用于预防或治疗神经疾病的包括间充质干细胞或间充质干细胞培养液的组合物的制作方法

专利名称：用于预防或治疗神经疾病的包括间充质干细胞或间充质干细胞培养液的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于预防或治疗与神经突损伤有关的阿尔茨海默氏病 (Alzheimer' s disease)的组合物，其包含间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、 MSC培养液、MSC培养液中所含蛋白质或诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子。本发明涉及一种用于预防或治疗与神经突损伤有关的疾病的组合物，其包含间充质干细胞(MSC)、MSC培养液、MSC培养液中所含蛋白质或诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子。
背景技术：
阿尔茨海默氏病为由淀粉样β蛋白破坏性积累引起的破坏脑细胞的脑部病症， 并且一般会随年龄增长发作，是一种导致语言障碍和认知功能损害的严重疾病。阿尔茨海默氏病的发展分几个阶段，并逐渐破坏记忆、推理、判断、语言，甚至是进行简单工作的能力。最终，情绪控制的丧失可引起人生活品质的下降。目前，阿尔茨海默氏病还不能得到完全治愈，但可在临床上应用药物来减轻症状。然而，这些药物对患者的作用很有限。约半数的阿尔茨海默氏病患者无法由初始的药物治疗治愈。即使初始的药物治疗很成功，也只能略微地缓解症状。因此，需要开发一种满足医疗需求的新颖治疗方法，并且有关阿尔茨海默氏病治疗方法的开发将具有巨大的经济和社会效应。已知随着阿尔茨海默氏病的发展，大脑皮层和海马体将受到破坏，而且不能恢复，因此，还没有针对这种疾病的治疗方法。有关阿尔茨海默氏病的研究曾集中在两种蛋白质tau和淀粉样前体蛋白 (amyloid precursor protein, APP)(斯图尔特(Stuart Μ.)和马克(Mark P. Μ),自然-医学(Nature Medicine)，12 (4)，392-393，2006)。受影响个体的脑部积累了这两种蛋白质的异常形式。Tau发生过磷酸化，而APP被分泌酶裂解产生淀粉样β (amyloid-beta,A^)蛋白，这种蛋白质以斑块形式聚集于脑中。一般说来，在斑块积累的脑部区域中，突触的数量减少并且神经突被破坏。这表明，淀粉样β蛋白会破坏突触和神经突(马克(Mark P. Μ), 自然(Nature)，430，631-639，2004)。为了治疗阿尔茨海默氏病，人们已经积极进行有关发病机制的研究。具体点说，人们已经深入研究了产生淀粉样β蛋白的分泌酶和/或Y-分泌酶的抑制剂、降解积累的淀粉样β蛋白的蛋白酶以及降解乙酰胆碱的乙酰胆碱酯酶抑制剂。此外，由于阿尔茨海默氏病是一种衰老相关性慢性炎症性疾病，所以还进行了有关使用炎症抑制剂治疗阿尔茨海默氏病的研究。脑中淀粉样β蛋白的量是通过淀粉样β蛋白产生与去除反应之间的平衡测定。因此，如果淀粉样β蛋白的去除量减少，那么淀粉样β蛋白的量将增加。脑啡肽酶 (neprilySin，NEP;—种具有降解淀粉样β蛋白的活性的酶)的缺乏会加速淀粉样蛋白的细胞外积累(卡纳利嘉马-安度(Kanaeli jima-Ando)等，生物化学杂志(J. Biol. Chem.)， 283 (27)，19066-19076，2008)。
从神经元细胞体突出的异常神经突与神经疾病有关。神经疾病的实例为阿尔茨海默氏病、帕金森氏病(Parkinson' s disease)、抑郁症、癫痫、多发性硬化和躁狂症。具体说来，癫痫是由人海马体神经元死亡和神经胶质增生所致。神经元死亡导致神经突裂解。 多发性硬化是在脑部发生的由Nogo A(神经突生长抑制蛋白)异常引起的慢性自身免疫疾病。抑郁症是由M6a(神经突生长相关蛋白)异常引起的脑部病症。据报导，在小鼠中，通过活化刺激神经突生长的信号转导途径，将减轻躁狂症的症状。间充质干细胞(MSC)是多能性干细胞，其分化成中胚层系细胞，例如骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞；或外胚层系细胞，例如神经元。近来已报导，MSC有可能在脑中分化成神经胶质，因此人们曾尝试使MSC分化成神经元(韩国专利公开案第10-2004-0016785 号，2004年2月25日)。在MSC中，骨髓源性MSC可从患者获得。如果MSC是自体移植的，就不会发生免疫排斥反应，并因此能在临床上用于患者。然而，由于骨髓源性MSC的收集需要各种复杂的医疗处理阶段，使得骨髓捐献成为一项耗时，使人在心理上和生理上感到痛苦，并且昂贵的工作。但由于脐血源性MSC可以很简单地从脐带获得，脐血保存业正在积极发展，并且供体因脐血基础建设而易于发现，使得易于获得MSC。此外，从异基因脐血(allogeneic cordblood)获得的MSC在移植后不会出现免疫反应，由此呈现出免疫稳定性。所有引用的参考文献都以全文引用的方式并入本文中。

发明内容
技术问题为了能使用干细胞治疗神经疾病，根据常规方法，首先需要使干细胞分化成神经元，或者需要将干细胞与使干细胞分化成神经元的材料一起投予。本发明一个或一个以上实施例包含一种针对神经疾病的细胞治疗方法，其不需要使干细胞分化成神经元。本发明一个或一个以上实施例包含一种预防和治疗神经疾病的组合物，其包含 MSC。本发明一个或一个以上实施例包含一种防止由淀粉样β蛋白引起的神经细胞毒性、防止神经元中tau蛋白磷酸化、防止神经突损伤和诱导神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶表达的方法。本发明一个或一个以上实施例包含一种防止由淀粉样β蛋白引起的神经细胞毒性、防止神经元中tau蛋白磷酸化、防止神经突损伤和诱导神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶表达的试剂盒。技术解决方案本发明的发明人发现，当将用或不用淀粉样β蛋白处理的神经元或小胶质细胞与MSC、MSC培养液或MSC培养液中所含蛋白质共培养时，可防止由淀粉样β蛋白引起的神经细胞毒性、神经元中tau蛋白磷酸化和神经突损伤，并诱导神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶的表达。有益效果当将神经元或小胶质细胞与MSC、MCS培养液、MSC培养液中所含蛋白质和/或诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子共培养时，可以防止由淀粉样β蛋白引起的神经细胞毒性，防止神经元中tau蛋白磷酸化，诱导神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶表达， 并防止神经突损伤。根据本发明，包含MSC、MSC培养液、MSC培养液中所含蛋白质或诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子的组合物可用作有效预防和治疗神经疾病的细胞治疗组合物。此外，还提供一种使用MSC、MSC培养液、MSC培养液中所含蛋白质和/或诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子，来防止由淀粉样β蛋白引起的神经细胞毒性，防止神经元中tau蛋白磷酸化，防止神经突损伤，并诱导神经元中脑啡肽酶表达的方法和试剂
品.ο


通过参照附图详细描述本发明示范性实施例，将更好地理解本发明的上述和其它特征及优势。图1说明未经处理和经淀粉样β蛋白处理M小时的活神经元的光学显微镜图像。图2显示用于共培养经淀粉样β蛋白处理的神经元与人脐血(UCB)源性MSC的共培养系统。图3说明荧光染色的结果，其解释了神经元与人UCB源性MSC共培养对淀粉样β 蛋白(Αβ42)所引起的神经元死亡的影响。图4是说明死亡神经元的百分比的图，其解释了神经元与人UCB源性MSC共培养对Αβ 42所引起的神经元死亡的影响。图5说明荧光染色的结果，其解释了神经元与人骨髓源性MSC共培养对Αβ 42所引起的神经元死亡的影响。图6说明使用抗磷酸化tau抗体荧光染色的神经元。图7说明经A β 42处理、与MSC共培养并使用免疫荧光染色进行染色的神经元。图8说明在经A β 42处理并与骨髓源性MSC或UCB源性MSC共培养的神经元中脑啡肽酶的表达。图9说明当经A β 42处理的神经元和小胶质细胞与MSC共培养时神经元和小胶质细胞中脑啡肽酶的表达。图10是说明经Αβ 42处理并与MSC分泌的蛋白质共培养的死亡神经元的百分比的图。图11是说明与Αβ 42和MSC分泌的蛋白质一起培养的神经元中神经突长度的图。图12显示在小胶质细胞与UCB-MSC共培养后使用从UCB-MSC分离的总RNA作为模板得到的RT-PCR的结果。图13显示蛋白免疫印迹(western blotting)的结果，其表明当在IL-4存在下培养神经元和小胶质细胞时NEP的表达增加。图14显示使用Thio-S染色所染色的脑部组织(包含海马体和大脑皮层)中A β 蛋白斑块的图像。图15是说明图14的图像中Αβ斑块的总面积的图。
图16显示免疫印迹(immunoblotting)的结果，其表明在实验用小鼠的脑中产生的Αβ蛋白的变化。图17显示正常小鼠和经转化而患有阿尔茨海默氏病的小鼠的脑部组织(包含海马体和大脑皮层)中NEP的表达程度。图18是说明使用Quantity One软件(伯乐公司(Bio-RAD))测量的图17中NEP 的谱带强度的图。图19显示在投予MSC和IL-4的小鼠脑部组织(包含海马体和大脑皮层)中NEP 的表达程度。图20显示在投予UCB源性MSC和IL_4的小鼠小胶质细胞中NEP的表达。
具体实施例方式根据本发明的实施例，当将神经元与间充质干细胞(MSC)共培养时，可以防止或修复由淀粉样β蛋白引起的神经元损伤，而在共培养过程中，MSC没有分化成神经元，同时神经元与MSC之间不发生直接接触。此外，本发明的发明人发现，当与MSC培养液或所述培养液中所含特定蛋白质共培养时，也可以防止或修复由淀粉样β蛋白引起的神经元损伤。当将用10微摩尔浓度(μ Μ)淀粉样β蛋白42 (Α β 42)处理M小时的神经元(图 1和3中所示的Ct+Αβ )与未处理的神经元(图3中所示的Ct)相比较时，用Αβ 42处理过的大部分神经元死亡。然而，如果将受损的神经细胞与脐血(UCB)源性MSC共培养，神经元死亡就得到防止，并且细胞成熟增多(图3和图4的Ct+Αβ +MSC)。在骨髓源性MSC中也可观察到UCB源性MSC防止淀粉样β蛋白引起的神经元死亡的作用(图5的皮层/Αβ/ BM-MSC)。当在相同培养基中，于Αβ 42存在下共培养大脑皮层源性神经元与MSC达M小时时，获得与图3中Ct+A β+MSC所示相同的结果。这表明，如果将神经元与MSC共培养，就可修复A β 42损伤的神经元，并可防止A β 42引起的神经元损伤。此外，将tau蛋白与人UCB源性MSC共培养，可防止tau蛋白磷酸化，否则tau蛋白会在A β 42作用下迅速磷酸化(图6)。使用针对微管蛋白β III (Tubulin β III)和MAP2 (即，神经元标记物)的抗体观察神经元，发现在用Αβ 42处理的神经元中，由于毒性，致使神经突出现损伤和裂解，并且神经元的形状被减缩。然而，当将神经元与UCB源性MSC共培养时，神经突保持在神经元中， 并且神经元分化和成熟加快(图7)。通过观察脑啡肽酶(ΝΕΡ，一种降解和去除Αβ42的蛋白质)的表达，发现在用 A β 42处理的神经元中，NEP的表达减少。但将神经元与UCB源性MSC共培养时，在蛋白质水平和mRNA水平上，NEP的表达增加(图8的A)。图8的B说明使用抗NEP抗体染色的神经元。如果用Aβ 42处理神经元，那么染成红色的部分明显减少，由此表明神经元中NEP 的表达减少。然而，如果神经元与MSC共培养，那么NEP的表达增加。在使用骨髓源性MSC 和UCB源性MSC进行的实验中，也观察到这些结果(图8的C)。因此，当经或未经A β 42处理的神经细胞与MSC共培养时，在mRNA和蛋白质水平上，神经细胞中NEP的表达水平增加。 MSC 包含 UCB-MSC 禾口 BM-MSC0此外，还鉴别出，UCB源性MSC不仅诱导神经元(神经元)中而且还诱导小胶质细胞中NEP的表达，所述小胶质细胞被称为脑巨噬细胞，并去除脑中积累的有毒物质，例如阿尔茨海默氏病的A β (图9)。由于通过共培养MSC与神经元获得了上述作用，同时MSC与神经元之间不发生直接接触，故认为由MSC分泌的物质引起这些作用。