平滑肌细胞粘附到相邻细胞并且血管平滑肌细胞退化而被预见。因此，CADASIL是因为降低血管平滑肌细胞的接触和活力，另外GOM沉积和Notch3胞外域的累积是细胞退化的次生结果。与Notch3在细胞存活中的角色一致，在大鼠主动脉平滑肌细胞中的Notch3的组成型激活形式的表达导致cFlip诱导，cFlip是Fas依赖的凋亡的拮抗剂(87)。此外，Heyl在培养的血管平滑肌细胞的异位表达促进了细胞存活，通过Akt因此抑制凋亡响应血清饥饿和Fas配体(88)。总的来说，这些数据显示，Notch3通过促进血管平滑肌细胞存活来维持动脉血管动态平衡。由于血管平滑肌细胞的死亡或血管平滑肌细胞未能传达给邻近血管内皮细胞将可能引起动脉血管壁的泄漏。小鼠Notch3活性的破坏，可能有助于确定这一缺陷的性质。CADASIL突变Notch3蛋白的特定活性目前仍然了解很少。一项解释突变的Notch3功能的体外研究显示，截去了细胞质的Notch3能抑制或者激活CSL转录因子(89_9(1)。Notch信号在血管平滑肌细胞中的活化作用导致胚胎死亡Notch3在血管周围细胞、平滑肌细胞和周细胞中表达和激活。平滑肌细胞对心血管功能非常重要，他们必须是健康的以便于防止中风。周细胞能有助于肿瘤血管生长。Notchl和Notch4被认为在这些细胞型中不起作用。因此这里描述的Notch3融合蛋白可能通过阻止不正常的Notch3活性从而有助于防止中风。此外，Notch3融合蛋白可能通过调节周细胞功能而被用于保持血管平滑肌细胞、抑制肿瘤周细胞的生长或其功能、或者影响视网膜血管生成。我们已经构建了一个转基因的老鼠，该老鼠在组织中在延伸因子Ι-α启动子(EFla)的控制下表达活化形式的Notchl(N1IC)，该组织表达Cre-重组酶，即EFlαN1IG/+(图49)。EF1αN11…能养活并且繁殖能力强(图50)。我们通过用SM22-Cre老鼠系(SM22Cre/+)跨过EFlαN1IC/+的方法在血管平滑肌细胞中表达miC。结果SM22gW+；EFlαN1IC/+双转基因的鼠在胚胎发育的9.5天死亡(图50)。SM22&eA;EFlaN11…胚胎表现出了心肌缺陷，我们认为是胚胎死亡的原因。与这些心肌平滑肌细胞缺陷一致，在胚胎发育9.5天，SM22GW+;EFlaN11…转基因动物中，我们观测到了血管平滑肌细胞标记，α平滑肌细胞肌动蛋白的表达的改变(图51)。这些结果证明，在血管平滑肌细胞中增加的Notch信号破坏了胚胎心脏血管发育。第五部分实验中引用的参考文献81.ViitanenM,KaIimoH.CADASIL:Hereditaryarteriopathyleadingtomultiplebraininfarctsanddementia.Ann.N.Y.Acad.Sci.2000；903:273-84.82.BrulinP,GodfraindC,LeteurtreΕ,RuchouxMM.MorphometricanalysisofultrastructuralvascularchangesinCADASILanalysisof50skinbiopsyspecimensandpathogenicimplications.Acta.Neuropathol.2002；104:241-8.83.UyamaΕ,TokunagaΜ,SuenagaA,KotoriiS,KamimuraK,TakahashiK,TabiraΤ,UchinoΜ.Argl33CysmutationofNotch.3intwounrelatedJapanesefamilieswithCADASIL.Intern.Med.2000；39(9):732-7.84.JoutelA,FavroleP,LabaugeP,ChabriatH,LescoatC,AndreuxF,DomengaV,CecillonM,VahediK,DucrosAandothers.SkinbiospyimmunostainingwithaNotch3monoclonalantibodyforCADASILdiagnosis.Lancet2001；358:2049-51.85.SmithBff,HenneberryJ,ConnollyT.SkinbiopsyfindingsinCADASIL.Neurology2002；59(6):961.86.RuchouxMM,DomengaV,BrulinP,MaciazekJ,LimolS,Tournier-LasserveE,JoutelA.TransgenicmiceexpressingmutantNotch3developvascularalterationscharacteristicofcerebralautosomaldominantarteriopathywithsubcorticalinfarctsandleuckoencephalopathy.Am.J.Path.2003；162(1):329-42.87.WangW,PrinceCZ,MouY,PollmanMJ.Notch3signalinginvascularsmoothmusclecellsinducesc-FLIPexpressionviaERK/MAPKactivation.JBiolChem2002；277(24):21723-9.88.WangW,PrinceCZ,HuX,PollmanMJ.HRTlmodulatesvascularsmoothmuscleeel!proliferationandapoptosis.BiochemBiophysResCommun2003；308(3)596-601.89.BeatusP,LundkvistJ,ObergC,LendahlU.TheNotch3intracellulardomainrepressesNotchl-mediatedactivationthroughHairy/Enhancerofsplit(HES)promoters.Development1999；126(17):3925-35.90.SaxenaMT,SchroeterEH,MummJS,KopanR.Murinenotchhomologs(Nl—4)undergopresenilin—dependentproteolysis.J.Biol.Chem.2001；276(43):40268-73.权利要求1.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的I-X表皮生长因子重复片段，其中X是12-34的任意整数；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。2.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的I-X表皮生长因子重复片段，其中X是1-10的任意整数；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。3.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体的胞外域的至少12个表皮生长因子重复片段；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。