N-钙黏着蛋白:癌症诊断和治疗的靶标的制作方法

专利名称：N-钙黏着蛋白:癌症诊断和治疗的靶标的制作方法
N-钙黏着蛋白癌症诊断和治疗的靶标相关申请的交叉引用本申请要求2008年11月10日提交的USSN 12/268, 302的优先权，该申请通过引用全文纳入本文。
背景技术：
引言前列腺癌是美国男性中最常见的恶性肿瘤和癌症相关死亡的第二大主要原因。前列腺癌是生物学和临床上异质的疾病。患有此种恶性肿瘤的大部分男性携带缓慢生长的肿瘤，这些肿瘤可能不影响个体的自然寿命，而某些人则患上快速进行的转移性肿瘤。PSA筛选受限于缺乏特异性并且不能预测哪些患者具有产生激素难治转移性疾病的风险。最近的研究提倡降低诊断的PSA阈值，这样可能增加前列腺癌诊断数量，更难以鉴定患有无痛和侵袭性癌症的患者(Punglia等·，N Engl J Med, 349 :335_342 (2003))。急需与临床结果相关或鉴定可能患有侵袭性疾病的患者的新血清和组织标记物(Welsh等.，Proc Natl Acad Sci U S A，100 :3410-3415(2003))。最近的表达分布研究表明转移性与非转移性肿瘤的表达特征可能存在于原发性月中瘤中(Ramaswamy 等· ，Nat Genet，33 :49_54 (2003) ；Sotiriou 等· ，Proc Natl Acad Sci U S A，100 10393-10398 (2003))。原发性肿瘤中也存在一定频率的肿瘤倾向于转移至特定器官的其它特征(Kang等·，Cancer Cell，3 :537_549 (2003))。这些最近的观察结果表明可在早期疾病中鉴定转移前或激素难治性前列腺癌的新型标记物。这些标记物还在转移性或激素难治性前列腺癌发展的生物学特性中发挥作用。存在于原发性肿瘤中，与结果相关并在前列腺癌发展的生物学特性中发挥作用的基因的最新例子包括EZH2和LIM激酶 (Varambally 等.，Nature，419 :624_629 (2002) ；Yoshioka 等.，Proc Natl Acad Sci U S Α,ΙΟΟ =7247-7252 (2003) ) 0然而，这两种基因均非分泌型的。在此，我们描述了一种治疗或诊断癌症患者的方法，其中癌细胞中N-钙黏着蛋白以正常或较低水平表达，或由癌细胞的亚组表达并且未过表达。我们还报道了一种通过测定测试组织样品中N-钙黏着蛋白存在与否或含量来鉴定癌症干细胞的方法。发明概述在第一方面，本发明提供治疗癌症患者的方法，包括以下步骤从具有患表达 N-钙黏着蛋白的癌症风险的个体获得测试组织样品；测定该测试组织样品中N-钙黏着蛋白存在与否或含量，与已知癌症阴性的个体的对照组织样品作比较；藉此诊断表达N-钙黏着蛋白的所述癌症，其中所述N-钙黏着蛋白以正常或低水平表达，或者由所述细胞的亚组表达，其中所述N-钙黏着蛋白未过表达；和将有效量的N-钙黏着蛋白抗体或其片段给予具有患表达N-钙黏着蛋白的癌症风险的个体。在另一方面，本发明提供鉴定癌症干细胞的方法，包括以下步骤从具有患表达 N-钙黏着蛋白的癌症风险的个体获得测试组织样品；测定该测试组织样品中癌症干细胞存在与否，与已知癌症阴性的个体的对照组织样品作比较；其中所述N-钙黏着蛋白以正常或低水平表达，或者由所述干细胞的亚组表达和未过表达。
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在一个实施方式中，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。在另一个实施方式中，所述癌症是前列腺癌。在另一个实施方式中，所述癌症是膀胱癌。在另一个实施方式中，所述癌症是激素难治性前列腺癌。在另一个实施方式中，所述癌症是转移性癌症。在另一个实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方式中，所述片段是SCFV。在另一个实施方式中，所述片段是二抗体(diabody)。在以上任一个方面和实施方式中，待治疗的所述组织、癌症、对象或患者是人或哺乳动物。在以上任一个方面和实施方式中，所述癌症可以是不依赖雄激素的癌症。附图简述

图1. (a)不依赖雄激素的LAPC 9前列腺癌的免疫组化染色，显示N-钙黏着蛋白仅由小亚组细胞表达；(b)用对照PBS或N-钙黏着蛋白抗体1H7和EC4治疗依赖和不依赖雄激素的LAPC 9肿瘤。图2.分选N-钙黏着蛋白阳性和阴性细胞，从而分别产生100%和0% N-钙黏着蛋白阳性的细胞群。图3和4.从纯N-钙黏着蛋白阳性和阴性细胞生长的肿瘤与未分选对照群的FACS 分析。图5和6. N-钙黏着蛋白序列。发明详述在本文中，我们报道了在激素难治性前列腺癌和膀胱癌中表达的基因产物的鉴定、表征和验证。这些基因产物是N-钙黏着蛋白。与正常组织相比，N-钙黏着蛋白无需过表达才能作为治疗和诊断的靶标。其可以低水平表达，仅由细胞亚组表达。数据显示即便靶向5%的前列腺癌细胞中的N-钙黏着蛋白亦足以阻断前列腺癌发展成去势耐受性。N-钙黏着蛋白是癌症干细胞的靶标。数据显示靶向5%或更少的细胞中的N-钙黏着蛋白足以阻断肿瘤发展，与N-钙黏着蛋白是癌症干细胞的标记物的假说以及抑制这些干细胞上的N-钙黏着蛋白足以完全阻断肿瘤生长的假说一致。与其作为癌症干细胞标记物一致的是，表达N-钙黏着蛋白的细胞的致瘤性高于不表达N-钙黏着蛋白的细胞。N-钙黏着蛋白阳性细胞可产生N-钙黏着蛋白阴性细胞，这也与N-钙黏着蛋白是癌症干细胞的新型标记物的理论一致。最后，肿瘤必须上调或获得 N-钙黏着蛋白才能生长。即，肿瘤干细胞必须获得上皮向间充质转变的(印ithelial to mesenchymal transition)特性才能具有致瘤性。因此，N-钙黏着蛋白对于癌症治疗是特别有希望的治疗靶标，所述癌症包括但不限于前列腺癌和膀胱癌。其在细胞表面发现，在许多上皮肿瘤中过表达，与侵袭性、转移性相关，还可能不依赖雄激素。如本发明所示，癌症干细胞显示正常或低水平的N-钙黏着蛋白表达。因此，抗N-钙黏着蛋白的抗体是用于治疗癌症的特别优选的试剂，所述癌症包括但不限于上皮、泌尿生殖癌症(膀胱、前列腺)，更具体地说，它们的侵袭性或转移形式。在一些实施方式中，优选抗N-钙黏着蛋白的胞外结构域的单克隆抗体。在另一些实施方式中，这些癌症的治疗中优选N-钙黏着蛋白的第一胞外结构域(ECl)，第一和第二结构域的诸部分或第四结构域。在一些实施方式中，尤其优选在这些治疗中利用抗胞外结构域4的抗体，因为发现该结构域在促运动性(pro-motility)和侵袭潜能中具有重要作用(参见Kim等，J Cell Biol. 151(6) :1193_206 (2000)，各种N-钙黏着结构域的定义通过引用全文纳入本文)。N-钙黏着蛋白表达可促进前列腺和膀胱癌侵袭和转移以及前列腺癌发展成激素难治性疾病。可单独或与mTOR和EGFR的其它小分子抑制剂组合治疗性靶向N-钙黏着蛋白。靶向N-钙黏着蛋白有助于预防或控制侵袭性和转移性前列腺癌。定义“N-钙黏着蛋白”指具有以下特征的核酸，例如基因、前-mRNA、mRNA和多肽、多态性变体、等位基因、突变体和种间同源物(1)具有的氨基酸序列优选在至少约25、50、100、 200,500,1000或更多个氨基酸的区域上与各参比核酸编码的多肽或本文所述氨基酸序列， 例如分别如图5和6所述的序列有大于约60%氨基酸序列相同性，65%、70%、75%、80%、 85%、90%，优选91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高氨基酸序列相同性；(2)特异性结合包含参比氨基酸序列(分别如图5和6所示)的免疫原，其各自的免疫原性片段，及其各自的保守性修饰变体产生的抗体，例如多克隆抗体；(3)在严格杂交条件下特异性杂交编码参比氨基酸序列(分别如图5和6所示)的核酸及其保守性修饰变体；(4)具有的核酸序列优选在至少约25、50、100、150、200、250、500、1000或更多个核苷酸的区域上与分别如图5和6所示的参比核酸序列有大于约9 5 %，优选大于约9 6 %、9 7 %、 98%、99%或更高的核苷酸序列相同性。多核苷酸或多肽序列通常来自哺乳动物，包括但不限于灵长类，例如人；啮齿类，例如大鼠、小鼠、仓鼠；奶牛、猪、马、绵羊或任何哺乳动物。本发明的核酸和蛋白质包括天然产生或重组分子。“癌症”指人癌症和癌、肉瘤、腺癌、淋巴瘤、白血病等，包括实体瘤和淋巴癌症、肾脏、乳腺、肺、肾脏、膀胱、结肠、卵巢、前列腺、胰腺、胃、脑、头和颈、皮肤、子宫、睾丸、食道和肝脏癌症，淋巴瘤，包括非霍奇金和霍奇金淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。“泌尿生殖癌症”指尿路和生殖组织的人癌症，包括但不限于肾脏、膀胱、尿路、尿道、前列腺、阴茎、睾丸、 外阴、阴道、宫颈和卵巢组织。本文治疗的癌症的特征在于N-钙黏着蛋白表达低或正常(但不过表达)。在本发明的一个实施方式中，进行诊断或预后试验以测定患者癌症的特征是否为N-钙黏着蛋白表达低或正常。考虑了测定此类表达的各种试验，包括免疫组化、FISH和脱落抗原试验 (shed antigen assay)、Southern印迹或PCR技术。此外，可采用体内诊断试验评估N-钙黏着蛋白表达或扩增，例如通过给予结合待检测分子并用可检测标记物(例如，放射性同位素)标记的分子(如抗体)，并外部扫描患者以便定位该标记物。在一些实施方式中，待治疗的癌症或癌症干细胞尚不具侵袭性，但表达N-钙黏着蛋白。“治疗耐受性”癌症、肿瘤细胞和肿瘤指对凋亡介导(例如，通过死亡受体细胞信号传导，例如Fas配体受体、TRAIL受体、TNF-R1、化疗药物、辐射)和非凋亡介导的(例如，毒性药物、化学品)的癌症治疗，包括化疗、激素治疗、放疗和免疫治疗变得耐受或难治的癌症。“低或正常表达”指测试组织样品中N-钙黏着蛋白的RNA或蛋白质表达大致等于或低于对照组织样品中N-钙黏着蛋白的RNA或蛋白质表达。在一个实施方式中，所述组织样品是自体的。术语“表达N-钙黏着蛋白的癌症”和“N-钙黏着蛋白表达相关的癌症”可互换地指表达以上定义的N-钙黏着蛋白的癌症细胞或组织。术语“癌症_相关抗原”或“肿瘤特异性标记物”或“肿瘤标记”可互换地指相比于正常细胞，优先在癌症细胞中表达的分子(通常是蛋白质、碳水化合物或脂质)，其可用于将药理学试剂优先靶向癌症细胞。标记物或抗原可在细胞表面或胞内表达。癌症相关抗原是相比于正常细胞在癌症细胞中常过表达或极少降解的稳定化的分子，例如相比于正常细胞2-倍过表达、3-倍过表达或更高。癌症相关抗原常是癌症细胞中不适当合成的分子，例如相比于正常细胞表达的分子含有缺失、添加或突变的分子。癌症相关抗原常仅在癌症细胞中表达，而不在正常细胞中合成或表达。示范性细胞表面肿瘤标记包括乳腺癌的蛋白质 c-erbB-2和人表皮生长因子受体(HER)，前列腺癌的PSMA和包括乳腺癌、卵巢癌和结肠直肠癌在内的许多癌症中的碳水化合物粘蛋白。示范性胞内肿瘤标记物包括，例如突变的肿瘤抑制基因或细胞周期蛋白，包括P53。“激动剂”指结合本发明多肽或多核苷酸，刺激、增力卩、活化、促进、增强活化、致敏或上调本发明多肽或多核苷酸活性或表达的试剂。“拮抗剂”指抑制本发明多肽或多核苷酸表达或结合、部分或完全阻断刺激、降低、 阻止、延迟活化、灭活、失敏或下调本发明多肽或多核苷酸活性的试剂。表达或活性的“抑制剂”、“活化剂”和“调节剂”分别用来指采用体外和体内试验鉴定的表达或活性的抑制性、激活性或调节性分子，例如配体、激动剂、拮抗剂和它们的同源物及模拟物。术语“调节剂”包括抑制剂和活化剂。抑制剂是，例如，抑制本发明多肽或多核苷酸表达，或者结合、部分或完全阻断刺激或酶活性、降低、防止、延迟激活，灭活、失敏或下调本发明多肽或多核苷酸活性的试剂，如拮抗剂。活化剂是，例如，诱导或活化本发明多肽或多核苷酸的表达，或者结合、刺激、增加、打开、激活、促进、增强活化或酶活性、致敏或上调本发明多肽或多核苷酸活性的物试剂，如激动剂。调节剂包括天然产生的和合成的配体、拮抗剂、激动剂、小化学分子等。鉴定抑制剂和活化剂的试验包括例如，在存在或不存在本发明多肽或多核苷酸的条件下将推定的调节化合物施用于细胞，然后测定对本发明多肽或多核苷酸活性的功能影响。将用潜在的活化剂、抑制剂或调节剂处理的包含本发明多肽或多核苷酸的样品或试验物与没有抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品作比较，以检测影响程度。对照样品(未用调节剂处理)的相对活性值指定为100%。相对于对照，本发明多肽或多核苷酸的活性值约为80%，任选为50%或25-1%时，实现了抑制。相对于对照，本发明多肽或多核苷酸的活性值为110%，任选为150%，任选为200-500%，或1000-3000% 或更高时，实现了激活。本文所用术语“测试化合物”或“候选药物”或“调节剂”或其语法等同形式描述了天然产生或合成的任何分子，如蛋白质、寡肽(如长约5至25个氨基酸，优选长约10至20 个或12至18个氨基酸，优选长12、15或18个氨基酸)、有机小分子、多糖、脂质、脂肪酸、多核苷酸、RNAi、siRNA、抗体、寡核苷酸等。测试化合物可采用测试化合物文库的形式，例如提供足够多样性范围的组合文库或随机文库。测试化合物任选地连接于融合伴侣，如靶向化合物、拯救化合物、二聚化化合物、稳定化合物、可寻址化合物和其它官能部分。通常，通过鉴定具有某些所需特性或活性，如抑制活性的测试化合物(称为“先导化合物”)，产生先导化合物变体，并评估这些变体化合物的特性和活性，从而产生具有有用特性的新化学实体。 这种分析中常常采用高通量筛选(HTS)方法。