对单独培养MSC时不表达或极少表达但将神经元与MSC共培养时在MSC中表达增加的蛋白质进行分析。结果鉴别出总共14种蛋白质与Αβ 42所引起的毒性的防止以及神经元分化和成熟有关。这14种蛋白质为活化素(activinA)、血小板因子 4(platelet factor 4，PF4)、修饰素(decorin)、半乳糖凝集素 3(galectin 3)、生长分化因子 15 (growth differentiation factor 15，GDF15)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3(glypican 3)、膜型卷曲相关蛋白(membrane-type frizzled-related protei，MFRP)、胞间粘附分子 5 (intercellular adhesion molecule 5，ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白 7 (insulin-like growth factor binding protein 7，IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA (platelet-derived growth factor-AA，PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidic and rich incysteine, SPARCL1)、血小板反应素-1 (thrombospondin-l)、wnt_l 诱导分泌蛋白 1 (wnt-linduced secreted protein 1, WISP1)和颗粒蛋白前体(progranulin)。与只用Aβ 42处理的神经元相比较，当用Aβ 42 和代替MSC的所述每一蛋白质处理神经元时，神经元死亡明显减少，并且神经突长度显著增加(图10和11)。从这一点看，将更详细地描述上述14种蛋白质。活化素Α，称为抑制素0A(inhibin@A，ΙΝΗΒΑ)，是一种同型二聚体蛋白质。已知INHBA是由人体内的INHBA基因编码。INHBA的氨基酸序列的NCBI登录号可为 NP_002183(SEQ ID NO :1)。血小板因子4(PF4)，称为趋化因子(C-X-C基序)配体4(chemokine ligand4, CXCL4)，是一种属于CXC趋化因子家族的小细胞因子。人PF4的基因位于人染色体4上。 PF4的氨基酸序列的NCBI登录号可为NP_002610(SEQID NO 2)。修饰素是平均分子量为约90到约140千道尔顿(kDa)的蛋白聚糖。修饰素属于富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan，SLRP)家族，并且包含具有亮氨酸重复的核心蛋白(protein core)和糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)，所述糖胺聚糖由硫酸软骨素(chondroitinsulfate，CQ或硫酸皮肤素(dermatan sulfate,DS) 组成。修饰素的氨基酸序列的NCBI登录号可为:NP_001911(SEQ ID NO :3)。半乳糖凝集素3，称为可溶性半乳糖苷结合凝集素3(leCtin， galactoside-binding, soluble 3，LGAL3)，是结合于β-半乳糖苷的凝集素。举例来说，半乳糖凝集素3的氨基酸序列的NCBI登录号可为NP_919308(SEQID NO 4)。生长分化因子15(GDF15)，称为巨噬细胞抑制因子1 (macrophageinhibitory cytokine 1，MIC1)，是一种属于转化生长因子 β 超家族(transforminggrowth factor beta superfamily)的蛋白质，可控制创伤的发炎途径和疾病过程中的细胞死亡途径。举例来说，⑶F15的氨基酸序列的NCBI登录号可为NP_004855 (SEQ ID NO 5)。磷脂酰基醇蛋白聚糖3，称为GPC3，是一种属于磷脂酰基醇蛋白聚糖家族的蛋白质。举例来说，磷脂酰基醇蛋白聚糖3的氨基酸序列的NCBI登录号可为NP_004475(SEQ ID NO 6) 0磷脂酰基醇蛋白聚糖属于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖O^paran sulfate proteoglycan)家族，并通过与糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI) 形成共价键附着到细胞表面。
举例来说，膜型卷曲相关蛋白(MFRP)的氨基酸序列的NCBI登录号可为 NP_113621 (SEQ ID NO 7)。胞间粘附分子5 (ICAM5)，称为端脑素(telenc印halin)，属于ICAM家族。 ICAM 是 I 型跨膜糖蛋白(type I transmembrane glycoprotein)，含有 2 到 9 个免疫球蛋白假性C2型结构域，并结合于白细胞粘附淋巴细胞功能相关抗原1 (lymphocyte function-associated antigen 1，LFA_1)蛋白。举例来说，ICAM5 的氨基酸序列的 NCBI 登录号可为NP_003250 (SEQ ID NO 8)。胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)属于特异性结合胰岛素样生长因子 (insulin-like growth factor, IGF)的 IGFBP 家族。IGFBP7 也称为 IGF 结合蛋白相关蛋白 1 (IGF-binding protein-related protein 1，IGFBP-rpl)。举例来说，IGFBP7 的氨基酸序列的 NCBI 登录号可为NP_001M4(SEQ ID NO 9)。血小板源性生长因子AA(PDGF-AA)属于PDGF。PDGF-AA是一种同型二聚体糖蛋白，其包含PDGF α多肽，称为两个PDGFA。PDGF是控制细胞生长和分化的蛋白质。PDGF也与血管新生有关。举例来说，PDGFA的氨基酸序列的NCBI登录号可为ΧΡ_001126441 (SEQ ID NO 10)。举例来说，富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白样1 (SPARCL1)的氨基酸序列的NCBI登录号可为NP_004675 (SEQ ID NO :11)。血小板反应素1 (TSPl)是经由二硫键结合的同型三聚体蛋白质。血小板反应素1 是介导细胞与细胞以及细胞与基质的相互作用的粘着糖蛋白。血小板反应素1可结合于纤维蛋白原(fibrinogen)、纤连蛋白(fibronectin)、层粘连蛋白(Iaminin)和胶原蛋白 V型(type V collagen)。举例来说，血小板反应素1的氨基酸序列的NCBI登录号可为 NP_003237(SEQ ID NO :12)。WNTl 可诱导信号传导途径蛋白 1(WNT1 inducible signalling pathwayprotein 1，WISP1)，称为CCN4，属于WISP蛋白亚家族和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)家族。WNTl是介导多种发育过程的富含半胱氨酸的糖基化信号传导蛋白。CTGF家族成员的特征在于具有四个保守的富含半胱氨酸的结构域IGF结合结构域、C型vWF模块(vWF typeC module)、血小板反应素结构域和C末端胱氨酸结样结构域 (C-terminalcystine knot-like domain)。举例来说，WISPl 的氨基酸序列的 NCBI 登录号可为NP_003873 (SEQ ID NO :13)。颗粒蛋白前体(PGN)是颗粒体蛋白(granulin)的前体。颗粒蛋白前体是具有高度保守的12个半胱氨酸的颗粒体蛋白/上皮素(epithelin)基序的7. 5个重复的单一前体蛋白，并且颗粒体蛋白(GRN)是由颗粒蛋白前体裂解得到，且属于分泌型糖基化肽家族。 颗粒蛋白前体也称为上皮素前体(pro印ithelin)和PC细胞源性生长因子。举例来说，颗粒蛋白前体的氨基酸序列的NCBI登录号可为NP_00101M97(SEQ ID NO :14)。如果在白细胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)存在下培养小胶质细胞和神经元， 就会鉴别出，小胶质细胞和神经元中脑啡肽酶(NEP)的表达增加。此外，如果将UCB源性 MSC(UCB-MSC)或IL-4投予患有阿尔茨海默氏病的小鼠，也会鉴别出淀粉样斑块减少。如果将UCB-MSC或IL-4投予患有阿尔茨海默氏病的小鼠，也会鉴别出，脑部组织(包含海马体和/或大脑皮层)中NEP的表达增加。如果将UCB-MSC或IL-4投予患有阿尔茨海默氏病的小鼠，也会鉴别出，脑部组织中的小胶质细胞中NEP的表达增加。白细胞介素-4(IL_4)是诱导天然辅助性T细胞(ThO细胞)分化成Th2细胞的细胞因子。IL-4活化Th2细胞进一步产生IL-4。IL-4的氨基酸序列的NCBI登录号可为 NP_000580(SEQ ID NO :30)或 NP_067258。这14种蛋白质不仅可包含人源性蛋白质，而且还包含哺乳动物源性蛋白质。举例来说，所述哺乳动物包含啮齿动物，且所述啮齿动物可包含例如小鼠或大鼠。即使近期有关组织再生医学的研究已经提出了使用干细胞治疗例如阿尔茨海默氏病等神经退化性病症的可能性，但目前可用的干细胞技术还未开发到足以应用于脑中的大范围记忆丧失，例如阿尔茨海默氏病。然而，本发明的发明人发现，MSC可降低由淀粉样 β蛋白引起的神经细胞毒性，并加速脑中神经干细胞的分化和增殖。由此提出了开发用于治疗阿尔茨海默氏病和其它神经疾病的细胞制剂的可能性。此外，还发现，数种由MSC分泌的蛋白质对例如阿尔茨海默氏病等神经疾病具有治疗作用，并因此增加了预防和治疗神经疾病的潜力。本发明提供一种用于预防或治疗神经疾病的药物组合物，其包含间充质干细胞 (MSC)、MSC培养液、MSC培养液中所含蛋白质和/或诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子。神经疾病可以是由神经突损伤引起的疾病。神经疾病可为阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化、躁狂症或其任何组合。展现轻度认知障碍的前痴呆综合症(pre-dementia syndrome)可以使用神经心理测试(neuropsychological test)诊断。据报导，每年有约12%的轻度认知障碍患者进展到阿尔茨海默氏病。意外的是，如果不进行任何治疗，6年后约80%的轻度认知障碍患者进展到阿尔茨海默氏病。因此，当对轻度认知障碍患者投予本发明药物组合物时，可能预防或延迟进展到阿尔茨海默氏病。本发明还提供使用MSC、MSC培养液、MSC培养液中所含蛋白质或在体外或体内诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子，来防止神经元中由淀粉样β蛋白处理引起的神经细胞毒性、防止神经元中tau蛋白磷酸化、防止神经突损伤和诱导神经元中脑啡肽酶表达的方法和试剂盒。试剂盒可进一步包含培养神经元所需的成分。本发明的包含MSC、MSC培养液、MSC培养液中所含蛋白质或诱导所述蛋白质表达的信号转导系统刺激因子的药物组合物可与具有预防或治疗阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化、躁狂症等的作用的其它有效成分一起投予。药物组合物除有效成分外，还可进一步包含药学上可接受的添加剂，并且可调配成适于使用药学领域的任何已知方法投予患者的单位剂量调配物。出于这一目的，可以使用供不经肠投予的调配物，例如注射调配物或局部投药调配物。举例来说，可以使用供不经肠投予的调配物，例如注射用无菌溶液或悬浮液调配物，必要时其中使用水或其它药学上可接受的溶剂。举例来说，可以使用药学上可接受的载剂或介质，例如无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、赋形剂、媒剂、防腐剂和粘合剂，制备单位剂量调配物。药物调配物可以使用此项技术中的任何已知方法不经肠投予。不经肠投药可包含局部投药和全身投药。局部投药可通过将药物调配物直接投入损伤区域或损伤区域的周围区域，例如脑或脊髓、其周围区域或其相对的区域中来进行。全身投药可通过将药物调
