用于调节β-联蛋白的RNA拮抗剂化合物的制作方法

专利名称：用于调节β-联蛋白的RNA拮抗剂化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其靶向细胞中的β-联蛋白mRNA，导致β-联 蛋白的表达减少。联蛋白表达的减少有利于一系列医学疾病，如过度增生性疾病 (hyperproliferative disease)，包括癌症。本发明提供了包含寡聚物的治疗组合物和和 使用所述寡聚物调节β _联蛋白的表达的方法，包括治疗方法。
背景技术：
联蛋白(也称为钙黏着蛋白-相关蛋白和β-联蛋白)为联蛋白家族胞质蛋 白的成员，且为Wnt蛋白引发的信号传导通路的关键参与者，该Wnt蛋白为多个发展过程的 介体。联蛋白由于生长因子刺激经历磷酸化，导致细胞粘附的减少。已显示联蛋白在癌症发展中的作用通过APC(结肠腺瘤性息肉病)基因的表达产物而调节。该APC肿瘤抑制蛋白质与β-联蛋白结合，而β-联蛋白显示与Tcf和Lef 转录因子相互作用。Morin等人报道了 APC蛋白质下调(down-regulates)结肠癌中β-联 蛋白和Tcf-4介导的转录激活。其结果表明联蛋白的调节对APC的肿瘤抑制作用是关 键的，且该调节可伴随APC或联蛋白中的突变。多个研究报道了在多种癌细胞株中检 测联蛋白突变，且在黑素瘤细胞株中发现异常高的量的联蛋白。Morin等人显示影响磷酸化位点的β -联蛋白的突变使得细胞对APC-介导的 β _联蛋白的下调不敏感，且该破坏的机理对结肠直肠肿瘤发生是关键的(Morin等人， Science,1997，275，1787-1790)。Bennett等人的美国专利号6，066，500描述了调节β -联蛋白的表达的反义化合 物、组合物和方法。考虑到联蛋白在癌症发展中的效果，仍然需要能够有效抑制联蛋白功能 的药物。

发明内容
本发明提供长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包含总共为10-50个核碱基的连 续(contiguous)核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与编码哺乳动物β-联蛋白的核酸 的对应区至少80%同源。本发明提供长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包含总共为10-50个核碱基的连 续核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与选自SEQ ID NO 173和SEQ ID NOs 174-193的 核酸序列的对应区至少80%同源。本发明提供长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包含总共为10-50个核碱基的连 续核碱基序列，其中所述连续核碱基序列与选自SEQ ID No 1-132的核酸序列的对应区至 少80%同源。本发明进一步提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，如以下缀合物，其除了包 含寡聚物的核碱基序列外还包含至少一个共价连接至本发明的寡聚物的非核苷酸(即非核碱基)或非多核苷酸部分。该非核苷酸或非多核苷酸部分可由以下组成或包含以下固醇基团如胆固醇，或促进进入细胞的其它部分。本发明提供包含根据本发明的寡聚物的缀合物，如以下缀合物，其除了包含寡聚 物的核碱基序列外还包含含带正电部分的聚合缀合物，如聚乙二醇(PEG)-即根据本发明 的寡聚物可任选被聚乙二醇化。本发明提供药物组合物，其包含本发明的寡聚物或所限定的缀合物，和药学可接 受的稀释剂、载体、盐或佐剂。本发明进一步提供根据本发明的寡聚物，其用于医药。本发明进一步提供本发明的寡聚物在制备用于治疗本文涉及的一种或多种疾病 的药物中的用途，如选自以下的疾病过度增生性疾病如本文涉及的那些，如癌症。本发明进一步提供根据本发明的寡聚物，其用于治疗本文涉及的一种或多种疾 病，如癌症。