“有机小分子”指分子量大于约50道尔顿且小于约2500道尔顿，优选小于约2000 道尔顿，优选约100至1000道尔顿，更优选约200至约500道尔顿的天然产生或合成的有机分子。细胞毒性试剂包括“细胞周期特异性”或“抗有丝分裂”或“细胞骨架相互作用”药物。这些术语可互换地指阻断有丝分裂细胞的任何药理学试剂。此类试剂可用于化疗。细胞周期特异性药物通常结合细胞骨架蛋白微管蛋白并阻断微管蛋白聚合成微管的能力，从而使细胞分裂停滞在中期。示范性细胞周期特异性药物包括长春花生物碱、紫杉烷类、秋水仙素和鬼白毒素。示范性长春花生物碱包括长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。示范性紫杉烷类包括紫杉醇和多西他赛。细胞骨架相互作用药物的另一实例包括2-甲氧基雌二醇。“siRNA”或“RNAi”指形成双链RNA的核酸，当siRNA在与基因或靶基因相同的细胞中表达时，所述双链RNA能降低或抑制所述基因或靶基因的表达。因此，“siRNA”或“RNAi” 指互补链形成的双链RNA0杂交形成双链分子的siRNA的互补部分通常具有充分或完全的相同性。在一个实施方式中，siRNA指与靶基因有充分或完全相同性并形成双链siRNA的核酸。所述siRNA通常长约至少约15-50个核苷酸，例如双链siRNA的各互补序列长15-50 个核苷酸，所述双链siRNA长约15-50个碱基对，优选约20-30个碱基核苷酸，优选约20-25 或约24-29个核苷酸，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长。本领域普通技术人员熟知SiRNA分子和载体的设计和制备。例如，设计合适 siRNA的有效方法是从mRNA转录物的AUG起始密码子开始并扫描AA 二核苷酸序列(参见 Elbashir 等.EMBO J 20 :6877_6888 (2001)。各 AA 和 3 ‘毗连核苷酸是潜在的 siRNA 靶标。 毗连位点序列的长度将决定siRNA的长度。例如，19个毗连位点会产生21个核苷酸长的 siRNA。具有3’突出UU 二核苷酸的siRNA通常是最有效的。该方法与利用RNA pol III 转录发夹siRNA也相容。RNA pol III在4_6个核苷酸多聚(T)道处终止转录，从而产生具有短多聚(U)尾的RNA分子。然而，具有其它3’末端二核苷酸突出的siRNA也能有效诱导 RNAi，可凭经验选择序列。对于选择性，可通过进行BLAST检索以避免与其它编码序列具有超过16-17个毗连碱基对同源的靶序列(参见www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)。可直接给予siRNA或者可利用具有不同设计标准的siRNA表达载体诱导RNAi。载体可插入短间隔序列分隔开并以用于终止转录的T串结束的两个反向重复。表达的RNA转录物预计能折叠成短发夹siRNA。siRNA靶序列的选择，编码推定发夹的茎干的反向重复的长度，反向重复的顺序，编码发夹的环的间隔序列的长度和组成，5’ -突出的存在与否可有所不同。siRNA表达盒的优选顺序是正义链、短间隔序列和反义链。具有各种茎干长度(例如，15-30)的发夹siRNA可能是合适的。连接发夹siRNA的正义和反义链的环可具有不同长度(例如，3-9个核苷酸或更长)。载体可包含操作性连接于编码siRNA的核苷酸序列的启动子和表达增强子或其它调控元件。表达“控制序列”指在特定宿主生物体中操作性连接的编码序列表达必需的DNA序列。适合原核生物的控制序列，例如包括启动子，并任选包括操纵序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。可将这些控制元件设计成允许临床医师通过加入或控制调控元件对其起反应的外部因素而关闭或开启基因的表达。构建含有所需治疗基因编码序列和控制序列的合适载体采用本领域熟知的标准连接和限制性技术(参见Maniatis等.，刊于《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，纽约(1982))。切割、改造分离的质粒、DNA 序列或合成的寡核苷酸并重新连接成所需形式。当核酸与另一核酸序列有功能关系时，其是“操作性连接的”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，其操作性连接于多肽的DNA;如果启动子或增强子影响编码序列的转录，其操作性连接于该序列；或者如果将核糖体结合位点置于能促进翻译，其操作性连接于编码序列。“操作性连接于”通常表示连接的DNA序列彼此邻近，在分泌前导序列的情况中，是毗连并在阅读相(reading phase)中。然而，增强子不必毗连。在便利的限制性位点进行连接。如果不存在此类位点，根据常规操作利用合成的寡核苷酸适体或接头。“测定功能效应”指检验提高或降低直接或间接受本发明多核苷酸或多肽影响的参数的化合物，例如测定物理和化学或表型效应。可通过本领域技术人员已知的任何手段测定此类功能效应，例如蛋白质的光谱学(例如荧光、吸光度、折射率)、流体力学(例如形状)、色谱或溶解度特性的改变；测定蛋白质的诱导型标记物或转录激活；测定结合活性或结合试验，例如结合抗体；测定配体结合亲和力的改变；测定钙内流；测定本发明多肽的酶产物的累积或底物的消耗；酶活性的改变，例如激酶活性；测定本发明多肽的蛋白质水平的改变；测定RNA稳定性；G-蛋白质结合；GPCR磷酸化或去磷酸化；信号转导，例如受体-配体相互作用，第二信使浓度(例如，cAMP、IP3或胞内Ca2+)；鉴定下游或报道基因表达(CAT、萤光素酶、β -gal,GFP等)，例如通过化学发光、荧光、比色反应、抗体结合、诱导型标记物和配体结合试验。将用潜在的活化剂、抑制剂或调节剂处理的包含本发明核酸或蛋白质的样品或试验物与不含抑制剂、活化剂或调节剂的对照样品作比较，以检测抑制程度。对照样品(未用抑制剂处理)的相对蛋白质活性值指定为100%。当与对照相比，活性值约为80%，优选 50%，更优选25-0%时，实现了抑制。当与对照(未用活化剂处理)相比，活性值为110%， 优选150%，更优选200-500% (即，相比于对照高2-5倍)，更优选1000-3000%或更高时， 实现了活化。“生物学样品”包括组织切片，如活检或尸检样品，以及为组织学目的获取的冰冻切片。此类样品包括血液和血液组分或产物(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)，痰，组织，培养的细胞，例如原代培养物，外植体和转化的细胞，粪便、尿液等。生物学样品通常获自真核生物体，最优选哺乳动物，如灵长类，例如黑猩猩或人；奶牛；犬；猫；啮齿类，例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟类；爬行动物；或鱼类。“活检”指为诊断或预后评估的目的取出组织样品的过程，还指组织样本自身。本领域已知的任何活检技术均可用于本发明的诊断和预后方法。应用的活检技术取决于待评估的组织类型(即，前列腺、淋巴结、肝脏、骨髓、血细胞)、肿瘤的大小和类型(即，实体或悬浮的(即，血液或腹水))等因素。代表性活检技术包括切除活检、切取活检、针吸活检、外科手术活检和骨髓活检。“切除活检”指取出整个肿瘤块及其周围的少量正常组织。“切取活检”指取出包括肿瘤截面直径的楔形组织。通过内窥镜检查或荧光法进行诊断或预后可能需要肿瘤块的“芯针活检”或“细针抽吸活检”，通常获得肿瘤块内细胞的悬液。活检技术在，例如《哈里森内科学原理》(Harrison' s Principles of Internal Medicine), Kasper等编.，第16版.，2005，第70章和整个第V部分中讨论。在两条或更多条核酸或多肽序列中，术语“相同”或“相同性百分数”指采用默认参数的下述BLAST或BLAST 2. 0序列比较算法检测，或通过手工比对或目测检查到两条或更多条序列或子序列相同或具有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(即，当在比较窗口或指定区域上比较和比对最大对应性时，在指定区域上约60%相同，优选65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高的相同性)(参见，例如 NCBI 网址 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/ 等)。然后，可称此类序列“基本相同”。该定义也指或可用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/ 或添加的序列以及具有取代的序列。如下所述，优选算法可考虑空位等。优选在长度至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上存在相同性，或者更优选在长50-100个氨基酸或核苷酸的区域上存在相同性。对于序列比较，一般将一条序列作为与测试序列相比的参比序列。使用序列比较算法时，测试和参比序列均输入计算机，如果必要，指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。优选使用默认的程序参数，或者可指定替代的参数。然后，该序列比较算法根据程序参数计算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。本文所用的“比较窗”包括参考选自20-600，通常约50-200，更常见约100-150 的毗连位置中任一数量的区段，其中两个序列进行最优比对后，可将序列与相同数量的毗连位置的参比序列作比较。本领域熟知序列比对作比较的方法。可通过以下算法对作比较的序列进行最佳比对，例如Smith和Waterman, Adv. App 1. Math. 2 =482(1981)的局部同源性算法，Needleman 和 Wunsch，J. Mol. Biol. 48 443(1970)的同源性比对算法，Pearson 和 Lipman，Proc. Nat，1. Acad. Sci. USA 85 2444(1988)的相似性算法检索，计算机执行这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package),遗传学计算机组(Genetics Computer Group), 575 Science Dr.,麦迪逊，威斯康星州)或手工比对和目测观察(参见，例如《最新分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology) (Au sub el 等编.1995 ± 曾补))。适合测定序列相同性和序列相似性百分比的优选算法的例子是BLAST和BLAST 2. 0 算法，它们分别描述于 Altschul 等·，Nuc. Acids Res. 25 3389-3402 (1977)和 Altschul 等.，J. Mol. Biol. 215 403-410 (1990)。使用 BLAST 和 BLAST 2. 0 及本文所述参数以确定本发明核酸和蛋白质的序列相同性百分数。进行BLAST分析的软件可从公众渠道国 it^^ii^ffE^^^ (National Center for Biotechnology Information) (http:// ncbi. nlm. nih. gov/)。该算法包括首先通过在查询序列中鉴定长度W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，该短字与数据库序列中相同长度的字比对时，匹配或满足一些正值阈值评分 Τ。T称为相邻字评分阈值(Altschul等，同上)。这些初始相邻字命中作为启动搜索发现含有它们的更长的HSP的种子。该字命中在沿各序列的两个方向上延伸，直到可增加累积的比对评分。对于核苷酸序列，利用参数M(—对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列，用评分矩阵计算累积评分。在以下情况出现时中止字命中在各个方向上的延伸累积比对评分从其最大获得值降低X ；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或零以下；或者达到各序列的末端。 BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)采用的默认值如下字长(W) 11，期望值(E) 10,M = 5,N = -4，比较两条链。对于氨基酸序列， BLASTP程序使用的默认值为字长3，期望值(E)10，BL0SUM62评分矩阵(参见Henikoff 和 Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 10915 (1989))比对(B) 50，期望值(E) 10, M = 5, N =-4，比较两条链。“核酸”指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物及其互补体。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸，它们是合成、天然产生的和非天然产生的，它们与参比核酸的结合特性类似，与参比核苷酸的代谢方式类似。 此类类似物的例子包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、膦酸甲酯、手性_膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。除非另有说明，具体核酸序列也包括其保守性修饰变体(例如，简并密码子取代) 和互补序列以及明确指出的序列。具体说，简并密码子取代可通过产生一个或多个选择的 (或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列获得(Batzer 等，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ；Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260 :2605_2608 (1985)； Rossolini 等，Mol. Cell. Probes 8 :91_98 (1994))。术语核酸与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸可互换使用。具体核酸序列还隐含包括“剪接变体”。类似地，核酸编码的具体蛋白质隐含包括该核酸的剪接变体编码的任何蛋白质。如其名称所提示的，“剪接变体”是基因选择性剪接的产物。转录后，可剪接初始核酸转录物，从而不同(选择性)核酸剪接产物编码不同多肽。 产生剪接变体的机制有所不同，但包括外显子的选择性剪接。该定义还包括通过通读转录而源自同一核酸的其它多肽。该定义包括剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式。 钾通道剪接变体的例子见 Leicher 等，J. Biol. Chem. 273 (52) 35095-35101 (1998)所讨论。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。术语“氨基酸”指天然产生的和合成的氨基酸，以及以类似于天然产生的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然产生的氨基酸是遗传密码编码的氨基酸，以及随后修饰的氨基酸，如羟脯氨酸、Y -羧基谷氨酸和0-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指与天然产生的氨基酸具有相同基本化学结构的化合物，即α碳结合于氢、羧基、氨基和R 基团，如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物指结构不同于氨基酸的通用化学结构，但作用方式类似于天然产生的氨基酸的化学化合物。在本文中，氨基酸可用IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的通用三字母代号或单字母代号表示。