11配物投入脊髓液、静脉或动脉中来进行。脊髓液包含脑脊髓液。动脉可为将血液供应到损伤区域的区域。此外，投药也可根据(道格拉斯-康兹奥卡(Douglas Kondziolka)，匹兹堡(Pittsburgh)，神经学(Neurology)，第55卷，第565-569页，2000)中揭示的方法进行。 具体点说，在个体的颅骨切开一个直径为1厘米的小孔，并使用长针注射器(long-needle syringe)和用于将悬浮液注射到正确位置的立体定向框架(stereotactic frame) JfMSC 于汉克平衡盐溶液(Hank' s balanced salt solution,HBSS)中的悬浮液注射到小孔中。MSC的剂量范围可为每天IXlO4到IX IO7个细胞/公斤(体重)，例如为每天 5X105到5X106个细胞/公斤(体重)，其可按单次剂量或分次剂量投予。然而，应了解， 实际投予患者的MSC (例如UCB源性MSC)的量应根据各种相关因素确定，包含疾病类型、疾病严重程度、所选投药途径以及个别患者的体重、年龄和性别。本发明还提供一种预防或治疗个体的神经疾病的方法，所述方法包含对所述个体投予一种药物组合物，所述药物组合物包括选自由间充质干细胞(MSC)和MSC培养液组成的群组的至少一个。所述方法中使用的投药可以是局部投药或全身投药。投予的药物组合物可为有效预防或治疗疾病的量。所属领域技术人员将易于了解，有效量可根据疾病状况变化。所述方法中使用的药物组合物与上述药物组合物相同。在所述方法中，药物组合物中所含MSC不仅可从自体细胞收集，而且还可以从来自其它和医学实验用动物的异基因细胞收集。也可使用以冷冻形式保存的细胞。这一治疗方法不限于人类。一般说来，MSC也可应用于哺乳动物以及人类。在所述方法中，神经疾病可以是由选自由淀粉样β蛋白、tau蛋白过磷酸化、脑啡肽酶低表达和神经突损伤组成的群组的至少一个引起的疾病。神经疾病可为阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化或躁狂症。本文中使用的淀粉样β蛋白(Αβ)是在阿尔茨海默氏病患者的脑中发现的淀粉样斑块的主要成分。淀粉样β蛋白(Αβ)可以是包含源自于作为跨膜糖蛋白的淀粉样前体蛋白(APP)C末端的氨基酸的肽。Αβ可由APP通过β-分泌酶和Y-分泌酶的连续操作产生。举例来说，A β可包含39到43个氨基酸，例如40到42个氨基酸。A β可包含 NCBI登录号为ΝΡ_000475的氨基酸序列(SEQ ID NO 19)的残基672-713 (Α β 42)或残基 672-711 (Αβ 40)，所述氨基酸序列是人淀粉样βΑ4蛋白同工型前体(APP)。淀粉样β蛋白 (Αβ)可源自于哺乳动物。举例来说，Αβ可源自于人类或小鼠。本说明书中使用的“tau蛋白”是在中枢神经系统神经元中发现的微管相关蛋白 (microtubule-associated protein)。tau蛋白与微管蛋白相互作用，使得微管稳定并促进微管的微管蛋白组装。已知大脑组织包含6种不同的tau同工型。已知tau蛋白过磷酸化与阿尔茨海默氏病爆发有关。tau蛋白是具有高溶解性的微管相关蛋白。对于人类，tau蛋白主要见于神经元中，而不是非神经元细胞中。tau蛋白的一个功能是控制轴突微管的稳定化。举例来说，tau蛋白可以是微管相关蛋白tau同工型2，其氨基酸序列的NCBI登录号为 NP_005901(SEQ ID NO :20)。tau蛋白可源自于哺乳动物。举例来说，tau蛋白可源自于人类或小鼠。脑啡肽酶是锌依赖性金属蛋白酶，可分解大量小分泌肽。如果淀粉样β蛋白发生异常的错误折叠并在神经组织中聚集，那么脑啡肽酶就会分解引起阿尔茨海默氏病的淀粉样β蛋白。举例来说，脑啡肽酶的氨基酸序列的NCBI登录号可为NP_000893 (SEQ ID NO 21)。脑啡肽酶可源自于哺乳动物。举例来说，脑啡肽酶可源自于人类或小鼠。本发明还提供一种减少神经组织中的淀粉样斑块的方法，所述方法包含在选自由间充质干细胞(MSC)和MSC培养液组成的群组的至少一个存在下，培养神经组织。在所述方法中，可在体外或体内培养神经组织，例如神经元。体外培养可在此项技术中已知的用于MSC和/或神经组织(如神经元)的培养基中进行。培养MSC与神经组织 (例如神经元)时，二者之间可直接接触或不直接接触。举例来说，可通过用带孔膜分隔MSC 与神经组织(例如神经元)来进行培养。所述膜的孔径和配置可足够大以使MSC培养基中的生物活性材料通过孔，但细胞不能通过。所述生物活性材料可以是蛋白质、糖和核酸。膜可经安置以使MSC在膜上培养且神经组织(例如神经元)在膜下方培养，由此生物活性材料在重力作用下通过膜到达膜下方。体内培养可进一步包含将选自由MSC和MSC培养液组成的群组的至少一个投入个体体内。投药可为局部投药或全身投药。可投予有效减少斑块量的量。所属领域技术人员将易于了解，有效量可根据疾病状况变化。个体可以是需要减少神经组织中的淀粉样斑块的任何动物。动物可包含哺乳动物。哺乳动物可包含人类、小鼠或大鼠。减少神经组织中淀粉样斑块可以是与在MSC和MSC培养液不存在下培养神经组织 (例如神经元)时淀粉样斑块的量相比较，神经组织中淀粉样斑块的量减少。本说明书中使用的术语“淀粉样斑块”可以是不溶性纤维蛋白聚集体，包含淀粉样 β蛋白。淀粉样斑块可存在于细胞内、细胞膜上和/或细胞之间的间隙中。本文中使用的术语“神经组织”包含中枢神经系统，例如脑部组织。脑部组织包含大脑组织和海马体。大脑组织包含大脑皮层。神经组织包含神经细胞以及神经组织本身。 神经细胞包含神经元细胞和/或小胶质细胞。培养神经组织包含在体内或体外培养神经细胞，例如神经元细胞和/或小胶质细胞。本发明还提供一种降低神经元中tau蛋白的磷酸化程度的方法，所述方法包含在选自由间充质干细胞(MSC)和MSC培养液组成的群组的至少一个存在下，培养神经元。所述培养是如上文提到减少淀粉样斑块的方法时所述。减少神经元中tau蛋白的磷酸化可以是与在MSC和MSC培养液不存在下培养神经元时tau蛋白磷酸化的量相比较，tau蛋白磷酸化量减少。本发明还提供一种增加神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶的表达的方法，所述方法包含在选自由间充质干细胞(MSC)和MSC培养液组成的群组的至少一个存在下，培养神经元或小胶质细胞。所述培养是如上文提到减少神经组织中淀粉样斑块的方法时所述。增加神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶表达可以是与在MSC和MSC培养液不存在下培养神经元或小胶质细胞时神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶的表达相比较，神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶表达增加。本发明还提供一种增加神经元神经突生长的方法，所述方法包含在选自由间充质干细胞(MSC)和MSC培养液组成的群组的至少一个存在下，培养神经元。所述培养是如上文提到减少神经组织中淀粉样斑块的方法时所述。神经元可以是正常神经元或神经突损伤(例如被Αβ损伤)的神经元。增加神经元神经突生长可以是与在MSC和MSC培养液不存在下培养神经元时神经元神经突生长相比较，神经元神经突生长增加。本发明还提供一种预防或治疗个体的神经疾病的方法，所述方法包含投予一种药物组合物，所述药物组合物包含选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、GDF15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA, SPARCL1、血小板反应素-1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。所述方法中使用的投药可以是局部投药或全身投药。可投予有效预防或治疗神经疾病的量。所属领域技术人员将易于了解，有效量可根据疾病状况变化。所述方法中使用的药物组合物与上述药物组合物相同。在所述方法中，神经疾病可以是由选自由淀粉样β蛋白、tau蛋白过磷酸化、脑啡肽酶低表达和神经突损伤组成的群组的至少一个引起的疾病。神经疾病可为阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化或躁狂症。本发明还提供一种减少神经组织中淀粉样斑块的方法，所述方法包含在选自由以下组成的群组的至少一个存在下培养神经组织活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、 ⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA, SPARCL1、血小板反应素-1、 WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。在所述方法中，可在体外或体内培养神经组织，例如神经元。体内培养可进一步包含对个体投予选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、 ⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA, SPARCL1、血小板反应素-1、 WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。投药可为局部投药或全身投药。可投予有效减少斑块量的量。所属领域技术人员将易于了解，有效量可根据疾病状况变化。举例来说，所投予的选自由以下组成的群组的每一个的量可为约1纳克/公斤体重到约100毫克/公斤体重，例如为约10纳克/公斤体重到约50毫克/公斤体重活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP7、 PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素_1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。投予的调配物可进一步包含添加剂，例如水、培养基、缓冲剂或赋形剂。个体可以是需要减少神经组织中的淀粉样斑块的任何动物。动物可包含哺乳动物。哺乳动物可包含人类、小鼠或大鼠。当与不存在选自由以下组成的群组的至少一个相比较时，在其存在下淀粉样斑块有所减少活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、GDF15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素_1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。本发明还提供一种降低神经元中tau蛋白磷酸化程度的方法，所述方法包含在选自由以下组成的群组的至少一个存在下培养神经元活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA, SPARCL1、血小板反应素-1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。所述培养是如上文提到减少神经组织中淀粉样斑块的方法时所述。当与不存在选自由以下组成的群组的至少一个相比较时，在其存在下神经元中tau蛋白磷酸化程度有所降低活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素_1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。本发明还提供一种增加神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶的表达的方法，所述方法包含在选自由以下组成的群组的至少一个存在下培养神经元或小胶质细胞活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP7、 PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素_1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。所述培养是如上文提到减少神经组织中淀粉样斑块的方法时所述。