本文还提供包含本发明的寡聚物或缀合物的药物和其它组合物。进一步提供了下 调细胞或组织内联蛋白的表达的方法，其包括使所述细胞或组织，体外或体内，与本发 明的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物接触。同样公开的为治疗疑似具有或易患有与联蛋白的表达或过度表达相关的疾 病或症状的动物或人的方法，该方法通过向所述动物或人给药治疗或预防有效量的本发明 的一种或多种寡聚物、缀合物或组合物。而且，本文提供了使用寡聚物抑制联蛋白的表达的方法，和治疗与联蛋白 的活性相关的疾病的方法。本发明提供治疗疾病或病症，如本文涉及的那些，如过度增生性疾病如癌症的方 法，所述方法包括向需要的患者给药本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物。本发明提供抑制或减少细胞或组织中联蛋白的表达的方法，该方法包括使所 述细胞或组织与本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物接触的步骤以使β “联蛋白的表达 被抑制或减少。本发明提供引起细胞(如癌细胞)凋亡的方法，所述方法包括使所述细胞或组织 与本发明的寡聚物、缀合物或药物组合物接触的步骤以使联蛋白的表达被抑制或减少 和/或引起凋亡。本发明进一步提供寡聚物，其包含以下连续核碱基序列或由以下连续核碱基序列 组成该连续核碱基序列与对应于选自SEQ ID NOs 1-132和SEQID NOs 174-193的序列 (如选自SEQ ID NO 189，192，58和103的序列)的区域至少80%同源。本发明进一步提供寡聚物，其包含以下连续核碱基序列或由以下连续核碱基序列 组成该连续核碱基序列对应于选自SEQ ID NO 174-193的序列(如SEQ ID NO 189或192) 中存在的等效序列。本发明进一步提供寡聚物，其包含以下序列或由以下序列组成选自SEQ ID NO 133-174的序列，如SEQ ID NO 168或171，或该寡聚物包含以下序列或由以下序列组成对 应于所述序列的连续核碱基序列。相关案件以下相关申请在此引入作为参考US 60/915, 371和US 61/023, 244。
附图简述

图1 分别对应于寡核苷酸序列 SEQ ID NOs :1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、 53、54、55、56、57、58、73、88、103和118的β -联蛋白靶序列用粗体和下划线表示，表明它们 在β-联蛋白转录产物中的位置(Genbank登记号NM_001904-SEQ ID N0:173)。图2 转染SW480细胞24小时后标准化为GAPDH的β -联蛋白表达。图3 通过蛋白质印迹测量用1和5ηΜ浓度的寡核苷酸转染的SW480细胞中β -联 蛋白蛋白质的含量。微管蛋白染色用作负载对照(loading control)且SEQ ID N0:194用 作乱序对照(scrambled control)寡核苷酸。图4 使用MTS测试在25nM浓度的寡核苷酸转染的HCTl 16细胞中测量细胞增殖， 其在转染后在不同时间点测量0D490。模拟品(mock)转染的细胞和用SEQ ID N0:194(乱 序对照)转染的细胞用作对照。图5 用3x25mg/kg寡核苷酸静脉内治疗后通过QPCR测量的相对于盐水治疗对照 的小鼠肝中β-联蛋白mRNA表达。β-联蛋白表达标准化为GAPDH且结果相对盐水治疗的 对照绘图。发明详述寡聚物本发明使用寡聚化合物(本文称为寡聚物)调节编码哺乳动物联蛋白的核酸 分子的功能，如SEQ ID NO 173中显示的β-联蛋白核酸，和天然存在的该编码哺乳动物 β-联蛋白的核酸分子的等位变体(allelic variants) 0本发明中的术语“寡聚物”是指共价连接两个或多个核碱基(即寡核苷酸)形成的 分子。在此，各个单一核碱基也可称为单体或单元。