同样，核苷酸可用其普遍接受的单字母代码表示。“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者当核酸不编码氨基酸序列时，指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和G⑶都编码丙氨酸。因此，在密码子确定为丙氨酸的每个位置上，可将密码子改变为所述的任何相应密码子而不改变编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”，保守修饰变异的一种。本文所述的编码多肽的每种核酸序列也描述该核酸的每种可能的沉默变异。本领域技术人员应认识到，可修饰核酸中的各密码子(除了 AUG和TGG， AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子，TGG通常是色氨酸的唯一密码子)，以产生功能相同的分子。因此，就表达产物而非实际探针序列而言，编码多肽的核酸的各沉默变异隐含在所述各序列中。至于氨基酸序列，本领域技术人员应认识到，对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行单个取代、缺失或添加以改变、添加或删除所编码序列中一个氨基酸或少量氨基酸是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸被化学上相似的氨基酸所取代。本领域熟知提供功能相似的氨基酸的保守取代表。此类保守修饰的变体包括并不排除本发明的多态性变体、种间同源物和等位基因。以下八组各含有彼此可保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G) ；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K) ；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)； 7)丝氨酸(S)、苏氨酸⑴；和8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton，《蛋白质》(1984))。“标记物”或“可检测部分”是光谱学、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理方式可检测的组合物。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如， ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和可制成可检测的蛋白质，例如将放射性标记物掺入肽或用于检测与肽特异性反应的抗体。用于，例如细胞或核酸、蛋白质或载体的术语“重组”表示该细胞、核酸、蛋白质或载体通过引入异源核酸或蛋白质或天然核酸或蛋白质的变体而得到修饰，或者该细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如重组细胞表达天然(非重组)形式细胞中未发现的基因或表达其它情况下异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。用于核酸诸部分的术语“异源”指该核酸包含在天然情况下彼此没关系的两个或更多个子序列。例如，核酸一般重组产生，具有两个或更多个来自无关基因的序列，它们排列成新的功能性核酸，例如一个来源的启动子和另一来源的编码区。相似地，异源蛋白表示该蛋白包含天然情况下彼此没关系的两个或更多个子序列(例如融合蛋白)。术语“严格杂交条件”指通常在核酸的复杂混合物中，探针与其目标子序列杂交，但不与其他序列杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，不同情况下不同。较长的序列能在较高温度下特异性杂交。核酸杂交的详细指南参见Tijssen，《生物化学和分子生物学技术一与核酸探针杂交》(Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes)，“核酸鉴定的杂交原理和方案概览，，(Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays) (1993)。严格条件通常选择比特定序列在指定离子强度、pH下的解链温度(Tm)低约5-10°C。Tm是50%靶标互补探针与靶序列杂交平衡时的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(靶序列过量，在Tm时50%探针被平衡地占据)。也可加入去稳定剂，如甲酰胺获得严格条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号至少是背景杂交信号的两倍，优选10 倍。示范性的严格杂交条件可以如下所述50%甲酰胺、5x SSC和1%SDS，42°C培育，或者 5x SSC、1% SDS、65°C培育，用 0. 2x SSC 和 0. 1 % SDS 在 65°C洗涤。
如果编码的多肽基本相同，那么在严格条件下彼此不杂交的核酸仍然基本相同。 例如，用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时可能发生这种情况。在这种情况下，核酸一般在中等严格的杂交条件下杂交。示范性“中等严格杂交条件”包括37°C， 在40%甲酰胺、IM NaClU % SDS的缓冲液中杂交，45°C，IX SSC洗涤。阳性杂交至少是背景的两倍。本领域普通技术人员不难认识到，可利用其他杂交和洗涤条件提供类似严格性的条件。测定杂交参数的其它指导见多个参考文献所提供，例如《新编分子生物学实验方法》 (Current Protocols in Molecular Biology)， Ausubel · ，@草俞,禾Ι」5^1 &司(John ffiley&Sons)。对于PCR，低严格性扩增的典型温度是约36°C，但退火温度可根据引物长度而在约32°C和480C之间变动。对于高严格性PCR扩增，典型温度约62°C，但高严格性退火温度根据引物长度和特异性可以是约50°C到约65°C。高严格性和低严格性扩增的典型循环条件包括变性阶段90°C -95°C，30秒-2分钟，退火阶段持续30秒-2分钟，延伸阶段约72°C， 1-2分钟。低和高严格性扩增反应的方案和指导见，例如Irmis等.(1990)《PCR方案方法和应用指南》(PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications)，学术出版社 (Academic Press, Inc.)纽约)。“抗体”指特异性结合并识别抗原，包含来自免疫球蛋白基因框架区的多肽或其片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链归类为Y、μ、α、δ或ε，进而分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。抗体的抗原结合区通常对结合的特异性和亲和力至关重要。示范性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。各四聚体由相同的两对多肽链组成，各对有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。各链的N末端确定约 100-110或更多氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链和可变重链(Vh) 分别指这些轻链和重链。抗体可以例如完整的免疫球蛋白或用不同肽酶消化产生许多良好表征的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区中二硫键下消化抗体，产生F(ab)' 2，Fab的二聚体，其本身是通过二硫键连接于Vh-ChI的轻链。可在温和条件下还原F(ab) ‘ 2以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab)' 2 二聚体转化为Fab'单体。Fab，单体主要是含部分绞链区的 Fab (参见《基础免疫学》(Fundamental Immunology) (Paul编·，第3版1993)。虽然根据完整抗体的消化定义了各种抗体片段，但是本领域技术人员应理解，可用化学方法或通过重组DNA方法从头合成此类片段。因此，本文所用的术语抗体还包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或采用重组DNA方法从头合成的那些(例如，单链Fv)或利用噬菌体展示文库鉴定的那些(参见，例如 McCafferty 等·，Nature 348 :552_554 (1990))。为制备本发明的合适抗体和本发明的应用，例如重组体、单克隆或多克隆抗体，可采用本领域已知的多种技术(参见，例如Kohler和Milstein，Nature 256 :495_497 (1975)； Kozbor 等.，Immunology Today 4 72(1983) ；Cole 等.，第 77-96 页，刊于《多克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy), Alan R. Liss, Inc. (1985)； Coligan，《新编免疫学实验方法》(Current Protocols in Immunology) (1991) ；Harlow 和 Lane,《抗体，实验室手册》(Antibodies, A Laboratory Manual) (1988)；禾口 Goding,《多克隆抗体原理和实践》(Monoclonal Antibodies principles and Practice)(第 2 版.1986))。可从细胞克隆编码感兴趣抗体的重链和轻链的基因，例如可从杂交瘤克隆编码单克隆抗体的基因并用于产生重组单克隆抗体。还可从杂交瘤或浆细胞制备编码单克隆抗体的重链和轻链的基因文库。重链和轻链基因产物的随机组合可产生具有不同抗原性特异性的大抗体集合(参见，例如Kuby，《免疫学》(Immimology)(第3版.1997))。 可改进产生单链抗体或重组抗体的技术(美国专利4，946，778，美国专利4，816，567)来产生本发明多肽的抗体。转基因小鼠或其它生物，例如其它哺乳动物也可用于表达人源化或人抗体(参见，例如美国专利号5，545，807 ；5, 545,806 ；5, 569,825 ；5, 625, 126 ； 5,633,425 ；5，661，016 ；Marks 等·，Bio/Technology 10 :779_783(1992) ；Lonberg 等·， Nature 368 856-859 (1994) ；Morrison,Nature 368 812-13 (1994) ；Fishwild^. ,Nature Biotechnology 14 845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996); Lonberg 禾口 Huszar，Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93 (1995))。或者，可采用噬菌体展示技术鉴定特异性结合所选抗原的抗体和异质Fab片段(参见，例如McCafTerty等.，Nature 348:552-554(1990) ；Marks 等.，Biotechnology 10:779-783(1992))。还可将抗体制成双特异性，即，能识别两种不同抗原(参见，例如WO 93/08829，Traunecker等·，EMBO J. 10 3655-3659(1991)；和 Suresh 等.，Methods in Enzymology 121 :210(1986))。抗体还可以是异质偶联物，例如两个共价连接的抗体或免疫毒素(参见，例如美国专利号4，676，980 ； WO 91/00360 ；WO 92/200373 ；禾口 EP03089)。本领域熟知人源化或灵长类化非人抗体的方法。人源化抗体中通常引入非人来源的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常称为输入残基，通常取自输入可变区。基本上可按照Winter和同事的方法(参见，例如Jones等.，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等.，Nature 332 323-327 (1988) ；Verhoeyen 等.，Science 239 1534-1536 (1988)和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992))，通过用啮齿类CDR或CDR序列取代人抗体的相应序列进行人源化。因此，此类人源化抗体是嵌合型抗体(美国专利号4，816，567)，其中明显小于完整的人可变区被非人物种的相应序列取代。 实际上，人源化抗体通常是一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿类抗体中类似位点的残基取代的人抗体。“嵌合型抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分经改变、替换或更换， 从而抗原结合位点(可变区)连接于类别、效应物功能和/或物种不同或改变的恒定区，或赋予嵌合型抗体新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b) 可变区或其一部分经改变、替换或更换，从而可变区具有不同或改变的抗原特异性。本发明的优选抗体和应用包括人源化和/或嵌合型单克隆抗体。在一个实施方式中，所述抗体偶联于“效应物”部分。效应物部分可以是任何数量的分子，包括标记部分，例如放射性标记物或荧光标记物，或者可以是治疗部分。在一方面， 抗体调节蛋白质的活性。此类效应部分包括但不限于抗肿瘤药物、毒素、放射性试剂、细胞因子、二抗或酶。此外，本发明提供其中本发明抗体连接于将前药转化成细胞毒性剂的酶的实施方式。可利用免疫偶联物将效应物部分靶向N-钙黏着蛋白阳性细胞，特别是表达N-钙黏着蛋白的细胞。观察大致类似加载了测试和对照样品的凝胶条带时不难发现此类差异。