当与不存在选自由以下组成的群组的至少一个相比较时，在其存在下神经元或小胶质细胞中脑啡肽酶表达有所增加活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、GDF15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP、 ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素_1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。本发明还提供一种增加神经元神经突生长的方法，所述方法包含在选自由以下组成的群组的至少一个存在下培养神经元活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP、ICAM5、IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1、血小板反应素-1、WISPl、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。所述培养是如上文提到减少神经组织中淀粉样斑块的方法时所述。神经元可以是正常神经元或神经突损伤(例如被Aβ损伤)的神经元。当与不存在选自由以下组成的群组的至少一个相比较时，在其存在下神经元神经突生长有所增加活化素A、PF4、修饰素、 半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素-1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子，及其任何组合。本文中使用的“间充质干细胞(MSC) ”可以是从选自由以下组成的群组的至少一个分离的MSC:哺乳动物，例如人类、胚卵黄囊、胎盘、脐带、脐血、皮肤、外周血、骨髓、脂肪组织、肌肉、肝、神经组织、骨膜、胎膜、滑膜、滑液、羊膜、半月板、前交叉韧带(anterior cruciate ligament)、关节软骨细胞、乳齿、周细胞、枝状骨(trabecular bone)、髌下脂肪垫(infra patellarfat pad)、脾、胸腺和包含MSC的其它组织；或为通过培养分离的MSC扩增的MSC。如本文中所使用，“脐血”是指从将哺乳动物(包含人类)胎盘与其新生儿身体连接起来的脐带静脉取得的血液。本文中使用的“脐血源性MSC”是指从哺乳动物(例如人类)的脐血分离的MSC或通过培养分离的UCB-MSC扩增的MSC。本文中使用的“治疗”是指防止易于患上某些疾病或病症的动物(例如哺乳动物，包含人类)的尚未诊断的疾病或病症显现；抑制疾病发展；或减轻疾病。本文中未定义的术语具有此项技术中常用的含义。任何已知方法，例如韩国专利第489248号中揭示的方法，都可用于从脐血中分离包含MSC的单核细胞。举例来说，可以使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度法(FicolI-Hypaque density gradient method)，但不限于这种方法。具体点说，在婴儿出生后且在去除胎盘前，使用聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心从脐静脉收集的脐血，获得单核细胞。洗涤单核细胞数次以去除杂质。分离的单核细胞可经历MSC分离和培养，或在极低温度下冷冻来长期储存待用。
任何已知方法都可用于从脐血中分离MSC以及培养MSC(韩国专利公开案第 2003-0069115 号；和匹亭格 MF (Pittinger MF)，科学(Science)，284 143-7，1999 ；以及拉泽卢斯 HM(Lazarus HM)等，骨髓移植(Bone MarrowTransplant), 16 :557-64,1995) 首先，使用聚蔗糖-泛影葡胺梯度离心收集到的脐血，以分离包含造血干细胞 (hematopoietic stem cell)和MSC的单核细胞，并洗涤单核细胞数次，以去除杂质。在培养皿中以适当密度培养单核细胞。随后，使单核细胞增殖以形成单层。当使用相差显微镜 (phase contrast microscope)观察时，单核细胞之中的MSC增殖成均一的纺锤形长细胞集落。将生长的细胞重复继代培养，以获得所需数量的细胞。本发明组合物中所含细胞可以使用已知方法以冷冻形式保存。(坎普斯(Campos) 等，低温生物学(Cryobiology) 35 :921-9 ，19卯)。用于冷冻形式的培养基可包含10 % 二甲亚砜(dimethylsulfoxide, DMS0)以及 10%到 20%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、人外周血或者脐血血浆或血清中的一个。可将细胞悬浮以使1毫升培养基中存在约 IXlO6到5 X IO6个细胞。将细胞悬浮液分配到用于深度冷冻(de印freezing)的玻璃或塑料安瓿中，随后可密封安瓿并放入保持在程序设定温度的深度冷冻箱中。从这一点看，例如，所用冷冻程序将冷冻速率控制在-rc /分钟，由此使解冻期间细胞的损伤减到最少。当安瓿温度低于-90°c时，可将其转移到液氮罐中，并保持在低于-150°c。为了解冻细胞，需将安瓿从液氮罐迅速转移到37°C水浴中。将安瓿中解冻的细胞迅速放入处于无菌条件的含有培养基的培养容器中。在本发明中，分离和培养MSC所使用的培养基可以是此项技术中众所周知的进行普通细胞培养的任何培养基，其含有10%到30% FBS、人外周血或者脐血血浆或血清。举例来说，培养基可为杜贝卡氏改良型伊格氏培养基(Dulbecco' s modified eagle medium, DMEM)、最低必需培养基(minimumessential medium, MEM)、α -MEM、McCoys 5A 培养基、伊格氏基础培养基(Eagle' s basal medium)、康诺特医学研究实验室(Cormaught Medical ResearchLaboratory, CMRL)培养基、格拉斯哥最低必需培养基(Glasgow minimumessential medium)、汉氏 F-12 培养基(Ham‘ s F_12medium)、伊斯卡氏改良型杜贝卡氏培养基(Iscove' s modified Dulbecco' s medium，IMDM)、李博维兹氏 L-15 培养基(Liebovitz ‘ L_15medium)，或洛斯维公园纪念研究所(Roswell ParkMemorial Institute, RPMI) 1640培养基，例如DMEM。悬浮细胞的浓度可为每1毫升培养基5 X IO3到 2 X IO4个细胞。此外，本发明的细胞培养基可进一步包含一种或一种以上辅助组分。辅助组分可为胎牛血清、马血清或人血清；以及抗生素，例如青霉素G(PenicillinG)、硫酸链霉素(sti^ptomycin sulfate)和庆大霉素(gentamycin)；抗真菌剂，例如两性霉素 B(amphotericin B)和制霉菌素(nystatin)；和其混合物，以防微生物污染。脐血源性细胞不表达组织相容性抗原HLA-DR(II类)，而这一抗原是组织或器官移植后出现排斥的主要原因(勒布朗K C (Le Blanc, K C)，实验血液学(Exp Hemato 1),31 890-896，2003 ；谢 W T (Tse W T)等人，移植(Transplantation), 75 :389-397,2003) 由于这些细胞可以使移植后的免疫反应(例如移植组织或器官的排斥反应)减到最少，使得可以使用自体以及异基因脐血。也可使用冷冻细胞。
MSC的培养液可以是用于培养哺乳动物细胞的培养液，所述哺乳动物细胞例如为人骨髓源性MSC、UCB源性MSC、脂肪组织源性干细胞、胚卵黄囊源性MSC、胎盘源性MSC、皮肤源性MSC、外周血源性MSC、肌肉源性MSC、肝源性MSC、神经组织源性MSC、骨膜源性MSC、脐带源性MSC、胎膜源性MSC、滑膜源性MSC、滑液源性MSC、羊膜源性MSC、半月板源性MSC、前交叉韧带源性MSC、关节软骨细胞源性MSC、乳齿源性MSC、周细胞源性MSC、枝状骨源性MSC、 髌下脂肪垫源性MSC、脾源性MSC、胸腺源性MSC和从包含MSC的其它组织分离的MSC和/ 或培养的MSC。培养基可例如为含有FBS或人外周血或脐血的血浆或血清的细胞培养基。细胞培养基可包含例如DMEM、MEM、α -MEM.McCoys 5A培养基、伊格氏基础培养基、CMRL培养基、格拉斯哥最低必需培养基、汉氏F-12培养基、伊斯卡氏改良型杜贝卡氏培养基(IMDM)、李博维兹氏L-15培养基和RPMl 1640培养基，但不限于此。本发明的MSC培养液可包含选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、PF4、 修饰素、半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP, ICAM5、IGFBP, PDGF-AA, SPARCL1、血小板反应素1、WISPl和颗粒蛋白前体、IL-4或诱导至少一种所述蛋白质的因子。本发明的药物组合物可包含至少一种选自由以下组成的群组的蛋白质作为活性成分活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、⑶F15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP、ICAM5、 IGFBP、PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素1、WISP1和颗粒蛋白前体、IL-4或诱导至少一种所述蛋白质的因子。诱导至少一种所述蛋白质的因子可为信号转导系统刺激因子和任何已知因子。 所述因子可为以下实例，但不限于此。诱导半乳糖凝集素3的因子可包含选自由佛波醇 12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)和经修饰脂蛋白组成的群组的至少一个。已知PMA或脂蛋白通过蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、丝裂原活化蛋白激酶 l，2(mitogen-activatedprotein kinase 1，2，MAPK-1，2)和 p38 激酶诱导半乳糖凝集素3。诱导PDGF-AA的因子可包含选自由禽类成红细胞增多症病毒 E26 (avian erythroblastosisvirus E26,v ets)癌基因同系物 1 (Ets-I)和溶血性磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine)组成的群组的至少一个。已知溶血性磷脂酰胆碱经由 MAPK-I，2 诱导 PDGF-AA。所有引用的参考文献都以全文引用的方式并入本文中。本发明将参照以下实例进行更详细地描述。这些实例只是出于说明的目的，而不打算限制本发明的范围。鍾实例1 分离和培养神经干细胞如下分离本文中使用的神经干细胞。神经干细胞是从14天斯普拉-道来大鼠 (Sprague-Dawley rat ；韩国奥伦特伯恩公司(Orient Bion Inc. , Korea))胚胎(embryonic day 14，E14)的大脑皮层和海马体分离得到。首先，切开怀孕大鼠的腹部，并使用剪刀和钳子分离出胚胎。用汉克平衡盐溶液(HBSS)洗涤胚胎以进行剥离，并放入含有冰冷的HBSS的培养皿中。在显微镜下，使用针和钳子分离E14胚胎的大脑皮层和海马体。使用移液管抽吸分离的大脑皮层10到20次，使其成为单个细胞，并放入无血清培养液中。在37°C下，用聚L-鸟氨酸(15微克/毫升；西格玛公司(Sigma)，密苏里州圣路易斯(St. Louis, MO))处理单个细胞16小时，并涂到涂有纤连蛋白(1微克/毫升；西格玛公司)的盖玻片上，持续至少2小时。在补充有20纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和B_27无血清添加剂的无血清Neurobasal 培养基(吉博公司(GIBCO)) 中培养单个细胞约2到4天，直到培养皿约70%的底表面覆盖有单个细胞(70%到80%汇合)为止。去除bFGF，并诱导神经元细胞分化4到6天。在分化期间，在含5% CO2的恒温箱中于37°C下培育细胞，同时每隔一天更换培养基和B27添加剂，并且每天向其中添加bFGF。 分化的神经元用于以下实例中。实例2 分离和扩增UCB源性MSC新生儿刚出生后，在得到母亲许可的情况下，从脐静脉收集脐血(UCB)样品。