专利名称：炎症的治疗的制作方法
炎症的治疗发明领域本发明涉及治疗炎症的产品和方法以及治疗手段，所述炎症例如炎性肠病，尤其是溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(Crohn’ s disease, CD)，更尤其是暴发型溃疡性结肠炎和克罗恩病。
背景技术：
暴发型溃疡性结肠炎即溃疡性结肠炎的恶化，表现为白血球数升高和剧烈腹痛。 目前用高剂量类固醇来治疗暴发型溃疡性结肠炎。抗-TNFa的治疗也已进入三期研究。这两类药都是炎症抑制剂。它们的有效率约为50%，但有严重的副作用。甚至，曾经治愈的暴发型溃疡性结肠炎仍有复发的可能。在对药物治疗无反应的暴发型溃疡性结肠炎的患者中，及时的手术干预刻不容缓。溃疡性结肠炎通常见于大肠(结肠)。终极手段之一是切除结肠和迴肠造口。至少6 个月的恢复期后，期间有时还包括对直肠残端炎症的药物治疗，大多数患者还需接受迴肠直肠吻合术或骨盆囊腔(pelvic pouch)修复术来恢复肠道的连续性。两种手术都会造成每天6次左右的腹泻，并导致水和矿物质失衡。克罗恩病也会有暴发性发作(暴发型克罗恩结肠炎)，也属重症，需要立即进行药物和/或手术干预。虽说炎症可能位于克罗恩病患者胃肠道的任何部位，但通常多发于小肠的终末端和大肠的起始端(迴肠区)。虽然例如类固醇和硫唑嘌呤(aza-thioprine)等消炎药能够缓解症状，但药物治疗无法治愈该病。50%的患者需要再狭窄切除术后造瘘手术，其中半数复发而需要再手术。因此，亟需一种能够特异性消除患者IBD中的炎症从而避免复发的方法。W02008/038785描述了一种细胞吸附柱，能够从血液中分离去除细胞和细胞因子， 所述细胞尤指白细胞和癌细胞。
发明内容
炎性肠病表现为受患肠道内的炎症和白细胞浸润。
趋化因子是参与炎症中细胞聚集和活化的一类细胞因子。趋化因子造成免疫系统内各种细胞亚群的趋化性和活化。趋化因子的活性是通过紧密结合其位于白细胞表面的受体来介导的。本发明是基于实现了以下发现可利用趋化因子与表达其受体的细胞之间的相互作用来治疗炎症，尤其是表现为趋化因子受体表达细胞向炎症部位聚集增强的慢性炎症。因此，本发明能够减少炎性因子高表达诱导所致的炎性白细胞向炎症部位聚集。这是通过用促炎趋化因子来捕捉患者的促炎白细胞而实现的。更具体的说，白细胞，尤其是(活化)T淋巴细胞，(活化)单核细胞，(活化)中性粒细胞，(活化)嗜酸粒细胞中的一种或多种，引发并维持IBD中的炎症，因此，将它们从循环系统中清除或许能够减轻甚至消除这样的炎症。通过对活跃IBD患者肠道活检样本的流式细胞分析，本发明发明人发现(活化) T淋巴细胞，单核细胞，中性粒细胞和嗜酸粒细胞不仅在炎症部位富集，而且存在于循环外周血中。
因此，本发明内容之一是提供一种固相载体(solid support)，具有直接或间接固定于所述载体的一种或多种趋化因子，从而能够从患者外周血中清除表达所述一种或多种趋化因子的相应受体的细胞，所述细胞尤指本文所述的(活化)白细胞(例如单核细胞或淋巴细胞)。所述趋化因子是促炎趋化因子，即创伤或感染应激中在细胞或组织中高水平表达的那些趋化因子(它们还诱导促炎白细胞的聚集)。
本发明中，“趋化因子”包括生物素化或其它方式标记的趋化因子。“趋化因子”还包括趋化因子的修饰和截短型，条件是所述修饰或截短型保留结合其相应受体的能力(因此就本发明而言仍然有功能的)。修饰可以是以改进蛋白质合成为目的的，例如提高产品的一致性和产率。修饰可以包括趋化因子内一个或多个氨基酸位置上的氨基酸插入、取代、 缺失或其它修饰。修饰可以是用非天然氨基酸例如正亮氨酸(NLeu)和衍生氨基酸例如焦谷氨酸(pyroGlu)取代野生型氨基酸。这样的修饰能够尽可能减少储存期间和本发明分离柱使用期间副产物的形成。修饰可以改善标记过程为目的，例如引入聚乙二醇(PEG)间隔基有利于生物素化过程。趋化因子的生物素化和/或趋化因子与荧光染料或其它标记基团偶联的进行方式应基本上不影响受体的结合能力。优选定点生物素化或其它定点标记，因为非选择性标记会削弱趋化因子的受体结合活性。优选在蛋白质的C-末端或靠近C-末端进行生物素化或其它方式标记，因为本发明发明人发现，蛋白质对这一区域的修饰具有良好的耐受性(即，对受体结合能力影响最小)。截短可以是N末端和/或C末端的氨基酸缺失，根据需要而定。通常，趋化因子的截短型保留了其正确折叠必需的残基，例如，保留趋化因子原折叠结构所需的残基，这与截短型必须保留结合相应受体(表达于白细胞表面) 的能力这一要求是一致的。