13细胞毒性剂的例子包括但不限于蓖麻毒蛋白、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟炭疽菌素二酮、 放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白和糖皮质激素及其它化疗剂以及放射性同位素。合适的可检测标记包括但不限于放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。在一些实施方式中，本发明提供N-钙黏着蛋白的抗体。可单独或与效应物部分偶联而全身性应用N-钙黏着蛋白抗体以治疗癌症(例如前列腺或膀胱癌)。偶联毒性试剂， 如蓖麻毒蛋白的N-钙黏着蛋白以及未偶联的抗体可以是天然靶向携带N-钙黏着蛋白的前列腺癌细胞的有用治疗剂。此类抗体可用于阻断侵袭性。用于本发明的合适N-钙黏着蛋白抗体包括但不限于EC4 1H7、1F12、2B3以及通过引用全文纳入本文的USSN 61/113,042 和61/113，054中公开的抗体。此外，包含任何本发明单克隆抗体的抗原结合区的本发明重组蛋白可用于治疗癌症。在此类情况中，重组蛋白的抗原结合区连接于具有治疗活性的第二蛋白的至少一个功能活性部分。所述第二蛋白质可包括但不限于酶、淋巴因子、制瘤素或毒素。合适的毒素包括阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙、长春新碱、长春碱、 秋水仙素、二羟炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、糖皮质激素和放射性同位素。将治疗剂偶联于抗体的技术是众所周知的(参见，例如Arnon等.，“癌症治疗中用于药物免疫革巴向的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)“，刊于《单克隆抗体和癌症治疗》(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy), Reisfeld ^.(H),第 243-56 M (Alan R. Liss, Inc. 1985)； Hellstrom等·，“药物递送的抗体(Antibodies For Drug Delivery)“刊于《受控药物递送》(Controlled Drug Delivery)(第 2 版)，Robinson 等·(编)，第 623-53 页(M-D 公司(Marcel Dekker，Inc.) 1987) ；Thorpe,“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体综述(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy :A Review)“干丨J于 《单克隆抗体，84 生物学和临床应用》(Monoclonal Antibodies' 84 =Biological And Clinical Applications)，Pinchera 等·(编)，第 475-506 页(1985)；和 Thorpe 等·，“ 抗体-毒素偶联物的制备和细胞毒性特性(The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates)“ ， Immunol. Rev. ,62 :119—58 (1982))。短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)免疫反应性”指蛋白质或肽时，常是在蛋白质和其它生物物质的异质群体中，指确定蛋白质是否存在的结合反应。因此，在指定的免疫试验条件下，指定抗体与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍， 更常见是超过背景10倍到100倍。在此类条件下特异性结合于抗体要求对特定蛋白质的特异性经选择的抗体。例如，可选择多克隆抗体，从而仅获得与所选抗原而非其他蛋白质发生特异性免疫反应的那些多克隆抗体。可通过扣除与其它分子交叉反应的抗体来进行该选择。可采用各种免疫测定形式以选择与特定蛋白质发生特异性免疫反应的抗体。例如，常规采用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质发生特异性免疫反应的抗体(参见，例如可用于测定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述见Harlow和Lane，“利用抗体，实验室手册”(Using Antibodies, A Laboratory Manual) (1998))。
本文的“治疗有效剂量或用量”表示产生给药所需效应的剂量。精确剂量和制剂取决于治疗目的，本领域技术人员采用已知技术可确定(参见，例如Lieberman，《药物剂型》(Pharmaceutical Dosage Forms)(第1-3卷，1992) ；Lloyd，《药物配制的领域、科学和技术》(The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding) (1999) ； ((|f 明顿药学科学和实践》(Remington :The Science and Practice of Pharmacy)，第 20 版， Gennaro 编，(2003)，和 Pickar，《剂量计算》(Dosage Calculations) (1999))。术语"药学上可接受的盐"或"药学上可接受的载体"应包括根据本文所述化合物上发现的具体取代基，用相对无毒的酸或碱制备的活性化合物的盐。当本发明化合物含有相对酸性的官能团时，可通过使中性形式的此类化合物接触足量所需碱来获得碱加成盐，所述碱可采用纯碱形式或在合适惰性溶剂中的形式。药学上可接受的碱加成盐的例子包括钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基或镁盐，或类似盐。当本发明化合物含有相对碱性的官能团时，可通过使中性形式的此类化合物接触足量所需酸获得酸加成盐，所述酸可采用纯酸形式或在合适惰性溶剂中的形式。药学上可接受的酸加成盐的例子包括衍生自无机酸的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐，磷酸盐、磷酸氢盐，磷酸二氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、氢碘酸盐或亚磷酸盐等，以及衍生自相对无毒的有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、异丁酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、富马酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、苯磺酸盐、对甲基苯磺酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐等。也包括氨基酸如精氨酸等的盐，和有机酸如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等的盐(参见例如，Berge 等，Journal of Pharmaceutical Science 66:1-19(1977))。本发明的某些特定化合物含有能够使该化合物转化为碱或酸加成盐的碱性和酸性官能团。本领域技术人员已知的其它药学上可接受的运载体适用于本发明。可将所述盐与碱或酸接触，并以常规方式分离母体化合物，从而再生中性形式的该化合物。该化合物的母体形式的某些物理特性(例如在极性溶剂中的溶解度)与各种盐形式不同，但为本发明的目的，该盐等同于该化合物的母体形式。除盐形式以外，本发明还提供前药形式的化合物。本文所述化合物的前药是在生理学条件下不难进行化学改变从而提供本发明化合物的那些化合物。此外，在离体环境下， 前药可通过化学或生化方法化为本发明化合物。例如，当放置在含有合适酶或化学试剂的透皮贴片储库中时，前药可缓慢转化为本发明化合物。本发明的某些化合物可以非溶剂化形式以及溶剂化形式存在，包括水合形式。通常，溶剂化形式等同于非溶剂化形式，均应包括在本发明范围内。本发明某些化合物可以多晶型或无定形形式存在。通常，在本发明所考虑的应用中所有物理形式是等同的，均应包括在本发明范围内。本发明某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物、非对映体、 几何异构体和单个异构体均应包括在本发明范围内。上皮向间充质转变(EMT)指上皮肿瘤细胞获得基质特征。在癌症中，EMT与侵袭性和能动行为(motile behavior)相关，可能是作为转移基础的核心过程。EMT与不佳预后相关，由多种转录因子如SNAIL、SLUG和TWIST介导。详细实施方式本发明提供为具有表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症风险的个体作诊断和提供预后的方法，特别是泌尿生殖癌症，包括前列腺和/或膀胱癌。所述方法通常包括使具有表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症风险的个体的测试组织样品接触特异性结合N-钙黏着蛋白的抗体；和测定所述测试组织样品中N-钙黏着蛋白存在与否，与表达 N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症的已知阴性个体的对照组织样品作比较。所述组织样品通常是血清，但也可以是活检的组织，特别是来自泌尿生殖组织，包括前列腺组织或膀胱组织。所述抗体通常是单克隆抗体。与已知未患癌症的个体的对照组织样品相比，在测试组织样品中检测到较高水平的N-钙黏着蛋白，例如高10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70 %、80 %、90 %、100 %、2-倍、3-倍、4-倍或更高时，表明表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症的诊断为阳性。可采用例如本领域已知的标准ELISA技术实施检测方法(综述见 Gosling，《免疫测定实用方案》(Immunoassays :A Practical Approach)，2000，牛津大学出版社)。通过用，例如放射性同位素、荧光标记物、酶或本领域已知的任何其它可检测标记物标记一抗或二抗来实现检测。在另一个实施方式中，本发明提供为具有表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症风险的个体作诊断和提供预后的方法，特别是前列腺或膀胱癌，所述方法通过使具有表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症风险的个体的测试组织样品接触各自与N-钙黏着蛋白核酸特异性杂交的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的引物组；扩增所述样品中的N-钙黏着蛋白核酸；和测定测试组织样品中N-黏着蛋白核酸存在与否，与表达N-黏着蛋白或 mRNA转录物的癌症的已知阴性个体的对照组织样品作比较。所述组织样品仍通常是血清， 但也可以是活检的组织，特别是来自泌尿生殖组织，包括前列腺或膀胱组织。与已知未患癌症的个体的对照组织样品相比，在测试组织样品中检测到较高水平的N-钙黏着蛋白转录 RNA时，表明表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症的诊断为阳性。本发明还提供提高表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症中对癌症治疗反应的方法，所述方法给予抑制N-钙黏着蛋白分别结合癌症肿瘤组织细胞上N-钙黏着蛋白受体的治疗有效量的化合物。在一些实施方式中，抑制N-钙黏着蛋白结合其受体的方法与另一抗癌症治疗，包括例如已知的化疗、免疫治疗和放疗共同实施，以便逆转耐药性、肿瘤发展和转移。本发明还提供抑制表达N-钙黏着蛋白的肿瘤生长并促进其消退的方法，所述方法包括抑制N-钙黏着蛋白分别结合肿瘤组织细胞上的N-钙黏着蛋白受体。可通过给予有此需要的个体抑制N-钙黏着蛋白分别结合N-钙黏着蛋白受体的充足量的化合物来实施该方法。在一些实施方式中，所述化合物特异性结合N-钙黏着蛋白。在一些实施方式中，所述化合物特异性结合N-钙黏着蛋白受体。在一些实施方式中，所述化合物阻止N-钙黏着蛋白的转录或翻译。所述方法尤其可用于治疗前列腺和膀胱癌。在一些实施方式中，所述化合物包括多肽，包括N-钙黏着蛋白多肽的抗体或类似物或片段。 所述方法尤其可应用于前列腺和膀胱癌的诊断、预后和治疗。在某些实施方式中， 所述方法可应用于激素难治性或治疗耐受性的癌症。在某些实施方式中，所述方法可应用于转移性癌症。例如，可采用比较N-钙黏着蛋白和/或mRNA的差异性表达来确定患有表达N-钙黏着蛋白或mRNA转录物的癌症的个体的癌症阶段。 治疗通常包括经由可接受的给药途径，如静脉内注射(IV)反复给予有效剂量的抗-N-钙黏着蛋白抗体、免疫偶联物、抑制剂和siRNA制品。剂量取决于本领域技术人员通常理解的各种因素，包括但不限于癌症的类型和严重性，癌症的等级或阶段、所用试剂的结合亲和力和半衰期，患者中的N-钙黏着蛋白表达程度，脱落N-钙黏着抗原的循环程度，所需的稳态抗体浓度水平，治疗频率和与本发明治疗方法联用的化疗剂的影响。每日剂量通常可以是约0. l-100mg/kg。每周10-500mg剂量的mAb或免疫偶联物可能是有效和良好耐受的，虽然更高的每周剂量也可能是合适和/或良好耐受的。决定合适剂量的主要决定因素是具体情况中达到治疗有效所必需的特定试剂用量。可能需要反复给药以实现肿瘤抑制或消退。初始负荷剂量可能较高。可输注给予初始负荷剂量。可类似地给予周期维持剂量， 只要初始剂量良好耐受。还可直接给予试剂，在某些情况下可能有利。例如，对于膀胱癌的治疗，可将试剂直接注射入膀胱。由于直接给予膀胱的试剂可从患者快速清除，可有效利用非人或嵌合型抗体而没有抗原性的明显并发症。本发明还提供经配制而含有N-钙黏着蛋白或其片段的疫苗。肿瘤抗原在疫苗中的应用以便产生用于抗癌症治疗的体液和细胞介导的免疫是本领域熟知的，例如已在前列腺癌中利用人 PSMA 和啮齿类 PAP 免疫原(Hodge 等·，1995，Int. J. Cancer 63 :231_237 ； Fong等·，1997，J. Immunol. 159 :3113-3117)。利用N-钙黏着蛋白或其片段或N-钙黏着蛋白编码核酸分子和能表达并适当呈递N-钙黏着蛋白免疫原的重组载体不难实施此类方法。例如，可利用病毒基因递送系统递送N-钙黏着蛋白编码核酸分子。可用于实施本发明该方面的各种病毒基因递送系统包括但不限于牛痘病毒、禽痘病毒、金丝雀痘、腺病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒、腺相关病毒、慢病毒和辛德毕斯病毒(Restifo，1996，Curr. Opin. Immunol. 8 :658_663)。还可通过利用引入患者(例如，肌肉内)的编码N-钙黏着蛋白或其片段的裸DNA，利用非病毒递送系统诱导抗肿瘤反应。在一个实施方式中，可利用全长人N-钙黏着蛋白cDNA。在另一个实施方式中，可利用编码特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)表位的N-钙黏着蛋白核酸分子。可采用特定算法(e.g.，Epimer，布朗大学)确定 CTL表位来鉴定N-钙黏着蛋白内能最佳结合指定HLA等位基因的肽。还可采用各种离体方案。一个方法包括利用树突细胞将N-钙黏着蛋白抗原呈递至患者的免疫系统。树突细胞表达I和II类MHC，B7辅刺激因子和IL-12，因此是高度特化的抗原呈递细胞。在前列腺癌中，可利用N-钙黏着蛋白的肽脉冲的自体树突细胞刺激前列腺癌患者的免疫系统(Tjoa 等.，1996，Prostate 28 65~69 ；Murphy 等.，1996，Prostate 29 371-380)。可利用树突细胞在I和II类MHC分子中将N-钙黏着蛋白肽呈递至T细胞。 在一个实施方式中，用能结合MHC分子的N-钙黏着蛋白肽脉冲自体树突细胞。在另一个实施方式中，用完全N-钙黏着蛋白脉冲树突细胞。还有另一个实施方式涉及利用本领域已知的各种实施载体，例如腺病毒(Arthur等.，1997，Cancer Gene Ther. 4 17-25)、逆转录病毒(Henderson 等·，1996，Cancer Res. 56 3763-3770)、慢病毒、腺相关病毒、DNA 转染 (Ribas 等·，1997，Cancer Res. 57 :2865_2869)和肿瘤衍生的 RNA 转染(Ashley 等·，1997， J. Exp. Med. 186 1177-1182)工程改造树突细胞中N-钙黏着蛋白基因的表达。抗-独特型抗-N-钙黏着蛋白抗体也可用于抗癌症治疗中作为疫苗以便分别诱导针对表达N-钙黏着蛋白的细胞的免疫应答。具体地说，本领域熟知抗_独特型抗体的产生方法，不难适用于产生分别模拟N-钙黏着蛋白上表位的抗_独特型抗-N-钙黏着蛋白抗体