具体点说，用连接到含有44毫升柠檬酸磷酸葡萄糖抗凝液-1 (citratephosphate dextrose anticoagulant-1，CPDA-1)抗凝剂(韩国绿十字集团(GreenCross Corp. , Korea))的 UCB 收集袋的16号针刺脐静脉，以在重力作用下将UCB收集到收集袋中。收集后，在48小时内处理由此得到的UCB，且单核细胞成活率超过90%。使用聚蔗糖-泛影葡胺梯度(密度 1.077克/毫升；西格玛公司(Sigma))离心收集到的UCB，得到单核细胞，并洗涤这些单核细胞数次，以去除杂质。将细胞悬浮于补充有10%到20% FBS(海克伦公司(HyClone))的最低必需培养基(α-MEM;吉博公司(Gibco BRL))中。将细胞引入补充有10%到20% FBS 的最低必需培养基中达到最佳浓度，并在含5% CO2的恒温箱中于37°C下培养，同时一周两次更换培养基。当培养的细胞形成单层，并且使用相差显微镜鉴别出呈纺锤形扩增的MSC 时，对细胞进行重复继代培养，以便充分扩增MSC。在补充有10%到20% FBS的α -MEM中培养UCB源性MSC。实例3 淀粉样β蛋白的毒性为了准备理想的阿尔茨海默氏病发作条件，在不含bFGF和B27且包含10微摩尔浓度已知会引起阿尔茨海默氏病的淀粉样β蛋白片段1_42(Αβ42，西格玛公司(sigma)， A9810)的无血清Neurobasal 培养基中培养如实例1中所述分化的神经元。神经干细胞分化3到4天后，使用显微镜观察神经干细胞的形态特征。如果鉴别出分化成神经元，就用 Aβ处理细胞M小时。图1说明未经处理和经淀粉样β蛋白处理M小时的活神经元的光学显微镜图像，其用于测量神经元的形态变化。随着淀粉样β蛋白的浓度增加，神经元死亡的数量增加。在图1中，对照组显示了在不含淀粉样β蛋白的无血清Neurobasal 培养基中培养的神经元，Αβ -1微摩尔浓度、Αβ -5微摩尔浓度和Αβ -10微摩尔浓度分别显示在分别包含1 微摩尔浓度、5微摩尔浓度和10微摩尔浓度淀粉样β蛋白的培养基中培养M小时的神经兀。实例4 人UCB源性MSC与用淀粉样β蛋白处理的神经元共培养对神经元死亡的影响当将经淀粉样β蛋白处理的神经元与人UCB源性MSC共培养时，观察到由有毒物质(例如淀粉样β蛋白)损伤的神经元。具体点说，分离Ε14胚胎大脑皮层干细胞和海马体干细胞，并按与实例1中所述相同的方式，使分离的干细胞增殖并分化成神经元，随后如实例3中那样，用10微摩尔浓度淀粉样β蛋白处理。淀粉样β蛋白处理12小时后，在淀粉样β蛋白存在下，将经淀粉样β 蛋白处理的神经元与人UCB源性MSC共培养12小时，由此细胞共计在淀粉样β蛋白存在下培养M小时。共培养是在图2中所示的共培养系统中进行。图2显示用于共培养经淀粉样β蛋白处理的神经元与人UCB源性MSC的共培养系统。参看图2，共培养系统100包含上腔室10和下腔室40，其中上腔室10的底部包含孔径为约1微米的微孔膜30。在上腔室10中培养人UCB源性MSC 20，并在下腔室40中培养由大脑皮层干细胞或海马体干细胞分化而成的神经元50。上腔室10与下腔室40可彼此分开，并且上腔室10底部的下表面与下腔室40底部的上表面相隔约1毫米。通过分别培养下腔室40和上腔室10中的细胞，并将上腔室10加到下腔室40的培养基中，来进行共培养。还培养和观察未经处理的大脑皮层和海马体源性神经元、经淀粉样β蛋白处理的大脑皮层和海马体源性神经元，以及未经淀粉样β蛋白处理且与MSC共培养的大脑皮层和海马体源性神经元。在淀粉样β蛋白处理后，将受损的大脑皮层和海马体源性神经元与人UCB源性MSC共培养M小时，随后使用显微镜观察神经元损伤程度。使用不含bFGF和 B27的无血清Neurobasal 培养基(吉博公司(GIBCO))进行培养。为了定量测量由淀粉样β蛋白处理所引起的神经元死亡，使用荧光染色分析来测量活细胞和死细胞。使用针对动物细胞的LIVE/DEAD 成活力/细胞毒性分析试剂盒(西格玛公司(Sigma)，L3224)分析细胞毒性。所述试剂盒包含钙黄绿素AM(calcein AM)和乙锭均二聚物(ethidium homodimer)，其中钙黄绿素AM用于鉴别活细胞，而乙锭均二聚物用于鉴别死细胞。钙黄绿素AM是可透过细胞的非荧光性染料，并在活细胞中通过细胞中的酯酶水解乙酰氧基甲酯而转化成绿色荧光性钙黄绿素。乙锭均二聚物不能透过活细胞的膜， 但透过受损的细胞膜，并结合于细胞的核酸而放出红色荧光。在共培养系统100的下腔室40中，以含有A β 42的培养基培养大脑皮层和海马体源性神经元，以便直接用A β 42处理神经元。通过活/死细胞染色，死细胞被染成红色，而活细胞染成绿色。结果，当将用10微摩尔浓度A β 42处理M小时的细胞(图3的Ct+A β ) 与未处理细胞(图3的Ct)相比较时，绿色荧光明显减少，且用Αβ42处理观察到大范围红色荧光，由此表明用Αβ 42处理使大部分神经元死亡。然而，如果在图2中所示的共培养系统100中，将损伤的神经干细胞与UCB源性MSC共培养时，神经元死亡得到阻止，且神经元成熟增加(图3的Ct+A β +MSC)。这表明，将A β 42损伤的神经元与UCB-MSC共培养时， 可恢复受损的细胞。在图3中，Ct+Αβ +MSC显示了在包含10微摩尔浓度Αβ 42的无血清 Neurobasal 培养基中培养12小时且随后与UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β 42存在下共培养12小时的大脑皮层源性神经元。此外，当在下腔室40中，在10微摩尔浓度Aβ 42存在下，于无血清Neurobasal 培养基中培养大脑皮层源性神经元，并在上腔室10中，于相同培养基中同时培养UCB源性MSC达M小时时，结果与图3的Ct+A β +MSC中所示相同。因此，如果将神经元与UCB-MSC共培养，就可使A β 42损伤的神经元恢复，并防止A β 42引起的损伤。在图3中，Ct显示在不含A β 42的无血清Neurobasal 培养基中培养M小时的大脑皮层源性神经元，Ct+A β显示在包含10微摩尔浓度A β 42的无血清Neurobasal 培养基中培养M小时的大脑皮层源性神经元，Ct+A β +MSC显示在包含10微摩尔浓度A β 42的无血清Neurobasal 培养中培养12小时且随后与UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β 42存在下
19共培养12小时的大脑皮层源性神经元，且Ct+MSC显示在不含A β 42的无血清Neurobasal 培养基中培养12小时且随后与UCB源性MSC共培养12小时的大脑皮层源性神经元。图4是说明基于图3的结果的死亡神经元百分比的图。在图4中，皮层显示在不含Αβ 42的培养基中培养大脑皮层源性神经元的对照组的结果，皮层+Αβ显示在包含10 微摩尔浓度A β 42的培养基中培养大脑皮层源性神经元M小时得到的结果，皮层+A β +MSC 显示在包含10微摩尔浓度A β 42的培养基中培养大脑皮层源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元与人UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β 42存在下共培养12小时得到的结果，且皮层+MSC显示在不含A β 42的培养基中培养大脑皮层源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元与人UCB源性MSC共培养12小时得到的结果。实例5 人骨髓源性MSC与用淀粉样β蛋白处理的神经元共培养对神经元死亡的影响按与实例4中相同的方式，使用从捐赠的骨髓收集的骨髓源性MSC(BM-MSC)进行实验。当将经Αβ处理的神经元与骨髓源性MSC共培养时，如实例4中一样，神经元死亡得到阻止(图5中的Ct/Aβ /BM-MSC)。图5说明荧光染色的结果，其解释了神经元与人骨髓源性MSC共培养对Αβ 42引起的神经元死亡的影响。在图5中，Ct显示在不含Αβ的培养基中培养大脑皮层源性神经元的对照组的结果，Ct+Αβ显示在包含10微摩尔浓度A β的培养基中培养大脑皮层源性神经元M小时得到的结果，Ct/A β /BM-MSC显示在包含10微摩尔浓度A β的培养基中培养大脑皮层源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元与人骨髓源性MSC在10微摩尔浓度A β存在下共培养12小时得到的结果，且Ct+BM-MSC显示在不含A β的培养基中培养大脑皮层源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元与人骨髓源性MSC共培养12 小时得到的结果。实例6 人UCB源性MSC与用淀粉样β蛋白处理的神经元共培养对tau蛋白磷酸化的影响图6说明使用抗磷酸化tau抗体染色的神经元，所述抗磷酸化tau抗体是结合于在Αβ 42作用下磷酸化的tau的抗体，其中tau称为诱导神经元死亡的蛋白质。将抗磷酸化tau抗体与红色荧光Cy3接合，以观察抗磷酸化tau抗体与磷酸化tau的结合。图6中第一行显示了经接合Cy3的抗磷酸化tau抗体染色的神经元，且图6中第二行显示了经 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色的神经元。在图6第一行中，Ct显示在不含Αβ的培养基中培养大脑皮层源性神经元的对照组的结果，Αβ 42显示在包含10微摩尔浓度Αβ的培养基中培养大脑皮层源性神经元 24小时得到的结果，A β 42/MSC显示在包含10微摩尔浓度A β的培养基中培养大脑皮层源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元与人UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β 42 存在下共培养12小时得到的结果，且MSC显示在不含Αβ的培养基中培养大脑皮层源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元与人UCB源性MSC共培养12小时得到的结果。 如图6第一行中所示，tau蛋白在神经元中迅速磷酸化，但通过与人UCB源性MSC共培养而脱磷酸化(参见图6的A β 42和A β 42/MSC)。如图6第二行中所示，DAPI染色显示，在图6第一行中未被抗磷酸化tau抗体染色的大脑皮层源性神经元得以保留。DAPI染色是使用VECTASHIELD (维克特实验室(VECTORLABORATORIES))进行，并且在即将使用显微镜观察细胞前，将含DAPI的封片剂(mounting medium)添加到沉积有细胞的载玻片上。实例7 当经淀粉样β蛋白处理的神经元与人UCB源性MSC共培养时使用免疫荧光染色分析分化的神经元使用特异性结合微管相关蛋白(MAP》和微管蛋白β III (已知的神经元分化标记物)的抗体，对源自于大脑皮层和海马体的神经元进行染色。如下进行免疫荧光染色。在室温下，使用4%多聚甲醛(paraformaldehyde)将神经元固定在12孔板的孔中，保持20分钟，并用0. 1 % BSA/PBS洗涤4次，每次5分钟。随后， 向其中添加含有10%正常山羊血清(normal goat serum，NGS)、0. 3%曲通X-100 (Triton X-100)和0. 1 % BSA/PBS的溶液，并在室温下反应30到45分钟，由此防止非特异性反应。 将包含一次抗体、10% NGS和0. BSA/PBS的溶液添加到各孔中，并在4°C下反应过夜。用 0. 1 % BSA/PBS洗涤所得物3次，每次5分钟。向其中添加二次抗体和包含结合于二次抗体的试剂的0. 1 % BSA/PBS溶液，并反应4分钟，随后用0. 1 % BSA/PBS洗涤所得物4次，每次 5分钟。一次抗体是通过在缓冲溶液中，分别以1 500和1 200稀释在小鼠中产生的单克隆抗微管蛋白β III抗体(西格玛公司(Sigma))和兔抗微管相关蛋白(MAP)2多克隆抗体(卡梅隆公司(Chemicon))制备而成。二次抗体是通过在缓冲溶液中分别以1 200稀释生物素化抗小鼠抗体和生物素化抗兔抗体(维克特公司(Vector))制备而成。结合于二次抗体的试剂是通过在缓冲溶液中以1 200稀释二氯三嗪基荧光素(dichlorotriazinyl fluorescein，DTAF ；杰克逊免疫研究公司(Jackson immunoResearch))制备而成。在用Αβ42处理的神经元(大脑和海马体源性神经元)中，由于毒性，致使神经突裂解，并且神经元的形状被减缩。