该寡聚物由以下序列组成或包含以下序 列长度为10-50个核碱基的连续核碱基序列。寡聚物可由以下组成天然核苷酸单元，例 如核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)，或核酸类似物，或其本文涉及的混合物，优选包 括锁核酸(LNA)。因此其包括由天然存在的核碱基、糖和核碱基间连接组成的寡聚物，还包 括具有非天然存在的核碱基的寡聚物，所述非天然存在的核碱基起类似作用或具有特别改 善的功能。完全或部分修饰的或取代的寡聚物通常优于天然形式，因为该寡聚物具有多种 需要的特性，如穿透细胞膜的能力、对细胞外和/或细胞内核酸酶良好的抵抗性和对核酸 靶的高亲和力和特异性。考虑到上述特性，例如，特别优选LNA类似物。因此，在一个特别优 选的实施方案中，根据本发明的寡聚物由核苷酸和核苷酸类似物单元(如LNA单元)构成， 或由不同类核苷酸类似物单元的构成，以形成10-50，优选10-25个核碱基，更优选10-16个 核碱基，且还更优选12-16个核碱基的寡核苷酸。在多种实施方案中，本发明的寡聚物不包含RNA(单元)。优选根据本发明的化合物为链状分子或合成为链状分子。该寡聚物为单链分子，且优选不包含例如，至少3，4或5 个连续核碱基的短区，该短区与相同寡聚物内的等效区(即双链体)互补-在这点上，该 寡聚物不为(实质上)双链的。在多个实施方案中，该寡聚物实质上不为双链的，如不为 siRNA。该寡聚物包含连续核碱基序列或由连续核碱基序列组成。在多个实施方案中，本发 明的寡聚物可整个由连续核碱基区组成。在多个实施方案中，寡聚物的核碱基序列由连续 核碱基序列组成。革巴
本文使用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物联蛋白多肽，如人联蛋白DNA，如SEQ ID NO 173。编码β -联蛋白的核酸或其天然存在的变体，和从其衍生的RNA核 酸，优选mRNA，如前mRNA，优选成熟mRNA。在多种实施方案中，例如当在研究或诊断中使用 时，“靶核酸”可为cDNA或从上述DNA或RNA核酸靶衍生的合成寡核苷酸。本发明的寡聚物 优选能与靶核酸杂交。在多种实施方案中，术语“靶核酸”可为例如，登记号为X89579，X89593，X89592， X89591, X89588, X89585, X89584和X89578的人基因外显子)，或哺乳动物β -联蛋白mRNA 如SEQ ID NO 173。其它哺乳动物β -联蛋白mRNA的实例包括，但不限于，以下登记号的 那些ΝΜ_001098209，ΝΜ_0010987210 (人 β -联蛋白 mRNA) ；NM_007614 (小鼠 β -联蛋白 mRNA) ；NM_053357(大鼠 β-联蛋白 mRNA) ；NM-001122762，DQ267491 (马 β-联蛋白 mRNA)； NM_214367 (猪 β -联蛋白 mRNA) ；BCl 19949，BT030683 (牛 β -联蛋白 mRNA)。当然应认识 到上述登记号是指cDNA序列而不是mRNA序列本身-当然成熟mRNA序列可直接从cDNA序 列衍生-胸腺嘧啶(T)残基被尿嘧啶(U)残基替换。如本文所述，“杂交”是指氢键合，其可为互补核苷酸/核碱基间的Watson-Crick， Hoogsteen，反向Hoogsteen氢键合等。在大约50年以前Watson和Crick显示脱氧核糖核 酸(DNA)由两个链组成，这两个链通过在两个链中相对的互补核碱基间形成的氢键而一起 保持为螺旋构型。在DNA中常见的4个核碱基为鸟嘌呤(G)，腺嘌呤(A)，胸腺嘧啶⑴和 胞嘧啶(C)，其中G核碱基与C配对，且A核碱基与T配对。在RNA中核碱基胸腺嘧啶被核 碱基尿嘧啶(U)代替，该核碱基尿嘧啶(U)类似于T核碱基与A成对。核碱基中参与标准 双链体形成的化学基团构成Watson-Crick面。Hoogsteen在几年后显示嘌呤核碱基(G和 A)除了它们的Watson-Crick面还具有可从双链体外辨别的Hoogsteen面，且用于通过氢键 合结合嘧啶寡核苷酸，从而形成三螺旋结构。