17(参见，例如 Wagner 等.，1997，Hybridoma 16 33-40 ；Foon 等.，1995，J Clin Invest 96 334-342 ；HerIyn 等.，1996，Cancer Immunol Immunother 43 :65_76)。此类抗-独特型抗体可用于目前用抗肿瘤抗原的其它抗独特型抗体实施的抗独特型治疗。可采用遗传免疫方法产生针对表达N-该黏着蛋白的癌症细胞的预防性或治疗性体液和细胞免疫应答。利用本文所述的N-钙黏着蛋白编码DNA分子，可将包含编码N-钙黏着蛋白/免疫原的DNA和适当调控序列的构建物直接注射到个体的肌肉或皮肤内，从而该肌肉或皮肤的细胞吸收该构建物并表达编码的N-钙黏着蛋白/免疫原。N-钙黏着蛋白 /免疫原可表达成细胞表面蛋白或被分泌出。N-钙黏着蛋白/免疫原的表达导致产生抗前列腺癌的预防性或治疗性体液和细胞免疫。可采用本领域已知的各种预防性和治疗性遗传免疫技术(综述参见因特网址www. genweb. com公布的信息和参考文献)。本发明还提供抑制在其细胞表面表达多种N-钙黏着蛋白抗原的细胞的细胞活性 (例如，细胞增殖、活化或繁殖)的方法。该方法包括使本发明的免疫偶联物(例如，异质或均质混合物)与细胞反应，从而细胞表面上的N-钙黏着蛋白抗原形成含免疫偶联物的复合物。细胞表面上N-钙黏着蛋白抗原的数量越多，可分别使用的N-钙黏着蛋白-抗体复合物的数量越多。N-钙黏着蛋白-抗体复合物的数量越多，抑制的细胞活性越大。异质混合物包含识别不同或相同表位的N-钙黏着蛋白抗体，各抗体偶联于相同或不同的治疗剂。均质混合物包含识别相同表位的抗体，各抗体偶联于相同的治疗剂。 本发明还提供通过分别阻断N-钙黏着蛋白结合其受体来抑制N-钙黏着蛋白的生物学活性的方法。所述方法包括在允许N-钙黏着蛋白-免疫偶联物或N-钙黏着蛋白-抗体复合物(形成)的条件下使一定量的N-钙黏着蛋白与本发明的抗体或免疫偶联物接触， 藉此分别阻断N-钙黏着蛋白结合其配体并抑制N-钙黏着蛋白的活性。在一些实施方式中，本发明提供治疗癌症，特别是表达N-钙黏着蛋白的癌症，或抑制表达N-钙黏着蛋白的癌症细胞生长的方法，所述方法通过用抑制癌症细胞生长有效量的识别并结合N-钙黏着蛋白的抗体或其片段治疗对象或使癌症细胞与抑制癌症细胞生长有效量的识别并结合N-钙黏着蛋白的抗体或其片段接触。在一些实施方式中，所述癌症细胞是前列腺癌细胞或膀胱癌细胞。接触的抗体可以是单克隆抗体和/或嵌合型抗体。在一些实施方式中，嵌合型抗体包含人免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，抗体是人抗体或包含人免疫球蛋白恒定区。在其它实施方式中，抗体片段包含？油1(油)2或？1在其它实施方式中，片段包含具有抗原结合区的重组蛋白。在另一个实施方式中，本发明提供治疗癌症，特别是表达N-钙黏着蛋白的癌症或选择性抑制表达N-钙黏着蛋白抗原的细胞的方法，所述方法通过使足以抑制该细胞用量的本发明任一种免疫偶联物或免疫偶联物的组合与细胞反应。此类用量包括杀死细胞的用量或足以抑制细胞生长或增殖的用量。如上所述，剂量和给药方案取决于待治疗疾病或病症的N-钙黏着蛋白相关性质、其群体、给予抗体的部位、具体免疫毒素的性质和患者。例如，免疫偶联物的用量可以是0. l-200mg/kg患者重量。免疫偶联物可包含连接于治疗剂的抗-N-钙黏着蛋白抗体或片段。治疗剂可以是细胞毒性剂。细胞毒性剂可选自下组蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲菌素(sarcin)、白树毒素(gelonin)、迈托毒素(mitogellin)、局限曲霉素(retstrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素、麻疯树逆境蛋白(curicin)、巴豆毒蛋白、刺孢霉素、肥皂草(Sapaonaria officinalis)抑制剂、类美坦西醇和糖皮质激素、蓖麻毒蛋白。治疗剂可以是放射性同位素。治疗性同位素可选自下组212Bi、131I、mIn、9°Y和 186Re。在任何上述实施方式中，还可给予化疗药物和/或放疗。在一些实施方式中，患者还接受激素拮抗剂治疗。可将抗体静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内或真皮内给予患者而使患者与抗体或抗体片段接触。在一些实施方式中，患者患有泌尿生殖癌症(例如，膀胱癌、 前列腺癌)。在上述一些实施方式中，患者患有前列腺癌，还任选接受患者激素消融治疗 (patient hormone ablation therapy)。在一些实施方式中，所述接触包括将抗体直接给予到癌症或癌症的转移灶中。在一些实施方式中，免疫偶联物具有作为小分子的细胞毒性剂。毒素，如美登素、 类美坦西醇、皂草毒蛋白、白树毒素、蓖麻毒蛋白或刺孢霉素和它们的类似物或衍生物也是合适的。可偶联于抗-N-钙黏着蛋白抗体的其他细胞毒性剂包括BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶。还可利用酶促活性毒素及其片段。可采用已知方式(例如，双功能接头、 融合蛋白)将放射性-效应物部分掺入偶联物。本发明抗体还可偶联于效应物部分，其是将前药转化成活性化疗剂的酶。参见，WO 88/07378 ；美国专利号4，975，278 ；和美国专利号 6，949，245。抗体或免疫偶联物可任选连接于非蛋白聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)。可采用本领域熟知的方法制备抗体和细胞毒性剂的偶联物(参见美国专利号 6，949，245)。例如，可利用各种双功能蛋白偶联剂，例如N-琥珀酰亚胺基_3_(2_吡啶二硫) 丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如，己二酸亚氨酸二甲酯(dimethyl adipimidate) HCL)、活性酯(例如，二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(例如，戊二醛)、双叠氮基化合物 (例如，双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如，双_(对-重氮苯甲酰基 (diazoniumbenzoyl))-乙二胺)、二异氰酸酯(例如，亚苄基(tolyene) 2,6- 二异氰酸酯) 和双活性氟化合物(例如，1，5-二氟-2，4-二硝基苯)来制备偶联物。例如，可如Vitetta 等.Science 238 =1098(1987)所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳_14_标记的1_异硫氰酸酯基苄基(iS0thi0Cyanat0benZyl)-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是放射性核苷酸与抗体偶联的示范性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞中细胞毒性药物释放的“可切割接头”。例如，可利用酸不稳定的接头、肽酶-敏感接头、二甲基接头或含二硫键的接头(Chari 等· Cancer Research 52 127-131 (1992))。给药和配制方法按照已知方法，如静脉内给药(如作为大丸剂)或通过一定时期的连续输注，肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部或吸入途径将抗-N-钙黏着蛋白抗体或免疫偶联物给予人患者。优选静脉内或皮下给予抗体。给药可以是局部或全身性的。给予的组合物通常包含溶解于药学上可接受的载体，优选水性载体的本文所述试剂(例如，N-钙黏着蛋白抑制剂、N-钙黏着蛋白抗体和免疫偶联物，N-钙黏着蛋白siRNA和它们的载体)。可利用各种水性载体，例如缓冲盐溶液等。这些溶液是无菌的，通常不含有害物质。这些组合物可经常规的众所周知的灭菌技术灭菌。该组合物可含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如PH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、 氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的活性剂浓度可广泛变化，主要根据液体体积、粘度、体重等因素，按照所选的特定给药方式和患者需要作选择。因此，静脉内给予的典型药物组合物根据试剂而变化。制备可胃肠外给予的组合物的实际方法是本领域技术人员已知或显而易见的，这些方法在例如《雷明顿药物科学》 (Remington' s Pharmaceutical Science),第 15 版·，马克出版公司(Mack Publishing Company)，伊斯顿，宾夕法尼亚州.(1980)等出版物中有更详细的描述。根据给药方法，可给予各种单位剂型的药物组合物。例如，适合口服给予的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。口服给予时，公认应保护抗体免遭消化。 这通常可通过以下方式实现用赋予分子耐受酸性和酶促水解的组合物将分子配制成复合物，或将分子包装入适当耐受的运载体，如脂质体或保护屏障。本领域熟知保护试剂免遭消化的方法。具体地说，将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备本发明所用的抗体和免疫偶联物及抑制剂的药物制剂。此类制剂可以是冻干制剂或水性溶液。所用剂量和浓度的可接受载体、赋形剂或稳定剂对接受者无毒。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、防腐剂、低分子量多肽；蛋白质，如血清白蛋白或明胶，或亲水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyllolidone)；和氨基酸、单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；离子和非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯)；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂。可将抗体配制成 0. 5-200mg/ml 或 10_50mg/ml 的浓度。制剂还可提供其它活性化合物，包括化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和抗-激素剂。还可将活性成分制备成缓释制品(例如，固体疏水性聚合物(例如，聚酯，水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯的半透基质)。还可将抗体和免疫偶联物包埋在通过(例如)凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例子分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，包埋入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或包埋入大乳液 (macroemulsion)中。可为治疗性或预防性治疗给予组合物。在治疗性应用中，将“治疗有效剂量”的组合物给予患有疾病(例如，癌症)的患者。该应用的有效量取决于疾病的严重程度和患者的总体健康状况。可根据所需以及患者耐受的剂量和频率单次或多次给予组合物。为本发明的目的，“患者”或“对象”包括人和其它动物，特别是哺乳动物。因此，所述方法适用于人治疗和兽医应用。在优选的实施方式中，所述患者是哺乳动物，优选灵长类，在最优选的实施方式中，所述患者是人。其它已知的癌症治疗可与本发明方法联用。例如，本发明应用的组合物还可用于使细胞对其它癌症治疗剂，如5FU、长春碱、放线菌素D、顺钼、氨甲喋呤等靶向或致敏。在其它实施方式中，本发明方法可与其它癌症治疗(例如，根治性前列腺切除术)、放疗(外束放疗或短程治疗)、激素治疗(例如，睾丸切除术，LHRH-类似物治疗以抑制睾酮产生，抗-雄激素治疗)或化疗联用。根治性前列腺切除术包括除去整个前列腺加上一些周围组织。在认为癌症未扩散到该组织外时通常采用该治疗。放疗通常用于治疗仍局限于前列腺或扩散到附近组织的前列腺癌。如果该疾病是晚期的，可利用辐射减少肿瘤的大小。激素治疗常用于前列腺癌扩散到前列腺以外或复发的患者。激素治疗的目的是降低雄性激素、雄激素的水平，藉此导致前列腺癌缩小或生长更慢。促黄体生成激素释放激素 (LHRH)激动剂减少睾酮的产生。