另一方面，在与UCB源性MSC共培养的神经元中，神经突得以保持，并且神经元成熟加快(图7的A、B和C)。图7说明经Αβ 42处理、与UCB源性MSA共培养且使用抗微管蛋白0 111和抗默卩2 使用免疫荧光染色法进行染色并经历蛋白免疫印迹的神经元。图7的A显示大脑皮层源性神经元，图7的B显示海马体源性神经元。ΜΑΡ2和微管蛋白β III分别显示使用抗ΜΑΡ2和抗微管蛋白β III进行免疫荧光染色得到的结果。 对照组显示在不含Αβ的无血清Neurobasal 培养基中培养大脑皮层源性神经元或海马体源性神经元M小时的对照组的结果，A β 42显示在包含10微摩尔浓度A β的培养基中培养大脑皮层源性神经元或海马体源性神经元M小时得到的结果，Ai3 42/MSC显示在包含10 微摩尔浓度Αβ的无血清Neurobasal 培养基中培养大脑皮层源性神经元或海马体源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元或海马体源性神经元与人UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β 42存在下共培养12小时得到的结果，且MSC显示在不含A β的培养基中培养大脑皮层源性神经元或海马体源性神经元12小时且随后将大脑皮层源性神经元或海马体源性神经元与人UCB源性MSC共培养12小时得到的结果。图7的C显示将用A β 42处理的大脑皮层源性神经元与UCB源性MSC共培养且使用抗ΜΑΡ2抗体对共培养的神经元进行蛋白免疫印迹得到的结果。首先，在含有十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)的溶解缓冲液中，使用超声发生器破坏神经元的膜， 以提取蛋白质。使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶对提取的蛋白质进行电泳，以使蛋白质根据尺寸分离。当电泳终止时，使用蛋白质的电特性将蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并使其与在含有3%脱脂乳的PBS中稀释的抗MAP2抗体(密理博化学公司(Millipore chem))反应。随后， 向其中添加与接合抗生蛋白链菌素(sti^ptavidin)的二氯三嗪基荧光素(DTAF，杰克逊免疫研究公司(Jackson immuno Research))接合的抗兔抗体(维克特公司(Vector))，并用增强化学发光(enhancedchemiluminescence，ECL)底物溶液处理所得物，随后使用X射线胶片显影所得物。在图7的C中，对照组、A β ,A β+MSC和MSC与上文所述相同。在图7的 C中，200表示200千道尔顿的分子量标记。实例8 借助人UCB源性MSC诱导神经元和小胶质细胞中脑啡肽酶表达脑啡肽酶(NEP)与胰岛素降解酶(insulin degrading enzyme, IDE)都是公认的在体内降解Αβ42的蛋白质。此外，据报导，在小鼠体内剔除NEP会引起阿尔茨海默氏病症状。收集实例4到7中制备的神经元，并溶解，以提取蛋白质。在SDS-PAGE中使用电泳分离蛋白质，并通过使用抗脑啡肽酶抗体对分离的蛋白质进行蛋白免疫印迹来测量蛋白质的表达。此外，还借助RT-PCR，使用NEP特异性引物测量NEP的mRNA表达。另外，用抗NEP抗体对培养的细胞进行染色。首先，在室温下，使用4%多聚甲醛将神经元固定在12孔板的孔中，保持20分钟， 并用0. 1 % BSA/PBS洗涤4次，每次5分钟。随后，在室温下向其中添加含有10 %正常山羊血清(NGS)、0· 3%曲通X-100和0. 1 % BSA/PBS的溶液，保持30到45分钟，由此防止非特异性反应。将含一次抗体的10% NGS和0. 1 % BSA/PBS添加到各孔中，并在4°C下反应过夜。用0. BSA/PBS洗涤所得物3次，每次5分钟。向其中添加二次抗体和含有结合于二次抗体的试剂的0. 1 % BSA/PBS溶液，并在室温下反应40分钟，并用0. 1 % BSA/PBS洗涤所得物4次，每次5分钟。在小鼠中产生并用缓冲溶液按1 500稀释的单克隆抗NEP抗体 (西格玛公司(Sigma))用作一次抗体。在缓冲溶液中按1 200稀释的生物素化抗小鼠抗体(维克特公司(Vector))用作二次抗体。在缓冲溶液中按1 200稀释的接合抗生蛋白链菌素的二氯三嗪基荧光素(DTAF，杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research))用作结合于二次抗体的试剂。图8说明在用A β 42处理且与人骨髓源性MSC或人UCB源性MSC共培养的大鼠神经元中脑啡肽酶的表达。在图8的A中，上图显示培养的大鼠大脑皮层源性神经元的蛋白免疫印迹分析。神经元显示在不含A β的无血清Neurobasal 培养基中培养大鼠大脑皮层源性神经元M小时的对照组的结果，神经元+Αβ显示在包含10微摩尔浓度Aβ的培养基中培养大鼠大脑皮层源性神经元M小时得到的结果，神经元+A β +MSC显示在包含10微摩尔浓度A β的无血清Neurobasal 培养基中培养大鼠大脑皮层源性神经元12小时且随后将大鼠大脑皮层源性神经元与人UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β存在下共培养12小时得到的结果，且神经元+MSC显示在不含A β的培养基中培养大鼠大脑皮层源性神经元12小时且随后将大鼠大脑皮层源性神经元与人UCB源性MSC共培养12小时得到的结果。在图8的A中，下图显示使用从培养的大鼠神经元分离的mRNA作为模板得到的 RT-PCR结果。使用对大鼠NEP基因具特异性的PCR引物(SEQ IDNOS :15禾口 16)和对β-肌动蛋白基因具特异性的PCR引物(SEQ ID N0S:17和18)。根据RT-PCR，产生扩增的NEP基因022个碱基对)和扩增的β-肌动蛋白基因(300个碱基对)。神经元、神经元+Αβ、神经元+A β +MSC和神经元+MSC如上文所述。
如图8的A中所示，如果用A β 42处理大鼠神经元，NEP的表达就降低。如果将用 A β 42处理的大鼠神经元与人UCB源性MSC共培养，那么在蛋白质和mRNA水平上，NEP的表达增加。这表明，人MSC刺激大鼠神经元以增加NEP的产量并去除有毒的A β 42蛋白。在图8的B中，Ct、Αβ , Aβ +MSC和MSC分别对应于神经元、神经元+Αβ、神经元 +A β +MSC 禾口神经元 +MSC。根据以下方法对细胞染色。首先，在室温下，使用4%多聚甲醛将神经元固定在 12孔板的孔中，保持20分钟，并用0. 1 % BSA/PBS洗涤4次，每次5分钟。随后，在室温下向其中添加含有10%正常山羊血清(NGS)、0. 3%曲通Χ-100和0. 1 % BSA/PBS的溶液，保持30到45分钟，由此防止非特异性反应。将含一次抗体的10% NGS和0. 1 % BSA/PBS添加到各孔中，并在4°C下反应过夜。用0.1% BSA/PBS洗涤所得物3次，每次5分钟。向其中添加二次抗体和含有结合于二次抗体的试剂的0. 1% BSA/PBS溶液，并在室温下反应40 分钟，并用0. BSA/PBS洗涤所得物4次，每次5分钟。在小鼠中产生并用缓冲溶液按 1 500稀释的单克隆抗NEP抗体(西格玛公司(Sigma))用作一次抗体。在缓冲溶液中按 1 200稀释的生物素化抗小鼠抗体(维克特公司(Vector))用作二次抗体。在缓冲溶液中按1 200稀释的接合抗生蛋白链菌素的二氯三嗪基荧光素(DTAF，杰克逊免疫研究公司 (Jackson immunoResearch))用作结合于二次抗体的试剂。如图8的B中所示，如果用A β 42处理神经元，那么染成红色的部分明显减少，由此表明神经元中NEP的表达减少。然而，如果神经元与MSC共培养，那么NEP的表达得以恢
Μ. ο图8的C显示RT-PCR的结果，其表明使用骨髓源性MSC (BM-MSC)使大鼠神经元中 NEP的表达增加。NEP和β -肌动蛋白的RT-PCR是使用与关于图8的A所述相同的引物在相同条件下进行。在图8的C中，第1道显示在不含Αβ的无血清Neurobasal 培养基中培养大鼠大脑皮层源性神经元M小时的对照组的结果，第2道和第3道显示在不含A β的培养基中培养大鼠大脑皮层源性神经元12小时且随后将大鼠大脑皮层源性神经元与人骨髓源性 MSC(BM-MSC1和BM-MSC2)共培养12小时得到的结果。从这一点看,BM-MSCl和BM-MSC2表示从不同供体获得的细胞。图8的C中所示的结果展现，当将大鼠大脑皮层源性神经元与人BM-MSC共培养时，在mRNA水平上大鼠大脑皮层源性神经元的NEP表达增加。另外，根据蛋白免疫印迹分析和免疫印迹分析，证实当将大鼠大脑皮层源性神经元与人BM-MSC共培养时，在蛋白质水平上，神经元中NEP的表达增加。脑部不仅包含神经元，而且还包含小胶质细胞，其称为脑部的巨噬细胞，并且可去除脑部积累的有毒物质。小胶质细胞会去除阿尔茨海默氏病中的Αβ。根据近期的报导，小胶质细胞中NEP表达减少将加速阿尔茨海默氏病的进展。因此，使用免疫荧光染色来鉴别神经元和小胶质细胞中人UCB细胞对NEP表达的修复作用(图9)。图9说明当将用Αβ42 处理的神经元与MSC共培养时，神经元和小胶质细胞中脑啡肽酶的表达。图9第一行显示在包含10微摩尔浓度A β的无血清Neurobasal 培养基中培养 12小时，随后与人UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β 42存在下共培养12小时，并使用特异性结合神经元标记物ΜΑΡ2和NEP中每一个的抗体双重染色的大脑皮层源性神经元。染色是按与图8的B中相同的方式进行，但针对ΜΑΡ2，兔抗ΜΑΡ2抗体用作一次抗体，生物素化抗兔抗体用作结合于一次抗体的二次抗体，且接合抗生蛋白链菌素的二氯三嗪基荧光素 (DTAF，杰克逊免疫研究公司(Jackson immuno Research))用作结合于二次抗体的试剂；而针对NEP，在小鼠中产生的单克隆抗NEP抗体(西格玛公司(Sigma))用作一次抗体，生物素化抗小鼠抗体(维克特公司(Vector))用作二次抗体，且接合抗生蛋白链菌素的二氯三嗪基荧光素(DTAF，杰克逊免疫研究公司(Jackson immuno Research))用作结合于二次抗体的试剂。在图9第一行中，MAP2和NEP显示分别使用抗MAP2抗体和抗NEP抗体染色的神经元，且MAP2+NEP显示分别使用抗MAP2抗体和抗NEP抗体染色的神经元的重叠图像。DAPI 显示使用DAPI按与图6第二行中相同的方式染色得到的结果。由于如图9第一行中所示，MAP2和NEP都显示染色的细胞，故鉴别出MAP2和NEP 都在神经元中表达。此外，根据图像重叠(MAP2+NEP)，在相同区域中发现MAP2和NEP，并由此鉴别出，MAP2和NEP都得到表达。利用DAPI对神经元染色，并由此鉴别出神经元是保持正常情况。图9第二行显示与图9第一行中所示相同实验的结果，但使用小胶质细胞代替神经元，并且使用小胶质细胞标记物⑶40和NEP作为小胶质细胞的标记物，代替MAP2和NEP。 针对CD40，使用山羊抗CD40抗体作为一次抗体对CD40进行染色，接合生物素的抗山羊抗体作为结合于一次抗体的二次抗体，且在缓冲溶液中按1 200稀释的接合抗生蛋白链菌素的二氯三嗪基荧光素(DTAF，杰克逊免疫研究公司(Jackson immuno Research))作为结合于二次抗体的试剂。由于如图9第二行中所示，⑶40和NEP都显示染色的细胞，故鉴别出⑶40和NEP 都在小胶质细胞中表达。此外，根据图像重叠(⑶40+NEP)，在相同区域中发现⑶40和NEP， 并由此鉴别出，在小胶质细胞中MAP2和NEP都得到表达。利用DAPI对小胶质细胞染色，并由此鉴别出小胶质细胞是保持正常情况。根据图9第一行和第二行的结果，如果将神经元和小胶质细胞与UCB源性MSC共培养，就会诱导经A β处理的神经元和小胶质细胞中NEP的表达。实例9 鉴别由MSC分泌的防止Αβ 42毒性的蛋白质并验证所述蛋白质的作用根据实例4到8的结果，鉴别出如果将用Αβ 42处理的神经元与MSC共培养，同时神经元与MSC之间不直接接触，那么神经元中的A β 42毒性受到抑制。可以预测，由MSC分泌的物质与神经元之间的相互作用可抑制Αβ 42的毒性。在实例9中，检测和鉴别由MSC分泌的抑制A β 42毒性的物质。(1)检测抑制A β 42毒性的MSC源性物质首先，在各种条件下培养细胞。培养组1 在不含Αβ的无血清Neurobasal 培养基中培养大脑皮层源性神经元 24小时。培养组2 在包含10微摩尔浓度A β的无血清Neurobasal 培养基中培养大脑皮层源性神经元M小时。培养组3 在包含10微摩尔浓度A β的无血清Neurobasal 培养基中培养大脑皮层源性神经元12小时，随后与人UCB源性MSC在10微摩尔浓度A β存在下共培养12小时。培养组4 在包含10微摩尔浓度A β的无血清Neurobasal 培养基中培养人UCB 源性MSC 24小时。