具体实施方式
中，与野生型氨基酸序列相比，截短型缺少1至 100个氨基酸，例如少1、2、3、4、5的氨基酸等。当然，截短型可以含有进一步的修饰，如后文所述。
具体实施方式
中，与全长野生型趋化因子相比，所述修饰形式或截短型具有40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更高的整体氨基酸序列同一性(缺失计作氨基酸序列差异)。
具体实施方式
中，在共有序列区段(即未被缺失的氨基酸)，分子间的氨基酸序列同一性可达80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96^^97^^98%或99%。本文详细描述了一个本发明趋化因子的例子，它是含修饰的截短型，特别适用于本发明。该截短TECK对应于全长成熟蛋白的残基1至74 (因此缺少氨基酸 75至127和23个氨基酸的N-末端信号肽)，因此保留了趋化因子的折叠结构。此外还含有一处正亮氨酸取代甲硫氨酸，用以避免肽链组装过程中残基氧化。以焦谷氨酸取代N末端的谷氨酸残基能够在合成过程中获得均一的产品。通过一个PEG间隔基在第72位赖氨酸残基的ε_官能团进行生物素化。线性分子的氨基酸序列(即不包括第72位氨基酸上的 PEG间隔基和生物素分子)包含SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列，或基本上由SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列构成，或由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列构成。本发明的趋化因子可用任何一种合适的方法来合成。较好的是化学合成，因为这便于对趋化因子进行修饰和标记等。然而，根据需要，也可以采用基于重组DNA的方法，并结合适当的标记和修饰技术。 因此，本发明还提供编码截短CCL25蛋白的核酸分子，所述截短CCL25蛋白包含CCL25 (天然形式)的1-74位氨基酸(即缺少信号肽的形式，所述信号肽包含头23个氨基酸)，基本上由所述1-74位氨基酸构成，或由所述1-74位氨基酸构成。因此，该蛋白缺少天然CCL25 氨基酸序列的75至127位氨基酸。本发明还涉及包含所述核酸分子的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。所述载体还可以包含与所述核酸分子操作性连接的合适的启动子，从而促进相应mRNA分子的转录。所述宿主细胞能够通过转录后翻译编码截短CCL25蛋白编码的核酸分子来表达该蛋白，所述的截短CCL25蛋白包含CCL25的氨基酸1至74(因此缺失氨基酸75至127和23个氨基酸的N-末端信号肽)。
趋化因子受体在许多迁移性细胞上表达，例如淋巴细胞、粒细胞和抗原呈递细胞， 也在许多非迁移性细胞上表达，例如上皮细胞和成纤维细胞。如前所述，本发明的趋化因子以一定的方式固定在固相载体上，从而能够从患者的外周血中清除表达一种或多种趋化因子的相应受体的细胞。表1汇集了本发明优选趋化因子的相应受体。有时，一个趋化因子可结合一个以上受体。趋化因子的这一特性使之能够捕捉多种参与炎症的受体表达细胞从而提供更有效的治疗。
具体实施方式
中，所述固相载体带有多种趋化因子，旨在扩大捕捉促炎细胞的范围。
IBD患者的炎症迁延不愈是因为血液循环中的抗原呈递细胞(APCs)和T细胞不断进入肠粘膜。这一连续的细胞积累是由趋化因子及其受体调控的。因此，趋化因子分子参与炎症过程中多种免疫细胞亚群的聚集和活化。发炎肠粘膜内产生的一种本地(local)趋化因子是TECK(胸腺表达趋化因子，又名CCL2Q。循环血中的单核细胞和淋巴细胞通过TECK 受体，趋化因子受体9 (CCR9)，识别趋化因子。细胞通过CCR9受体结合TECK，并开始向肠道炎症部位迁移(1)。到达发炎粘膜后，单核细胞转化为APCs。循环表达CCR9的T细胞也向肠道炎症部位迁移，并在那里活化。在小鼠模型中，通过基因删除或抗体抑制消除CCR9或其配体TECK能减弱T细胞向肠道迁移( 。CCR9-TECK相互作用似乎在单核细胞和T细胞向整个肠道-包括小肠以及结肠-的迁移中起着主要作用。最近发现，健康人和IBD患者的大肠内都有CCR9和TECK。CD患者或UC患者结肠组织的免疫组化染色检查发现有表达 CCR9的T细胞存在。并且在结肠中观察到有受体激动剂TECK存在C3)。IBD患者中，遵循的原理是在循环系统中的表达CCR9的单核细胞和T细胞到达肠道炎症部位之前将它们清除，从而减轻炎症。采用带有固定于固相载体上的生物素化TECK(bTECK)的分离柱，由TECK 从循环系统中捕捉表达CCR9的单核细胞和T细胞，应该能够抑制所述细胞造成的促炎作用，从而使粘膜得以愈合。这一原理适用于参与白细胞向肠道炎症区聚集的多种趋化因子。 例如，肠道粘膜分泌IL-8，其通过与的IL-8受体的相互作用来吸引中性粒细胞。CCR6调节 Thl7向肠道的迁移以及发炎组织内效应者T细胞的平衡/分布(14)。因此，固定于固相载体的CCL20也能够在本发明中用来治疗炎症，例如IBD。