可每月或以更长的间隔注射这些试剂。两种此类类似物是亮丙瑞林和戈舍瑞林。还可利用抗-雄激素(例如，氟他米特、比卡鲁胺和尼鲁米特)。 总雄激素阻断指联用抗_雄激素与睾丸切除术或LHRH类似物，称为s组合。对于前列腺癌扩散到前列腺以外和激素治疗失效的患者，化疗是一种选择。不指望破坏所有癌细胞，但其可能减缓肿瘤生长并减轻疼痛。用于治疗激素治疗后复发或继续生长并扩散的前列腺癌的一些化疗药物包括阿霉素(亚德里亚霉素)、雌莫司汀、依托泊甙、米托蒽醌、长春碱和紫杉醇。常组合给予两种或更多种药物以降低癌症细胞对化疗变得耐受的可能性。小细胞癌是更可能对化疗而非激素治疗起反应的罕见前列腺癌类型。在一些实施方式中，还与本发明所用的N-钙黏着蛋白抗体、N-钙黏着蛋白结合抑制剂或N-钙黏着蛋白siRNA分子组合给予“心脏保护剂”(参见，美国专利号6，949，245)。 心脏保护剂是防止或降低与将药物，例如蒽环类抗生素给予患者相关的心肌功能失常 (即，心肌病和/或充血性心力衰竭)的化合物或组合物。心脏保护剂可以，例如阻断或降低自由基介导的心脏中毒作用和/或防止或降低氧化应激损伤。本定义包括的心脏保护剂的例子包括铁螯合剂右雷佐生(ICRF-187) (Seifert 等.The Annals of Pharmacotherapy 28 1063-1072 (1994))；降脂剂和/或抗氧化剂，如普罗布考(Singal等· J. Mol. Cell Cardiol. 27 1055-1063 (1995))；氨磷汀(氨基巯基2-[ (3-氨基丙基)氨基]乙硫醇-二氢磷酸酯，也称为WR-2721，及其去磷酸化细胞摄取形式，称为WR-1065)和S_3_(3_甲基氨基丙基氨基)丙基磷_硫代酸(WR-151327)，参见Green等· Cancer Research 54:738-741(1994)；地高辛(Bristow，M. R.刊于Bristow M R 编，“药物诱导的心脏病”(Drug-Induced Heart Disease).纽约Elsevier 191-215(1980)) ；β-阻断剂，如美托洛尔(Hjalmarson 等· Drugs 47 :±曾干Ij 4 :31_9 (1994)；和 Shaddy 等· Am. Heart J. 129 197-9(1995))；维生素Ε;抗坏血酸(维生素C)；自由基清除剂，如齐墩果醇酸、熊果酸和 N-乙酰半胱氨酸(NAC)；自旋俘获化合物，如α-苯基-叔丁基硝酮(PBN) ； (Paracchini 等.，Anticancer Res. 13 1607-1612 (1993))；硒代有机化合物，例如 P251 (Elbesen)；等。组合给药包括利用不同制剂或单一药物制剂的共同给药和任一顺序的连续给药， 其中优选有一段时期两种(或全部)活性剂能同时施加它们的生物学活性。鉴定到的间接或直接调节N-钙黏着蛋白表达和/或功能的分子和化合物可用于治疗分别表达N-钙黏着蛋白的癌症。可单独给予或与常规化疗、放疗或免疫治疗以及目前开发的治疗共同给予N-钙黏着蛋白调节剂。适合口服给予的制剂可由以下组成(a)液体溶液，如悬浮在稀释剂，如水、盐水或PEG 400中的有效量的包装核酸；(b)胶囊、小囊或片剂，各自含有预定量的活性成分，如液体、固体、颗粒或明胶；(c)合适液体配制的悬液；和(d)合适的乳液。片剂形式可包含以下一种或多种物质乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤
21维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸、和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合齐U、稀释齐 、缓冲齐 、润湿剂、防腐剂、调味齐 、色素、崩解剂和药学相容的运载体。锭剂形式可包含调味剂，例如蔗糖配制的活性成分以及软锭剂，其包含惰性基料，如明胶和甘油或蔗糖及阿拉伯胶乳液、凝胶等配制的活性成分，除活性成分外，还含有本领域已知的载体。可将选择的化合物单独或与其它合适的组分一起制成经吸入给予的气溶胶制剂 (即，它们可“雾化”)。可将气溶胶制剂配制到可接受的加压推进剂，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等中。直肠给药的合适制剂包括，例如栓剂，其由包装核酸与栓剂基料组成。合适的栓剂基料包括天然或合成的甘油三酯或石蜡烃。此外，还可利用所选化合物与基料的组合物组成的明胶直肠胶囊，所述基料包括，例如液体甘油三酯、聚乙二醇和石蜡烃。适合胃肠外给药，例如通过关节内(关节中)、静脉内、肌肉内、肿瘤内、真皮内、腹膜内和皮下途径的制剂包括水性和非水性的等渗无菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、 抑菌剂和使得制剂与所需接受者的血液等渗的溶质以及水性和非水性无菌悬液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。实施本发明时，可通过，例如静脉内输注、口月艮、 局部、腹膜内、膀胱内或鞘内给予组合物。胃肠外给药、口服给药和静脉内给药是优选的给药方法。化合物的制剂可存在于单剂量或多剂量密封容器，如安瓿和小瓶中。可从上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备注射溶液和悬液。还可通过上述静脉内或胃肠外给予为离体治疗而经核酸转导的细胞。药物制品优选单位剂型。在此类形式中，所述制品再分成含有合适活性组分量的单位剂量。单位剂型可以是包装制品，该包装含有离散量的制品，如小瓶或安瓿中的包装片剂、胶囊和粉末。单位剂型还可以是胶囊、片剂、小囊或锭剂本身，或者其可以是适当数量的任何这些包装形式。如果需要，组合物还可含有其它相容的治疗剂。在缓释制剂中，优选的药物制品递送一种或多种活性N-钙黏着蛋白调节剂，任选与一种或多种其它化疗剂或免疫治疗剂组合。治疗性给予N-钙黏着蛋白调节剂作为增加肿瘤细胞对其它细胞毒性癌症治疗，包括化疗、放疗、免疫治疗和激素治疗敏感性的致敏剂。在癌症治疗的治疗性应用中，本发明药学方法中所用的N-钙黏着蛋白调节剂或抑制剂给予的初始剂量是每日约0. 001mg/kg到约1000mg/kg。可采用的每日剂量范围是约 0. 01mg/kg 到约 500mg/kg、或约 0. lmg/kg 到约 200mg/kg、或约 lmg/kg 到约 100mg/kg、或约 10mg/kg到约50mg/kg。然而，可根据患者的要求、所治疗状况的严重程度和所用化合物改变剂量。例如，可考虑具体患者中诊断出的癌症类型和阶段凭经验决定剂量。就本发明而言，给予患者的剂量应足以随时间在患者中实现有益的治疗反应。在特定患者中伴随给予特定载体或转导的细胞类型的任何不利副作用的存在、性质和程度也决定剂量大小。本领域技术人员能为具体情况确定合适的剂量。一般以低于化合物的最佳剂量的较低剂量开始治疗。随后，小量增加剂量直至获得各情况下的最佳作用。如果需要，为方便起见，可将每日总剂量分成多部分并在一天内给予。通常将本发明所用的药物制品(例如，N-钙黏着蛋白siRNA、N_钙黏着蛋白抗体、 N-钙黏着蛋白疫苗、N-钙黏着蛋白抑制剂和免疫偶联物)递送至哺乳动物，包括人和非人哺乳动物。采用本发明方法治疗的非人哺乳动物包括家养动物(即，犬、猫、鼠、啮齿目和兔形目)和农业动物(牛、马、羊、猪)。N-钙黏着蛋白调节剂的试验可采用各种体外和体内试验，包括基于细胞的模型来评估N-钙黏着蛋白的调节和相应细胞，例如肿瘤细胞增殖的调节。此类试验可用于检验N-钙黏着蛋白的抑制剂和激活剂，由此检验细胞增殖的抑制剂和激活剂，包括化疗敏感性和毒性的调节剂。N-钙黏着蛋白的此类调节剂可用于治疗病理性细胞增殖的相关疾病，例如癌症。采用重组或天然产生的N-钙黏着蛋白，优选人N-钙黏着蛋白检验N-钙黏着蛋白的调节剂。可采用本文所述的各种体外、体内和离体试验检测重组或天然产生的N-钙黏着蛋白或表达N-钙黏着蛋白的细胞的细胞增殖调节作用。可利用影响活性，例如酶活性，如激酶活性、细胞增殖或配体结合(例如，N-钙黏着蛋白受体)的合适物理、化学或表型改变来评估测试化合物对本发明多肽的影响。当利用完整的细胞或动物测定功能效应时， 还可检测各种作用，如配体结合、激酶活性、已知和未表征遗传标记的转录改变(例如， northern印迹)、细胞代谢的改变、细胞增殖相关的改变、细胞表面标记物的表达、DNA合成、标记物和染料稀释试验(例如，GFP和细胞追踪试验)、接触抑制、裸鼠中的肿瘤生长，等
IvTo体外试骑可在体外进行鉴定具有N-钙黏着蛋白调节活性的化合物的试验。此类试验可利用全长N-钙黏着蛋白或其变体(分别参见，例如图6和7)或其突变体或N-钙黏着蛋白的片段。纯化的重组或天然产生的N-钙黏着蛋白可用于本发明的体外方法。除了纯化的 N-钙黏着蛋白外，重组或天然产生的N-钙黏着蛋白可以是细胞裂解物或细胞膜的一部分。 如下所述，结合试验可以是固体状态或可溶性的。所述蛋白质或膜优选共价或非共价结合于固体支持物。本发明的体外试验常是非竞争性或竞争性的底物或配体结合或亲和力试验。其它体外试验包括检测蛋白质的光谱学(例如，荧光、吸光度、折射率)、流体力学(例如，形状)、色谱或溶解特性的改变。其它体外试验包括酶活性试验，如磷酸化或自磷酸化试验。在一个实施方式中，进行高通量结合试验，其中N-钙黏着蛋白或其片段与潜在的调节剂接触并温育合适的时间。在一个实施方式中，潜在的调节剂结合于固体支持物，加入 N-钙黏着蛋白。在另一个实施方式中，N-钙黏着蛋白结合于固体支持物。可利用各种调节剂，如下所述包括有机小分子、肽、抗体和N-钙黏着蛋白配体类似物。可采用各种试验鉴定 N-钙黏着蛋白-调节剂结合情况，包括标记的蛋白质_蛋白质结合试验、电泳迁移率改变、 免疫测定、酶试验，如激酶试验等。在一些情况中，通过利用竞争性结合试验测定候选调节剂的结合，其中在潜在调节剂存在下检测对已知配体或底物结合的干扰。在一个实施方式中，首先用N-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白受体包被微量滴定板， 然后接触可能抑制N-钙黏着蛋白与N-钙黏着蛋白受体结合的一种或多种测试化合物。然后包被蛋白，N-钙黏着蛋白受体或N-钙黏着蛋白的标记(即，荧光、酶、放射性同位素)结合伴侣接触该包被蛋白和测试化合物。视需要，在接触N-钙黏着蛋白、N-钙黏着蛋白受体或测试化合物之间洗去未结合的蛋白质。缺乏可检测的信号表明测试化合物抑制N-钙黏着蛋白分别与N-钙黏着蛋白受体之间的结合相互作用。存在可检测信号(即，荧光、比色、 放射性)表明测试化合物不抑制N-钙黏着蛋白分别与N-钙黏着蛋白受体之间的结合相互作用。将存在或不存在可检测信号与未接触测试化合物，显示未抑制信号的对照样品相比。 在一些实施方式中，结合伴侣未作标记，但接触特异性结合结合伴侣的标记抗体。基于细胞的体内试骑在另一个实施方式中，N-钙黏着蛋白在细胞中表达，检验功能(例如，物理和化学或表型)改变以鉴定N-钙黏着蛋白和细胞增殖，例如肿瘤细胞增殖的调节剂。表达N-钙黏着蛋白的细胞也可用于结合试验和酶试验。可如本文所述检测任何合适的功能作用。例如，细胞形态学(例如，细胞体积、核体积、细胞周长和核周长)、配体结合、激酶活性、凋亡、 细胞表面标记表达、细胞增殖、GFP阳性和染料稀释试验(例如，利用结合细胞膜的染料的细胞追踪试验)、DNA合成试验(例如，3H-胸苷和荧光DNA-结合染料，如BrdU或Hoechst染料及FACS分析)均是利用基于细胞的系统鉴定潜在调节剂的合适试验。此类基于细胞的试验的合适的细胞包括本文所述的原发癌症或肿瘤细胞和细胞系，例如A549 (肺)、MCF7 (乳腺，p53野生型)、H1299 (肺，p53无效(null))、Hela (宫颈)、PC3 (前列腺，p53突变体)、 MDA-MB-231 (乳腺，p53野生型)。癌症细胞系可以是p53突变体、p53无效或表达野生型 p53。N-钙黏着蛋白可以是天然产生或重组的。N-钙黏着蛋白或嵌合型N-钙黏着蛋白的片段也可用于基于细胞的试验。通过检测蛋白质或mRNA的水平可测定细胞N-钙黏着蛋白多肽水平。可采用免疫测定，如蛋白质印迹、ELISA等，利用分别选择性结合N-钙黏着蛋白多肽或其片段的抗体检测N-钙黏着蛋白或N-钙黏着蛋白相关蛋白的水平。为检测mRNA，优选扩增试验，例如采用 PCR、LCR，或杂交试验，例如northern杂交、RNA酶保护、斑点印迹。利用本文所述的直接或间接标记的检测试剂，例如荧光或放射性标记的核酸，放射性或酶标记的抗体等检测蛋白质或mRNA水平。或者，可利用报道基因系统检测N-钙黏着蛋白表达。可采用操作性连接于报道基因，如氯霉素乙酰基转移酶、萤火虫萤光素酶、细菌萤光素酶、半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的N-钙黏着蛋白启动子设计此类系统。此外，感兴趣蛋白质可通过连接于第二报道物，如红色或绿色荧光蛋白而用作间接报道物(参见，例如Mistili和Spector，Nature Biotechnology 15:961-964(1997))。通常将报道构建物转染入细胞。用潜在调节剂处理后，按照本领域技术人员已知的标准技术检测报道基因的转录、翻译或活性量。动物模型细胞增殖的动物模型也可用于筛选细胞增殖的调节剂。类似地，包括基因敲除技术(例如与合适基因靶向载体同源重组所导致)或基因过表达在内的转基因动物技术会导致N-钙黏着蛋白表达不存在或增加。同一技术还可应用于制备敲除细胞。需要时，N-钙黏着蛋白的组织特异性表达或敲除可能是必要的。此类方法产生的转基因动物可用作细胞增殖的动物模型，还可用于筛选细胞增殖的调节剂。可通过同源重组将标记基因或其它异源基因插入小鼠基因组的内源性N-钙黏着蛋白基因位点来产生敲除细胞和转基因小鼠。还可分别用突变型N-钙黏着蛋白基因取代内源性N-钙黏着蛋白或分别突变内源性N-钙黏着蛋白，例如通过接触致癌物来产生此类小鼠。将DNA构建物引入胚胎干细胞的核。将含有新工程改造的遗传学损伤的细胞注射入宿主小鼠胚胎，将该胚胎再植入接受雌鼠。这些胚胎中的一些发育成具有部分衍生自突变型细胞系的生殖细胞的嵌合型小鼠。因此，通过饲养嵌合型小鼠，可能获得含有引入的遗传学损伤的新小鼠谱系(参见，例如Capecchi等.，Science 244:1288(1989))。可按照 Hogan^.，《■#/]、鼠1$月台$1胃￥·》(Miinipuliiting the Mouse Embryo :A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(1988)，《畸胎瘤和胚胎干细胞实验室手册》(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells :A Practical Approach), Robertson编·，IRL 出版社，华盛顿， 哥伦比亚特区.