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培养组5和6 在无血清Neurobasal 培养基中培养人UCB源性MSC 24小时。随后，收集培养组1到6的培养基，并分析和比较彼此的细胞因子和蛋白质，以检测当只培养干细胞时不表达或极少表达但当共培养干细胞和神经元时表达增加的细胞因子或蛋白质。使用RayBio 人细胞因子抗体阵列I G系列(Human Cytokine Antibody Array I G series ；雷拜泰克公司(feiyBiotech，Inc))进行细胞因子分析，并使用feiyBio 人细胞因子抗体阵列I G系列/基于生物素标记的抗体阵列I G系列(Biotin Label Based Antibody Array I (Series ；雷拜泰克公司)进行蛋白质分析。使用这两个阵列可分析 54，504种蛋白质。比较这些分析的数据，选出在只培养干细胞时不表达或极少表达但在干细胞与神经元共培养时表达增加的蛋白质。由此鉴别出以下14种蛋白质活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(⑶F15)、 磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子5(ICAiK)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1 (TSPl)、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)和颗粒蛋白前体 (PGN)。据估计，这14种蛋白质抑制用Αβ处理的神经元的毒性，并促进神经元分化和成熟。(2)鉴别所检测的14种蛋白质的活性检测的14种蛋白质的重组蛋白购自(R&D系统公司(R&D SYSTEMS))。随后，用Αβ 处理大脑皮层源性神经元，并在分别含有25纳克/毫升活化素Α、25纳克/毫升PF4、3纳克/毫升半乳糖凝集素3、100纳克/毫升修饰素、50纳克/毫升GDF15、50纳克/毫升磷脂酰基醇蛋白聚糖3、50纳克/毫升MFRP、50纳克/毫升ICAM5、30纳克/毫升IGFBP7、50 纳克/毫升PDGF-AA、50纳克/毫升SPARCLU50纳克/毫升TSPl、50纳克/毫升WISPl和 50纳克/毫升颗粒蛋白前体的无血清Neurobasal 培养基中培养M小时。接着，通过使用 LIVE/DEAD 成活力/细胞毒性分析试剂盒(西格玛公司(Sigma)，L3224)进行荧光染色来测量神经元的死亡。根据死细胞和活细胞的数量，计算A β引起的细胞死亡的程度。使用死细胞数量比细胞总数的比率来计算细胞死亡。图10是说明经Αβ 42处理并与MSC分泌的蛋白质共培养的死亡神经元的百分比的图。在图10中，皮层显示在不含Αβ 42的无血清Neurobasal 培养基中培养M小时的大脑皮层源性神经元，皮层+A β显示在包含10微摩尔浓度A β 42的无血清Neurobasal 培养基中培养M小时的大脑皮层源性神经元，皮层+Αβ +MSC显示在包含10微摩尔浓度 Αβ 42的无血清Neurobasal 培养基中培养12小时且随后与UCB源性MSC在10微摩尔浓度 A β 42存在下共培养12小时的大脑皮层源性神经元，且皮层+MSC显示在不含A β 42的无血清Neurobasal 培养基中培养12小时且随后与UCB源性MSC共培养12小时的大脑皮层源性神经元。Αβ显示在包含Αβ42和14种上述浓度蛋白质中每一种的无血清Neurobasal 培养基中培养或M小时的大脑皮层源性神经元(在图10中，ρ < 0. 03和ρ < 0. 01分别指示，t检验的误差范围分别小于3%和)。如图10中所示，14种蛋白质中每一种都抑制A β 42所引起的神经元死亡。抑制细胞死亡的程度按递减次序为皮层+Αβ +MSC、半乳糖凝集素3、WISPl和MFRP。这表明，与MSC共培养，S卩14种蛋白质的组合对抑制Αβ毒性具有最强作用。为了测量蛋白质对神经元成熟的影响，测量培养细胞中神经突的长度。按与关于图10所述的相同条件培养神经元。从每一培养组中随机选出100个细胞，并使用 i-solution软件(iM技术公司(iMTechnology))测量神经突长度。图11是说明与Αβ 42和MSC分泌的蛋白质一起培养的神经元中神经突长度的图。 在图11中，培养组与图10中所述相同，且神经突长度为平均长度。如图11中所示，与用 Αβ42处理的神经元相比较，14种蛋白质中每一种或14种蛋白质的组合使神经突长度显著增加。实例10 鉴别由MSC分泌的诱导小胶质细胞中脑啡肽酶表达的细胞因子本文中使用实例4中所述的共培养系统100。在下腔室40中培养小胶质细胞 (BV2)，并在上腔室10中培养UCB源性MSC(UCB-MSC)。BV2细胞是通过用v-raf/v-myc重组逆转录病毒感染小鼠的小胶质细胞制备的永生化细胞，并表现活化小胶质细胞的性状。 在下腔室40中，在补充有5% FBS的DMEM中培养BV2细胞，将在补充有5% FBS的α -MEM 中培养的UCB源性MSC添加到上腔室10中，并用无血清DMEM更换培养基，由此进行共培养。在无血清DMEM中共培养细胞M小时。随后，从上腔室10中收集MSC，并使用三唑 (trizol)试剂获得总RNA，随后使用总RNA作为模板进行RT-PCR。使用扩增IL_4(SEQ ID NOS 22 和 23)、IL-6 (SEQ ID NOS 24 和 25)、IL-8 (SEQ ID NOS 26 和 27)和单核细胞趋化蛋白一l(monocytechemoattractant protein-1,MCP-I ；SEQ ID NOS :28禾口 29)基因的弓|物。 使用引物(SEQ ID N0S:17和18)扩增β -肌动蛋白，作为对照组。在对照组中，使用在与上述相同的条件下培养的UCB源性MSC (UCB-MSC)，但UCB源性MSC未与小胶质细胞(BV2) 共培养。图12显示在小胶质细胞与UCB-MSC共培养后使用从UCB-MSC分离的总RNA作为模板得到的RT-PCR的结果。如图12中所示，如果共培养小胶质细胞与UCB-MSC，那么UCB-MSC 中IL-4、IL-6、IL-8和MCP-I的表达增加。分别在IL-4、IL-6、IL-8和MCP-I存在下，培养小胶质细胞、BV2细胞、神经元和 SH-SY5Y细胞(ATCC)，随后收集BV2细胞和SH-SY5Y细胞。溶解收集到的细胞，并根据尺寸从溶解产物中分离蛋白质，并使用抗NEP抗体对所得物进行蛋白免疫印迹。结果是，当与在 IL-4不存在下相比较时，在IL-4存在下培养的BV2细胞和SHY-5Y细胞中NEP的表达随时间增加。SH-SY5Y细胞是源自于SK-N-SH的三次克隆的成神经细胞瘤。SH-SY5Y细胞代表神经元细胞。图13显示蛋白免疫印迹的结果，其表明当在IL-4存在下培养神经元和小胶质细胞时NEP的表达增加。图13的A显示在包含10纳克/毫升IL-4的DMEM中培养M小时的小胶质细胞(BV2细胞)的蛋白免疫印迹的结果。图13的B显示在包含10纳克/毫升 IL-4的α -MEM中培养M小时的神经元(SH-SY5Y细胞)的蛋白免疫印迹的结果。实例11 通过将UCB源性MSC投入经转化而患有阿尔茨海默氏病的小鼠的海马体和皮层中来减少淀粉样蛋白斑块(硫代黄素S染色和免疫印迹)为了改善治疗的效果，使用立体定向框架，将PBS、含1 X IO4个UCB源性MSC的PBS 和含200微克/公斤(体重)IL-4(派罗泰克公司(P^rotech))的PBS投入经转化而患有阿尔茨海默氏病的10个月大的小鼠的海马体中。10天后，杀死小鼠，并从其海马体和大脑皮层收集脑部组织。将得到的脑部组织切成薄片，并使用硫代硫酸盐(西格玛公司(Sigma)) 染色以鉴别淀粉样β蛋白斑块。为了鉴别斑块，使脑部组织与溶解于50%乙醇中的硫代黄素溶液(西格玛公司)反应5分钟。反应后，用50%乙醇和水洗涤脑部组织的薄片5分钟。使用荧光显微镜观察这些薄片以鉴别脑部组织中的淀粉样蛋白斑块。图14显示使用Thio-S染色所染色的脑部组织(包含海马体和大脑皮层)中淀粉样β蛋白斑块的图像。如图14中所示，在投予UCB源性MSC和IL-4的培养组中，淀粉样β蛋白斑块明显减少。在图14中，PBS、MSC和IL-4分别显示投予PBS、UCB源性MSC和 IL-4的培养组。图15是说明图14的图像中淀粉样β蛋白斑块的总面积的图。所述面积是使用 Metamorpho软件(分子装置公司(Molecular devices))测量的。如图15中所示，当与对照组相比较时，在投予MSC和IL-4的培养组中，淀粉样β蛋白斑块明显减少。图16显示免疫印迹的结果，其表明在实验用小鼠的脑中产生的淀粉样β蛋白的变化。图16的图是根据以下方法获得。首先，从小鼠的脑部组织(包含海马体和大脑皮层)提取出蛋白质，并按上述条件使用超声波仪(布朗森公司(Branson))处理。随后，使用电泳法，根据尺寸分离提取物。借助电位差将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并使用能够特异性检测A β 42的抗体进行免疫印迹。使用考马斯蓝(coomassie blue ；下面部分) 对蛋白质进行染色。如图16中所示，当与投予PBS的培养组相比较时，在投予MSC和IL-4 的培养组中，Αβ 42蛋白的量明显减少。在图16中，Litter表示经转化小鼠的同窝仔畜，且 APP/PS1小鼠表示经转化而患有阿尔茨海默氏病的小鼠。此外，PBS,MSC和IL-4分别显示投予PBS、MSC和IL-4的培养组。实例12 =UCB源性MSC和IL-4对NEP表达的影响(1)正常动物和经转化而患有阿尔茨海默氏病的动物的脑部组织中NEP的表达获取分别饲养6、9、12和18个月的正常小鼠和经转化而患有阿尔茨海默氏病的小鼠的脑部组织，并按与实例11相同的方式提取蛋白质，并使用电泳法分离。将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并与抗NEP抗体(R&D系统公司(R&D systems))反应，以分析NEP 的表达。图17显示正常小鼠和经转化而患有阿尔茨海默氏病的小鼠的脑部组织(包含海马体和大脑皮层)中NEP的表达程度。如图17中所示，在经转化而患有阿尔茨海默氏病的小鼠的脑部组织中NEP的表达减少。在图17中，Litter和APP/PS1小鼠与关于图16所述相同。此外，第6、9、12和18道分别显示培养6、9、12和18个月的培养组(M 月份)。图18是说明使用Quantity One软件(伯乐公司(Bio-RAD))测量的图17中NEP 的谱带强度的图。所述谱带强度是相对强度。如图18中所示，与正常小鼠相比较，在经转化而患有阿尔茨海默氏病的小鼠的脑部组织中NEP的表达减少。(2) UCB源性MSC和IL-4对NEP表达的影响将PBS、含1 X IO4个UCB源性MSC的PBS和含200微克/公斤(体重)IL-4的 PBS(派普泰克公司(Peprotech))投入经转化而患有阿尔茨海默氏病的10个月大的小鼠的海马体中。10天后，杀死小鼠，并收集包含海马体和大脑皮层的脑部组织。从每一脑部组织提取蛋白质，并使用电泳法分离，以使用免疫印迹法分析表达的NEP的量。图19显示在投予MSC和IL-4的小鼠脑部组织(包含海马体和大脑皮层)中NEP的表达程度。使用考马斯蓝进行染色(下面部分)。如图19中所示，当与上述操作(1)中所示的正常小鼠相比较时，投予PBS的培养组中NEP的表达减少，且投予UCB源性MSC和 IL-4的培养组中NEP的表达与正常小鼠类似。实例13 =UCB源性MSC和IL_4对小胶质细胞中NEP表达的影响在实例8中，已经鉴别出，当神经元和小胶质细胞分别与MSC共培养时，神经元和小胶质细胞中NEP过表达。实例13中，在动物模型中鉴别这一作用。按如图8的B中所示相同的方式，对实例12中所述的投予PBS、UCB源性MSC和IL-4的培养组的脑海马体组织进行染色。使用抗NEP抗体和抗CD40抗体作为小胶质细胞标记物(圣塔克鲁兹生物技术公司(Santacruz Biotechnology))，并合并结果。在抗NEP抗体染色中，二次抗体和结合于二次抗体的试剂与实例8中所述相同。在抗CD40抗体染色中，二次抗体和结合于二次抗体的试剂也与实例 8中所述相同。图20显示在投予UCB源性MSC和IL_4的小鼠小胶质细胞中NEP的表达。如图20 中所示，当将UCB源性MSC和IL-4投入动物模型中时，诱导小胶质细胞中NEP过表达。尽管已经参照本发明的示范性实施例特别显示和描述了本发明，但所属领域技术人员应了解，可在不偏离以上权利要求书所界定的本发明精神和范围的情况下对其中的形式和细节进行各种修改。