本发明挑选趋化因子的根据是它们在炎症中的表达上调。而且，特定类型细胞上的趋化因子受体显示出与所述炎性疾病的发生相关，表现为这些受体表达细胞向炎症部位聚集。因此，本发明的趋化因子包括以下一种或多种MIP-la，ΜΙΡ-lb，MCP-I，MCP-2，MCP-3， MCP-4，TARC，MDC，MIP-3，MIP-3a，MIP3b，MIP-4，I-309，HCC-1，HCC-2,SLC,IL-8，GROa，GROb， GROg, RANTES, NAP-2，ENA78, GCP-2，IP-10，MIG，I-TAC, SDF, CX3C 趋化因子(fractalkine)， 淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)，嗜酸粒细胞趋化蛋白(eotaxin)，嗜酸粒细胞趋化蛋白-2，1-309，BLC, CCL25。优选的本发明趋化因子有MIP_la，ΜΙΡ-lb，MIP_3a，MIP_3b， MIP-4, SLC, MCP-I，MCP-2，MCP-3，MCP-4，TARC, MDC, IL-8, IP-10，MIG, I-TAC, CX3C 趋化因子，CCL-25，RANTES。最优选的是优先结合活化T淋巴细胞的趋化因子，尤其是MIP_la，MCP， IP-10，MIG，ITAC，CCL25。“优先结合”指趋化因子结合活化T淋巴细胞的倾向性大于结合非活化T淋巴细胞和/或其它血细胞。
具体实施方式
之一中的趋化因子是CCL25。CCL25 优先结合表达CCR9的细胞，尤其是(活化)淋巴细胞(CD4和CD8淋巴细胞)和单核细胞 (例如⑶14-阳性单核细胞)。
表1提供本发明所用部分趋化因子的详细信息，包括认证的基因记号(根据HUGO
基因命名委员会)、名称和序列信息。还列出了各的一个或多个相应受体。
权利要求
1.一种装载了固相载体的分离柱，所述固相载体含有直接或间接固定于所述载体上的一种或多种趋化因子，从而能够从患者的外周血中去除表达所述一种或多种趋化因子的相应受体的细胞。
2.如权利要求1所述的分离柱，其中，所述一种或多种趋化因子是生物素化的，所述载体上固定有链霉亲和素，并且，所述一种或多种生物素化的趋化因子结合于载体上的链霉亲和素。
3.如权利要求1或2所述的分离柱，其中，所述一种或多种趋化因子通过间隔基生物素化。
4.如权利要求3所述的分离柱，其中，所述间隔基是聚乙二醇间隔基。
5.如前述权利要求中任一项所述的分离柱，其中，所述载体含有分子量大于IOOkDa的糖，或由分子量大于IOOkDa的糖构成，所述糖可选交联糖。
6.如权利要求5所述的分离柱，其中，所述糖是交联琼脂糖。
7.如前述权利要求中任一项所述的分离柱，其中，所述一种或多种趋化因子选自 CCL25, MIP-Ia, ΜΙΡ—lb，MCP-I, MCP—2，MCP—3，MCP—4，TARC, MDC, MIP—3，MIP_3a，MIP3b, MIP-4, 1-309，HCC-I，HCC-2，SLC, IL-8，GROa, GROb, GROg, RANTES, NAP-2，ENA78, GCP-2， IP-10，MIG，I-TAC，SDF, CX3C趋化因子，淋巴细胞趋化因子，嗜酸粒细胞趋化蛋白，嗜酸粒细胞趋化蛋白-2，1-309，BLC0
8.如权利要求7所述的分离柱，其中，所述一种或多种趋化因子是CCL25。
9.如前述权利要求中任一项所述的分离柱，其中，所述载体的形式为球形、珠粒或不规则形的颗粒，平均粒径为50 μ m至2mm。
10.如前述权利要求中任一项所述的分离柱，其中，所述载体经试剂处理而具有抗凝血特性，例如肝素化的载体。
11.如前述权利要求中任一项所述的分离柱的固相载体。
12.一种从患者的外周血中去除表达一种或多种趋化因子相应受体的细胞方法，包括a.将采集的外周血与固定在固相载体上的一种或多种趋化因子接触足够长的时间以使所述细胞附着在所述载体上；和b.将去除了所述细胞的血液与所述载体分离。