，(1987)，和Pinkert，《转基因动物技术实验室手册》(Transgenic Animal Technology :A Laboratory Handbook)，学术出版社(Academic Press) (2003)获得嵌合型靶向小鼠。示范件试骑软琼脂生长或悬液中的集落形成正常细胞需要固体基片以供粘附和生长。细胞转化时，它们失去该表型，其生长脱离基片。例如，转化的细胞可在搅拌的悬液培养基中生长或悬浮在半固体介质，如半固体或软琼脂中。用肿瘤抑制基因转染时，转化的细胞再生正常的表型并需要固体基片以供粘附和生长。悬浮试验中的软琼脂生长或集落形成可用于鉴定N-钙黏着蛋白调节剂。该试验通常利用转化的宿主细胞(例如，生长在软琼脂上的细胞)。例如，可利用RKO或HCT116细胞系。悬浮试验中的软琼脂生长或集落形成技术见通过引用纳入本文的Freshney，《动物细胞培养基本技术手册》(Culture of Animal Cells a Manual of Basic Technique)，第 3 版.，Wiley-Liss，纽约(1994)所述。还参见通过引用纳入本文的Garkavtsev等.(1996)， 同上的方法章节。生长的接触抑制和密度限制正常细胞通常以平坦和有组织的模式生长在培养皿中直至它们接触其它细胞。当细胞彼此接触时，它们受接触抑制并停止生长。然而，细胞转化时，细胞不受接触抑制并继续在无组织的细胞灶中生长至高密度。因此，转化的细胞生长至高于普通细胞的饱和密度。 可通过正常周围细胞的常规模式内的细胞灶中无方向单层的细胞或圆形细胞形成对其作形态学检测。或者，可采用饱和密度下的[3H]-胸苷标记指数检测生长的密度限制。参见 Freshney (1994)，同上。转化细胞在接触细胞增殖调节剂时，再生正常表型，变得接触抑制并生长至较低密度。可采用生长试验的接触抑制和密度限制来鉴定能抑制宿主细胞的异常增殖和转化的N-钙黏着蛋白调节剂。通常将转化的宿主细胞(例如，未受接触抑制的细胞)用于该试验。例如，可利用RKO或HCT116细胞系。在该试验中，饱和密度下的[3H]-胸苷标记指数是检测生长的密度限制的优选方法。转化的宿主细胞接触潜在的N-钙黏着蛋白调节剂， 在非限制性培养基条件下以饱和密度生长24小时。用放射自显影法测定[3H]-胸苷标记的细胞的百分比。参见Freshney (1994)，同上。与对照(例如，用缺乏插入物的载体转染的转化宿主细胞)相比，接触N-钙黏着蛋白调节剂的宿主细胞产生较低的标记指数。生长因子或血清依赖性生长因子或血清依赖性可用作鉴定N-钙黏着蛋白调节剂的试验。转化细胞的血清依赖性低于正常细胞(参见，例如 Temin，J. Natl. Cancer Insti. 37 167-175 (1966)； Eagle 等·，J. Exp. Med. 131 836-879 (1970)) ；Freshney，同上。这部分是因为转化细胞释放各种生长因子。当转化细胞接触N-钙黏着蛋白调节剂时，细胞再次获得血清依赖性，释放较低水平的生长因子。肿瘤特异性标记水平肿瘤细胞释放的某些因子(下文称为“肿瘤特异性标记”)数量高于正常细胞。例如，人神经胶质瘤中纤溶酶原激活物(PA)的释放水平高于正常脑细胞(参见，例如Gullino，“血管生成、肿瘤血管形成和肿瘤生长的潜在干扰”(Angiogenesis，tumor vascularization, and potential interference with tumor growth).干丨_^Mihich (编) 《癌症的生物学反应》“Biological Responses in Cancer. ”纽约，学术出版社，第178-184 页(1985))。类似地，肿瘤细胞中肿瘤血管生成因子(TAF)的释放水平高于正常细胞。参见， 例如Folkman，“血管生成禾口癌症”(Angiogenesis and cancer),Sem Cancer Biol. (1992))。可检验肿瘤特异性标记物来鉴定降低宿主细胞释放的这些标记物水平的N-钙黏着蛋白调节剂。通常利用转化或致瘤性宿主细胞。检测这些因子释放的各种技术见 Freshney (1994)，同上描述。还可参见 Unkless 等.，J. Biol. Chem. 249 :4295_4305 (1974)； Strickland 和 Beers, J. Biol.Chem. 251 :5694_5702(1976) ；Whur 等·，Br.J. Cancer 42 305-312(1980) ；Gulino，血管生成、肿瘤血管形成和肿瘤生长的潜在干扰.刊于Mihich， Ε·(编)《癌症的生物学反应》纽约，Plenum (1985) ；Freshney Anticancer Res. 5 111-130(1985)。进入基质胶的侵袭性可利用进入基质胶或一些其它胞外基质成分的侵袭性程度作为试验来鉴定能抑制异常细胞增殖和肿瘤生长的N-钙黏着蛋白调节剂。肿瘤细胞在恶性肿瘤和细胞进入基质胶或一些其它胞外基质成分的侵袭性之间表现出良好相关性。在该试验中，通常利用致瘤细胞作为宿主细胞。因此，通过检测引入潜在调节剂前后宿主细胞之间的侵袭性水平的改变来鉴定N-钙黏着蛋白调节剂。如果某化合物调节N-钙黏着蛋白，其在致瘤性宿主细胞中的表达会影响侵袭性。可采用Freshney (1994)，同上中描述的技术。简言之，可利用包被有基质胶或一些其它胞外基质成分的滤膜检测宿主细胞的侵入水平。渗入凝胶或到达滤膜的远侧分级为侵袭性，并通过细胞数量和移动的距离，或用125I预标记细胞并计数滤膜远侧或培养皿底部的放射性作组织学分级。参见，例如Freshney (1984)，同上。体内肿瘤生长可在转基因或免疫抑制小鼠中测试N-钙黏着蛋白调节剂对细胞生长的作用。可产生内源性N-钙黏着蛋白基因破坏的敲除转基因小鼠。此类敲除小鼠可用于研究N-钙黏着蛋白的作用，例如作为癌症模型，作为体内检验调节N-钙黏着蛋白的化合物的方法和测试恢复野生型或突变型N-钙黏着蛋白对敲除小鼠的作用。可通过同源重组将标记基因或其它异源基因插入小鼠基因组中的内源性N-钙黏着蛋白基因位点来产生敲除细胞和转基因小鼠。还可用突变型N-钙黏着蛋白取代内源性 N-钙黏着蛋白或突变内源性N-钙黏着蛋白，例如通过接触致癌物来产生此类小鼠。将DNA构建物引入胚胎干细胞的核。将含有新工程改造遗传学损伤的细胞注入宿主小鼠胚胎，将该胚胎再植入接受雌鼠。这些胚胎中的一些发育成具有部分衍生自突变型细胞系的生殖细胞的嵌合型小鼠。因此，通过饲养嵌合型小鼠，可能获得含有引入的遗传学损伤的新小鼠谱系(参见，例如Capecchi等·，Science 244 1288 (1989))。可按照Hogan 等.，《操作小鼠胚胎实验室手册》，冷泉港实验室(1988)，《畸胎瘤和胚胎干细胞实验室手册》，Robertson编·，IRL出版社，华盛顿，哥伦比亚特区·，(1987)获得嵌合型靶向小鼠。 这些敲除小鼠可用作宿主以测试各种N-钙黏着蛋白调节剂对细胞生长的作用。或者，可利用各种免疫抑制或免疫缺陷宿主动物。例如，遗传学无胸腺“裸”小鼠 (参见，例如 Giovanella 等.，J. Natl. Cancer Inst. 52 :921 (1974))、SCID 小鼠、切除胸腺的小鼠或经辐射小鼠(参见，例如Bradley等.，Br. J. Cancer 38 =263(1978) ；Selby等·， Br. J. Cancer 41 52(1980))可用作宿主。注射入等基因宿主的可移植肿瘤细胞(通常约 IO6个细胞)会在高比例的病例中产生侵袭性肿瘤，而类似起源的正常细胞则不会。用N-钙黏着蛋白调节剂治疗宿主，例如通过注射。合适的时间长度，优选4-8周后，检测肿瘤生长 (例如，通过体积或其最大的两维)并与对照比较。统计学显著减小(采用，例如斯氏T检验)的肿瘤称为生长受抑制。采用肿瘤尺寸减小作为试验，可鉴定能，例如抑制异常细胞增殖的N-钙黏着蛋白调节剂。筛选方法本发明还提供鉴定分别抑制N-钙黏着蛋白结合N-钙黏着蛋白受体的化合物的方法，其中所述化合物可用于抑制表达N-钙黏着蛋白的肿瘤生长和促进其消退，所述肿瘤是例如泌尿生殖癌症肿瘤，包括前列腺或膀胱癌症肿瘤。采用本文所述的试验，通过筛选各种化合物和化合物的混合物降低、抑制N-钙黏着蛋白分别结合N-钙黏着蛋白受体的能力，可鉴定适合作进一步检验的前导化合物来鉴定治疗上有效的调节剂。感兴趣的化合物可以是合成或天然产生的。筛选试验可在体外或体内进行。通常在体外进行初始筛选试验，可利用基于细胞的试验或动物模型作体内验证。例如，再生基因家族的蛋白质参与细胞增殖。因此，与未接触测试化合物的细胞相比，抑制N-钙黏着蛋白分别结合N-钙黏着蛋白受体的化合物可抑制该结合相互作用导致的细胞增殖。N-钙黏着蛋白分别与N-钙黏着蛋白受体的结合也参与组织损伤应答、炎症和发育异常。在动物模型中，与未接触测试化合物的动物相比，抑制 N-钙黏着蛋白分别与其受体结合的化合物可，例如抑制伤口愈合或发育异常的发展。参见， 例如 Zhang 等.，World J Gastroenter (2003) 9 :2635_41。抑制N-钙黏着蛋白分别与N-钙黏着蛋白受体结合的化合物通常是合成的。将筛选方法设计成通过自动进行检验步骤并从任何便利来源提供化合物以供试验来筛选大化学文库，通常平行进行(例如，在机器人试验中微量滴定板上的微量滴定形式)。本发明提供高通量形式的抑制N-钙黏着蛋白结合其受体的体外试验。对于所述各试验形式，不含调节剂的“无调节剂”对照反应提供N-钙黏着蛋白与其一种或多种受体结合相互作用的背景水平。在本发明的高通量试验中，一天可能筛选最多数千种不同的调节剂。具体地说，微量滴定板的各孔可用于运行针对所选潜在调节剂的不同试验，或者如果要观察浓度或温育时间效应，可每5-10孔检验一种调节剂。因此，一块标准微量滴定板可检验约100(96)种调节剂。如果利用1536孔板，则一块平板不难检验约100-约1500种不同化合物。每天可能检验多个不同的平板；利用本发明的集成系统可能试验筛选最多约 6，000-20, 000，甚至最多约100，000-1, 000, 000种不同的化合物。标记、加入试剂、液体改变和检测的诸步骤与完全自动化相容，例如利用以下公司的市售可编程机器人系统或“集成系统”例如，德克萨斯州康柔市BTA公司(BioTX Automation, Conroe, TX)；加利福尼亚州巴伦西亚恰根公司(Qiagen, Valencia, CA)；加利福尼亚州富勒敦BC公司(Beckman Coulter, Fullerton, CA)；和马萨诸塞州霍普金顿市标尺生命科学公司(Caliper Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ)。基本上可检验可作为N-钙黏着蛋白结合其受体的潜在抑制剂的任何化合物以便用于本发明方法。最优选的通常是可溶解于水性或有机溶液(尤其是DMSO溶液)中的化合物。应理解有多个化合物供应商，包括密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma， St. Louis,MO)、密苏里州圣路易斯的阿尔德里奇公司(Aldrich)、密苏里州圣路易斯的西格玛-阿尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)、瑞士布希的FCBA公司(Fluka Chemika-Biochemica Analytika, Buchs Switzerland)以及不难用于筛选有机小分子和肽文库的供应商，包括加利福尼亚州圣迭戈的化学桥公司(Chembridge Corp.，San Diego, CA)、加利福尼亚州圣迭戈的开发伴侣国际公司(Discovery Partners International, San Diego, CA)、加利福尼亚州圣迭戈的三联体治疗公司(Triad Therapeutics, San Diego, CA)、加利福尼亚州门洛帕克的纳新公司(Nanosyn，Menlo Park, CA)、加利福尼亚州帕洛阿尔托的埃非麦克斯公司(Affymax，Palo Alto, CA)、加利福尼亚州南旧金山的CG公司(ComGenex，South San Francisco, CA)和密苏里州圣路易斯的曲波利斯公司(Tripos，Inc.，St. Louis, MO)。在一个优选实施方式中，通过筛选含有大量潜在治疗化合物(潜在调节剂化合物)的组合文库来鉴定N-钙黏着蛋白受体结合相互作用的抑制剂。可在本文所述的一个或多个试验中筛选此类“组合化学物质或肽文库”以鉴定显示所需特征活性的那些文库成员(具体的化学物质或亚类)。由此鉴定的化合物可用作常规“先导化合物”，或者本身可用作潜在或实际的治疗剂。组合化学文库是通过化学合成或生物合成，通过组合多种化学“结构模块”如试剂产生的多样性化合物的集合。例如，通过以每种可能的方式组合给定化合物长度(即多肽化合物中的氨基酸数量)的一组化学结构模块(氨基酸)形成线性组合化学文库如多肽文库。可通过这类化学结构模块的组合混合来合成几百万种化合物。组合化学文库的制备和筛选方法是本领域技术人员熟知的。此类组合化学文库包括但不限于肽文库(参见例如，美国专利5，010，175，Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37 487-493(1991)和 Houghton 等，Nature 354 :84-88 (1991)) 也可使用产生化学多样性文库的其它化学物质。此类化学物质包括但不限于类肽(如PCT公开WO 91/19735)、编码肽(PCT公开W093/20242)，随机生物寡聚物(如PCT公开WO 92/00091)，苯并二氮萆 (如美国专利5，沘8，514)，多样异构体如乙内酰脲、苯并二氮萆和二肽(Hobbs等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90 :69096913 (1993)), MM^SX (vinylogous polypeptide) (Hagihara 等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :6568 (1992))，具有β _D_葡萄糖支架的非肽类肽模拟物 (Hirschmann 等，J. Amer. Chem. Soc. 114 :92179218 (1992))，类似有机合成的小化合物文库 (Chen 等，J. Amer. Chem. Soc. 116 J661 (1994))，低聚氨基甲酸酯类(Cho 等，Science 261 1303(1993))和 / 或肽酰膦酸酯类(Campbell 等，J. Org. Chem. 59 :658 (1994))，核酸文库 (参见Ausubel,Berger和Sambrook,同上)，肽核酸文库(参见例如，美国专利5，539，083)， 抗体文库(参见例如，Vaughn 等，Nature Biotechnology, 14(3) :309-314(1996)和 PCT/ US96/10287)，碳水化合物文库(参见例如，Liang 等，Science，274 1520-1522 (1996)和