权利要求
1.一种用于预防或治疗神经疾病的药物组合物，其包括选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞是从选自由以下组成的群组的具有间充质干细胞的至少一个组织分离的间充质干细胞人胚卵黄囊、胎盘、脐带、脐血、皮肤、外周血、骨髓、脂肪组织、肌肉、肝、神经组织、骨膜、胎膜、滑膜、滑液、 羊膜、半月板、前交叉韧带、关节软骨细胞、乳齿、周细胞、枝状骨、髌下脂肪垫、脾及胸腺；和 /或由所述间充质干细胞扩增的间充质干细胞。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述间充质干细胞包括脐血源性间充质干细胞或骨髓源性间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述培养液包括选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子 15(GDF15)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子5 (ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述神经疾病是由选自由以下组成的群组的至少一个引起的疾病神经组织中淀粉样β蛋白斑块形成、神经元中tau蛋白磷酸化、神经突损伤、神经元中脑啡肽酶表达减少及其任何组合。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述神经疾病包括选自由以下组成的群组的至少一个阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化及躁狂症。
7.一种用于预防或治疗神经疾病的药物组合物，其包括选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDF15)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子5(ICAiK)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述神经疾病是由选自由以下组成的群组的至少一个引起的疾病神经组织中淀粉样β蛋白斑块形成、神经元中tau蛋白磷酸化、神经突损伤、神经元中脑啡肽酶表达减少及其任何组合。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述神经疾病包括选自由以下组成的群组的至少一个阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化及躁狂症。
10.一种用于防止由淀粉样β蛋白引起的神经细胞毒性的试剂盒，其包括选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个。
11.一种用于防止神经元中的tau蛋白磷酸化的试剂盒，其包括选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个。
12.一种用于诱导神经元和/或小胶质细胞中脑啡肽酶表达的试剂盒，其包括选自由间充质干细胞以及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个。
13.一种用于防止由淀粉样β蛋白引起的神经细胞毒性的试剂盒，其包括选自由以下组成的群组的至少一个活化素Α、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDFM)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子 5 (ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA (PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、 颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
14.一种用于防止神经元中tau蛋白磷酸化的试剂盒，其包括选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子 15(GDF15)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子5 (ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
15.一种用于诱导神经元和/或小胶质细胞中脑啡肽酶表达的试剂盒，其包括选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDFM)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子 5 (ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA (PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、 颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
16.一种预防或治疗个体的神经疾病的方法，所述方法包括对所述个体投予药物组合物，所述药物组合物包括选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述神经疾病是由选自由以下组成的群组的至少一个引起的疾病神经组织中淀粉样β蛋白斑块形成、神经元中tau蛋白磷酸化、神经突损伤、神经元中脑啡肽酶表达减少及其任何组合。
18.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述神经疾病包括选自由以下组成的群组的至少一个阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化及躁狂症。
19.一种预防或治疗个体的神经疾病的方法，所述方法包括对所述个体投予药物组合物，所述药物组合物包括选自由以下组成的群组的至少一个活化素A、血小板因子 4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDFM)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子5(ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组I=I O
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述神经疾病是由选自由以下组成的群组的至少一个引起的疾病神经组织中淀粉样β蛋白斑块形成、神经元中tau蛋白磷酸化、神经突损伤、神经元中脑啡肽酶表达减少及其任何组合。
21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述神经疾病包括选自由以下组成的群组的至少一个阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、抑郁症、癫痫、多发性硬化及躁狂症。
22.—种减少神经组织中的淀粉样斑块的方法，其通过在选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个存在下，培养所述神经组织实现。
23.一种降低神经元中tau蛋白的磷酸化程度的方法，其通过在选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个存在下，培养所述神经元实现。
24.一种增加细胞脑啡肽酶表达的方法，其通过在选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个存在下，培养所述细胞实现，其中所述细胞是选自由神经元细胞及小胶质细胞组成的群组的至少一种细胞。
25.一种增加神经元神经突生长的方法，其通过在选自由间充质干细胞及所述间充质干细胞培养液组成的群组的至少一个存在下，培养所述神经元实现。
26.一种减少神经组织中淀粉样斑块的方法，其通过在选自由以下组成的群组的至少一个存在下，培养所述神经组织实现活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDFK)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、 胞间粘附分子5(ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
27.一种降低神经元中tau蛋白的磷酸化程度的方法，其通过在选自由以下组成的群组的至少一个存在下，培养所述神经元实现活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDFM)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、 胞间粘附分子5(ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
28.一种增加细胞脑啡肽酶表达的方法，其通过在选自由以下组成的群组的至少一个存在下，培养所述细胞实现活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDFM)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子 5 (ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA (PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、 颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合，其中所述细胞是选自由神经元细胞及小胶质细胞组成的群组的至少一种细胞。
29.一种增加神经元神经突生长的方法，其通过在选自由以下组成的群组的至少一个存在下，培养所述神经元实现活化素A、血小板因子4(PF4)、修饰素、半乳糖凝集素3、生长分化因子15(GDFM)、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、膜型卷曲相关蛋白(MFRP)、胞间粘附分子 5 (ICAM5)、胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)、血小板源性生长因子-AA(PDGF-AA)、富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(SPARCL1)、血小板反应素-1、wnt-Ι诱导分泌蛋白1 (WISPl)、 颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合。
全文摘要
本发明提供一种预防和治疗神经疾病的药物组合物，其包含选自由以下组成的群组的至少一个间充质干细胞(MSC)、MSC培养液、活化素A、PF4、修饰素、半乳糖凝集素3、GDF15、磷脂酰基醇蛋白聚糖3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF-AA、SPARCL1、血小板反应素-1、WISP1、颗粒蛋白前体、IL-4、诱导其表达的因子及其任何组合；以及预防和治疗神经疾病的方法。
文档编号A61K35/44GK102281883SQ200980154402
公开日2011年12月14日 申请日期2009年11月16日 优先权日2008年11月14日
发明者吴元一, 梁允瑄, 蒋锺旭, 金珠渊 申请人:米迪波斯特股份有限公司