13.如权利要求12所述的方法，还包括在步骤a之前采集患者的外周血。
14.如权利要求12或13所述的方法，还包括在步骤b之后将去除了所述细胞的血液回输给所述患者。
15.如权利要求12至14中任一项所述的方法，其中，所述细胞是白细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其中，所述白细胞选自T淋巴细胞，单核细胞，中性粒细胞或嗜酸粒细胞。
17.如权利要求12至16中任一项所述的方法，该方法被用于治疗炎症。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述炎症炎性肠病(IBD)。
19.如权利要求18所述的方法，其中，所述IBD是溃疡性结肠炎或克罗恩病。
20.权利要求12至19中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种趋化因子是生物素化的，所述载体上固定有链霉亲和素，并且，所述一种或多种生物素化的趋化因子结合于载体上的链霉亲和素。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述一种或多种趋化因子通过间隔基生物素化。
22.如权利要求21所述的方法，其中，所述间隔基是聚乙二醇间隔基。
23.如权利要求12至22中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种趋化因子选自 CCL25, MIP-Ia, ΜΙΡ—lb，MCP-I, MCP—2，MCP—3，MCP—4，TARC, MDC, MIP—3，MIP_3a，MIP3b, MIP-4, 1-309，HCC-I，HCC-2，SLC, IL-8，GROa, GROb, GROg, RANTES, NAP-2，ENA78, GCP-2， IP-10，MIG，I-TAC，SDF, CX3C趋化因子，淋巴细胞趋化因子，嗜酸粒细胞趋化蛋白，嗜酸粒细胞趋化蛋白-2，1-309，BLC0
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种趋化因子是CCL25。
25.如权利要求12至24中任一项所述的方法，其中，连续地自患者采集外周血，并且清除了所述细胞的血液连续地回输给所述患者。
26.如权利要求12至25中任一项所述的方法，其中，所述载体设置在一柱体内，血液流动通过所述柱体。
27.如权利要求12至沈中任一项所述的方法，其中，所述载体的形式为球形、珠粒或不规则形的颗粒，平均粒径为50 μ m至2mm。
28.如权利要求12至27中任一项所述的方法，其中，所述载体经试剂处理而具有抗凝血特性，例如肝素化的载体，并且/或着，外周血是经抗凝剂处理过的。
29.权利要求1至10中任一项所述的分离柱或权利要求11所述的载体用于治疗炎症的用途。
30.如权利要求四所述的用途，其中，所述炎症是IBD。
31.权利要求1至10中任一项所述的分离柱或权利要求11所述的载体用于治疗以表达一种或多种趋化因子的相应受体的细胞含量升高为特征的疾病的用途。
32.如权利要求31所述的用途，其中，所述细胞数是患者外周血中的白细胞，尤其是一种或多种以下细胞淋巴细胞，单核细胞，中性粒细胞或嗜酸粒细胞。
33.用于治疗炎症的趋化因子，其中，所述趋化因子固定在固相载体上。
34.固定在固相载体上的趋化因子在制造治疗炎症的药物中的用途。
35.如权利要求33所述的趋化因子或如权利要求34所述的用途，其中，所述炎症是IBD。
36.截短型CCL25趋化因子，含有如SEQID NO :1所示的氨基酸序列，其第72位(赖氨酸)生物素化，目的是让该趋化因子能够固定到固相载体上。
37.如权利要求36所述的趋化因子，还包含位于生物素与所述赖氨酸残基之间的PEG间隔基。
全文摘要
一种装载了固相载体的分离柱，所述固相载体含有直接或间接固定于所述载体上的一种或多种趋化因子，尤其是生物素化的趋化因子和携有链霉亲和素的载体。本发明还揭示了用所述分离柱和载体从炎症患者尤其炎性肠病(IBD)患者外周血中清除细胞尤其是白细胞的用途和方法。
文档编号A61M1/36GK102186880SQ200980141452
公开日2011年9月14日 申请日期2009年9月10日 优先权日2008年9月10日
发明者O·温维斯特, G·科托恩 申请人:Ith免疫治疗控股股份公司