28美国专利5，593，85 ，有机小分子文库(参见例如，苯并二氮革，Baum C&EN，1月18日，第 33页(1993)；类异戊烯，美国专利5，569，588 ；噻唑烷酮和偏噻嗪烷酮(metathiazanone), 美国专利5，549, 974 ；吡咯烷，美国专利5，525，735和5，519，134 ；吗啉代化合物，美国专利 5，506，337 ；苯并二氮罩，5，288，514 等)。制备组合文库的装置市售可得(参见，例如357MPS，390MPS，先进化学技术公司 (Advanced Chem. iTech)，路易斯维尔，肯塔基州，Symphony, Rainin，沃本，马萨诸塞州，433A 应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特城，加利福尼亚州，9050 Plus，米利波尔公司(Millipore)，贝德福德，马萨诸塞州)。siRNA 技术本领域普通技术人员熟知siRNA分子和载体的设计和制备。例如，设计合适的 siRNA的有效方法是从mRNA转录物的AUG起始密码子开始(例如，参见图7、8、9)并扫描 AA 二核苷酸序列(参见 Elbashir 等· EMBO J 20 =6877-6888 (2001)) 各 AA 和 3，毗连核苷酸是潜在的siRNA靶标点。毗连位点序列的长度将决定siRNA的长度。例如，19个毗连位点会得到21核苷酸长的siRNA。具有3’突出UU 二核苷酸的siRNA常最有效。该方法还与利用RNA pol III转录发夹siRNA相容。RNA pol II在4_6个核苷酸多聚(T)道处终止转录，从而产生具有短多聚(U)尾的RNA分子。然而，具有其它3’末端二核苷酸突出的 siRNA也能有效诱导RNAi，可凭经验选择序列。对于选择性，可通过进行BLAST检索(参见 www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST)以避免与其它编码序列具有超过16-17个毗连碱基对同源的靶序列。诱导RNAi的siRNA表达载体可具有不同设计标准。载体可插入短间隔序列分隔开并以用于终止转录的T串结束的两个反向重复。表达的RNA转录物预计能折叠成短发夹 siRNA。siRNA靶序列的选择、编码推定发夹的茎干的反向重复的长度、反向重复的顺序、编码发夹的环的间隔序列的长度和组成、5’ -突出的存在与否可有所不同。siRNA表达盒的优选顺序是正义链、短间隔序列和反义链。具有各种茎干长度(例如，15-30)的发夹siRNA 均可能是合适的。连接发夹siRNA的正义和反义链的环可具有不同长度(例如，3-9个核苷酸或更长)。载体可包含操作性连接于编码siRNA的核苷酸序列的启动子和表达增强子或其它调控元件。可将这些控制元件设计成允许临床医师通过加入或控制调控元件对其起反应的外部因素而关闭或开启基因的表达。在一些实施方式中，本发明提供抑制表达N-钙黏着蛋白的癌症细胞生长的方法， 所述方法通过使癌症细胞与抑制癌症细胞生长有效量的识别并结合该蛋白的抗体或其片段接触。在一些实施方式中，所述癌症细胞是前列腺癌细胞或膀胱癌细胞。接触的抗体可以是单克隆抗体和/或嵌合型抗体。在一些实施方式中，嵌合型抗体包含人免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，抗体是人抗体或包含人免疫球蛋白恒定区。在其它实施方式中， 抗体片段包含？油、？(油)2或？1在其它实施方式中，片段包含具有抗原结合区的重组蛋白。在另外的其它实施方式中，抗体或片段是包含连接于治疗剂的抗体或片段的免疫偶联物。治疗剂可以是细胞毒性剂。细胞毒性剂可选自下组蓖麻毒蛋白、蓖麻毒蛋白A-链、阿霉素、柔红霉素、紫杉醇、溴化乙锭、丝裂霉素、依托泊甙、替诺泊甙、长春新碱、长春碱、秋水仙素、二羟炭疽菌素二酮、放线菌素D、白喉毒素、假单胞菌外毒素(PE)A、PE40、相思豆毒蛋白、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α -帚曲菌素、白树毒素、迈托毒素、局限曲霉素、酚霉素、依诺霉素、麻疯树逆境蛋白、巴豆毒蛋白、刺孢霉素、肥皂草抑制剂、类美坦西醇和糖皮质激素、蓖麻毒蛋白。治疗剂可以是放射性同位素。治疗性同位素可选自下组21%i、 131L111^KwY和186Re。在任何上述实施方式中，还可给予化疗药物和/或放疗。在一些实施方式中，患者还接受激素拮抗剂治疗。可将抗体静脉内、腹膜内、肌肉内、肿瘤内或真皮内给予患者而使患者与抗体或抗体片段接触。在一些实施方式中，患者患有泌尿生殖癌症(例如，膀胱癌、前列腺癌)。在上述一些实施方式中，患者患有前列腺癌，还任选接受患者激素消融治疗。在一些实施方式中，所述接触包括将抗体直接给予到癌症或癌症的转移灶中。在一些实施方式中，免疫偶联物具有作为小分子的细胞毒性剂。毒素，例如美登素、类美坦西醇、皂草毒蛋白、白树毒素、蓖麻毒蛋白或刺孢霉素和它们的类似物或衍生物也是合适的。可偶联于抗-N-钙黏着蛋白抗体的其它细胞毒性剂包括BCNU、链脲霉素、长春新碱和5-氟尿嘧啶。还可利用酶促活性毒素及其片段。可采用已知方式(例如，双功能接头、融合蛋白)将放射性或其它标记物掺入偶联物。本发明抗体还可偶联于将前药转化成活性化疗剂的酶。参见，WO 88/07378 ；美国专利号4，975，278。抗体或免疫偶联物可任选连接于非蛋白聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物)。给予的组合物通常包含溶解于药学上可接受的载体，优选水性载体的本文所述试剂。可利用各种水性载体，例如缓冲盐溶液等。这些溶液是无菌的，通常不含有害物质。这些组合物可经常规的众所周知的灭菌技术灭菌。该组合物可含有近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如PH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可广泛变化，主要根据液体体积、粘度、体重等因素，按照所选的特定给药方式和患者需要作选择。因此，静脉内给予的典型药物组合物每天可为每位患者提供约0. 1到lOOmg。可采用每天每位患者从0.1到最高约IOOmg的剂量。局部给药中显著较高的剂量是可能的。制备可胃肠外给予的组合物的实际方法是本领域技术人员已知或显而易见的，这些方法在例如《雷明顿药物科学》，第15版.，马克出版公司，伊斯顿，宾夕法尼亚州.(1980)等出版物中有更详细的描述。根据给药方法，可给予各种单位剂型的药物组合物。例如，适合口服给予的单位剂型包括但不限于粉末、片剂、丸剂、胶囊和锭剂。口服给予时，公认应保护抗体免遭消化。 这通常可通过以下方式实现用赋予分子耐受酸性和酶促水解的组合物将分子配制成复合物，或将分子包装入适当耐受的载体，例如脂质体或保护屏障。本领域熟知保护试剂免遭消化的方法。具体地说，可将具有所需纯度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合来制备本发明所用的抗体和免疫偶联物及抑制剂的药物制剂。此类制剂可以是冻干制剂或水性溶液。所用剂量和浓度的可接受载体、赋形剂或稳定剂对于接受者无毒。可接受的载体、赋形剂或稳定剂可以是乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂(例如，抗坏血酸)、防腐剂、低分子量多肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶，或亲水性聚合物， 如聚乙烯基吡咯烷酮(polyvinylpyllolidone)；和氨基酸、单糖、二糖和其它碳水化合物， 包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂；离子和非离子表面活性剂(例如，聚山梨酯)；成盐反离子，如钠；金属复合物(例如，Zn-蛋白复合物)；和/或非离子型表面活性剂。可将抗体配制成 0. 5-200mg/ml 或 10_50mg/ml 的浓度。制剂还可提供其它活性化合物，包括化疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂和抗-激素剂。还可将活性成分制备成缓释制品(例如，固体疏水性聚合物(例如，聚酯，水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯的半透基质)。还可将抗体和免疫偶联物包埋在通过(例如)凝聚技术或界面聚合制备的微胶囊中，例子分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚_(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别包埋入胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或包埋入大乳液中。可为治疗性或预防性治疗给予含本发明抑制剂和试剂(例如抗体)的组合物。在治疗性应用中，将“治疗有效剂量”的组合物给予患有疾病(例如，癌症)的患者。该应用的有效量取决于疾病的严重程度和患者的总体健康状况。可根据所需以及患者耐受的剂量和频率单次或多次给予组合物。为本发明的目的，“患者”或“对象”包括人和其它动物，特别是哺乳动物。因此，这些方法适用于人治疗和兽医应用。在优选的实施方式中，所述患者是哺乳动物，优选灵长类，在最优选的实施方式中，所述患者是人。其它已知的癌症治疗可与本发明方法联用。例如，Wnt信号转导的抑制剂还可用于使细胞对其它癌症治疗剂，如5FU、 长春碱、放线菌素D、顺钼、氨甲喋呤等靶向或致敏。在其它实施方式中，本发明方法可与放疗等联用。
实施例提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。实施例1.图1的数据显示虽然N-钙黏着蛋白仅在不依赖雄激素的小亚组细胞中表达，但用抗体治疗足以延迟不依赖雄激素的肿瘤的生长和发展(粉色和黄色曲线)。这些数据表明不依赖雄激素的肿瘤形成需要N-钙黏着蛋白细胞群，阻断其足以延迟肿瘤发展。这些数据与N-钙黏着蛋白是不依赖雄激素的干细胞群的标志的解释一致。阻断干细胞生长足以阻断肿瘤生长。这些数据还显示，抗体可作用于表达正常或甚至低水平N-钙黏着蛋白的细胞。如图2所示，将细胞注射入去势小鼠，与阴性群体相比，N-钙黏着蛋白阳性细胞快速而有效地形成肿瘤，表明N-钙黏着蛋白阳性细胞既具有生长优势，又具有干细胞特征， 其致瘤性强于阴性群体。未分选细胞生长类似于N-钙黏着蛋白阳性细胞。如图3和4所示，100 % N-cad (N-钙黏着蛋白)阳性细胞的肿瘤仅有41. 25 % N-钙黏着蛋白阳性，表明这些细胞产生N-钙黏着细胞无效细胞。这与N-钙黏着蛋白阳性细胞是可产生分化程度更高的N-钙黏着蛋白阴性细胞的干细胞的假设一致。同时，N-钙黏着蛋白阴性群体产生有9% N-钙黏着蛋白阳性的肿瘤，类似于未分选的细胞。这表明这些细胞的生长要求干(细胞)样群体获得或上调N-钙黏着蛋白以便形成不依赖雄激素的肿瘤。 产生不依赖雄激素的肿瘤需要N-钙黏着蛋白导致致瘤性的延迟。应理解，本文所述的实施例和实施方式只是为达到说明的目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，它们包括在本申请的构思和范围以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利、专利申请出于所有目的通过引用全文纳入本文。
权利要求
1.一种治疗癌症患者的方法，包括以下步骤(a)从具有患表达N-钙黏着蛋白的癌症风险的个体获得测试组织样品；(b)测定所述测试组织样品中所述N-钙黏着蛋白的存在与否或含量，与已知所述癌症阴性个体的对照组织样品作比较；藉此诊断表达N-钙黏着蛋白的所述癌症，其中所述N-钙黏着蛋白以正常或低水平表达，或者由所述细胞的亚组表达，其中所述N-钙黏着蛋白未过表达；和(c)将有效量的N-钙黏着蛋白抗体或其片段给予具有表达N-钙黏着蛋白的癌症风险的个体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症是前列腺癌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症是膀胱癌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症是激素难治性前列腺癌。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症是转移性癌症。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段是scFV。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述片段是二抗体。
10.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗体阻断激素难治性前列腺癌。
11.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述抗体阻断癌症干细胞。
12.一种鉴定癌症干细胞的方法，包括以下步骤(a)从具有表达N-钙黏着蛋白的癌症风险的个体获得测试组织样品；(b)测定所述测试组织样品中癌症干细胞存在与否，与已知所述癌症阴性的个体的对照组织样品作比较；其中所述N-钙黏着蛋白以正常或低水平表达，或者由所述干细胞的亚组表达和未过表达。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述组织样品是前列腺或膀胱组织。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述癌症是前列腺癌。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述癌症是膀胱癌。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述癌症是激素难治性前列腺癌。
17.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述癌症是转移性癌症。
全文摘要
本发明提供诊断方法，提供治疗表达N-钙黏着蛋白的癌症的诊断和治疗靶标，所述癌症包括前列腺和膀胱癌。
文档编号A61K39/395GK102271709SQ200980154481
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月10日
发明者R·E·赖特尔 申请人:加利福尼亚大学董事会