4.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的表皮生长因子重复片段，其中至少存在12个重复片段；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的融合蛋白，其特征在于所述抗体的Fc片段是人抗体的Fc片段。6.根据权利要求1-4中任意一项所述的融合蛋白，其特征在于所述信号肽是Notch3信号肽或IgG重链信号肽。7.根据权利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于=Notchl受体蛋白胞外域包括EGF样重复片段1-.8.根据权利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含连续氨基酸，其序列如SEQIDNO32所示。9.根据权利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白包含连续氨基酸，其序列如SEQIDN0:33所示。10.根据权利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白由连续核苷酸编码，连续核苷酸的序列如SEQIDN0:31所示。11.根据权利要求1、3或4所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白由连续核苷酸编码，连续核苷酸的序列如SEQIDN0:34所示。12.—种治疗患有肿瘤的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以治疗主体，从而治疗患有肿瘤的主体。13.—种抑制主体血管生成的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主体血管生成。14.一种治疗患有卵巢癌的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以治疗主体，从而治疗患有卵巢癌的主体。15.一种治疗代谢紊乱的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以治疗主体，从而治疗代谢紊乱的主体。16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述代谢紊乱包括糖尿病、肥胖、动脉硬化、缺血、中风或心血管疾病。17.权利要求1-11所述的融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的应用。18.权利要求1-11所述的融合蛋白在制备用于抑制血管生成的药物组合物中的应用。19.一种抑制主体生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主体生理淋巴管生成或者病理淋巴管生成。20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述病理淋巴管生成是肿瘤淋巴管生成或者淋巴结转移。21.—种抑制主体肿瘤转移的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主体肿瘤转移。22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于所述转移的发生是通过血管、淋巴脉管系统或者淋巴结。23.—种抑制主体继发性肿瘤生长的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主体继发性肿瘤生长。24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于通过对与继发性肿瘤有关的血管生成的抑制作用抑制继发性肿瘤生长。25.—种抑制主体血管被肿瘤共择的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以抑制主体血管被肿瘤共择。26.一种治疗患有癌症的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白和有效剂量的血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂以治疗患有癌症的主体。27.根据权利要求沈所述的方法，其特征在于所述的VEGF抑制剂是VEGF-A抑制剂、PGIF抑制剂、VEGF-B抑制剂、VEGF-C抑制剂或VEGF-D抑制剂。28.一种治疗患有癌症的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白和有效剂量的VEGF受体抑制剂以治疗患有癌症的主体。29.根据权利要求四所述的方法，其特征在于所述的VEGF受体抑制剂是VEGFR-I抑制剂、VEGFR-2抑制剂或VEGFR-2抑制剂。30.一种治疗患有癌症的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白和有效剂量的血小板衍生生长因子(PDGF)抑制剂以治疗患有癌症的主体。31.根据权利要求30所述的方法，其特征在于所述的血小板衍生生长因子抑制剂是PDGF-A抑制剂或PDGF-B抑制剂。32.—种治疗患有癌症的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白和有效剂量的PDGF受体拮抗剂以治疗患有癌症的主体。33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于所述的PDGF受体拮抗剂是PDGF受体B拮抗剂。34.一种治疗患有癌症的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白和有效剂量的HER2/neU抑制剂以治疗患有癌症的主体。35.一种治疗患有乳腺癌的主体的方法，其特征在于给主体采用有效剂量的权利要求1-11所述的融合蛋白以治疗患有乳腺癌的主体。36.权利要求1-11所述的融合蛋白在制备用于治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。全文摘要本发明提供一种融合蛋白，这种融合蛋白包含一个信号肽；人类Notch3受体蛋白的胞外域的1-X表皮生长因子重复片段，其中X是12-34的任意整数；以及一个与之结合的抗体的Fc片段。本发明还提供一种治疗患有肿瘤的主体的方法；一种在主体内抑制血管生成的方法；一种治疗患有卵巢癌的主体的方法；以及一种治疗主体代谢紊乱的方法，这些方法包括给予主体一定有效量的上述融合蛋白来治疗主体。本发明进一步提供上述融合蛋白在制备用于治疗肿瘤、抑制血管生成、治疗卵巢癌以及治疗代谢紊乱的药物组合物中的应用。文档编号A61K39/00GK102131520SQ200980133121公开日2011年7月20日申请日期2009年8月21日优先权日2008年8月22日发明者卡丽·肖波尔,简·基塔吉斯科申请人:纽约哥伦比亚大学理事会