尤其优选本发明的化合物能与靶核酸杂交，如mRNA。合适地，本发明的寡聚物或缀合物能抑制如下调联蛋白基因的表达。在多种 实施方案中，本发明的寡聚物与靶核酸结合，且相对正常表达水平抑制至少10 %或20 %的 表达，更优选相对正常表达水平至少30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 %，90 %或95 %抑制。 在一些实施方案中，当使用1至25ηΜ本发明的寡聚物或缀合物时观察到该调节。在相同或 不同实施方案中，表达的抑制少于100%，如少于98%抑制，少于95%抑制，少于90%抑制， 少于80%抑制，如少于70%抑制。表达水平的调节通过测定蛋白质水平而确定，例如通过 以下方法，如SDS-PAGE，然后使用针对靶蛋白质产生的合适抗体进行蛋白质印迹。或者表 达水平的调节，如抑制，可通过测量mRNA水平而确定，例如通过RNA印迹法或定量RT-PCR。 当使用合适剂量如1至25nM通过mRNA水平测量时，抑制或下调的水平在多种实施方案中 通常达到没有本发明的化合物时的正常水平的10-20%的水平。因此本发明提供下调或抑制β-联蛋白蛋白质和/或mRNA在表达β-联蛋白蛋 白质和/或mRNA的细胞中表达的方法，所述方法包括向所述细胞给药本发明的寡聚物或缀 合物以下调或抑制β-联蛋白蛋白质和/或mRNA在所述细胞中的表达。适合地该细胞为 哺乳动物细胞如人细胞。在多种实施方案中，给药可发生于体外。在多种实施方案中，给药 可发生于体内。本文使用的术语“靶核酸”是指编码哺乳动物联蛋白多肽，如人联蛋白的DNA，如SEQ ID NO :173。编码β -联蛋白的核酸或其天然存在的变体，和从其衍生的RNA核酸，优选mRNA，如前mRNA，优选成熟mRNA。在多种实施方案中，例如当在研究或诊断中使用 时，“靶核酸”可为cDNA或从上述DNA或RNA核酸靶衍生的合成寡核苷酸。根据本发明的寡 聚物优选能与靶核酸杂交。术语“其天然存在的变体”是指β -联蛋白多肽或核酸序列的变体，其天然存在于 限定的分类群中，如哺乳动物，如小鼠、猴，且优选人。通常，当涉及多核苷酸的“天然存在的 变体”时，该术语还可包括任何编码β "联蛋白的基因组DNA (其通过染色体易位或复制存 在于染色体Chr 3 41. 22-41. 26Mb)和RNA (如其衍生的mRNA)的等位变体。当涉及具体多 肽序列时，例如，该术语还包括天然存在形式的蛋白质，因此其可进行加工，例如通过共翻 译_或翻译后修饰，如信号肽裂解、蛋白酶剪切、糖基化等。术语〃至少一个(种)"包括大于或等于1的整数，如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10， 11，12，13，14，15，16，17，18，19，20 等。在多种实施方案中，如当涉及本发明化合物的核酸或蛋白质靶时，术语"至少一 个(种)〃包括术语"至少两个(种)"和"至少三个(种)"和"至少四个(种)"，类 似的术语"至少两个(种)“可包括术语"至少三个(种)“和“至少四个(种)〃。序列本发明的寡聚物可靶向人β -联蛋白mRNA，因此它们包含以下序列或由以下序列 组成对应于SEQ ID NO 173中存在的核苷酸序列的连续核碱基序列，或选自SEQ ID NOS 1-132的序列，其中所述寡聚物(或其连续核碱基部分)可任选包含1个、2个或3个相对于 所述选择的序列的错配。在多种实施方案中，该寡核苷酸序列包含以下序列或由以下序列 组成10-16个(连续)核碱基的序列。包含16个核碱基的寡核苷酸序列的实例示于SEQ IDNOS :1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118。较短的序 列可从它们衍生。较长的序列可包括所有、或至少10个源自各SEQ ID NO的核碱基。
本发明进一步提供β-联蛋白基因中的靶序列，特别是对应于(即它们的反向补 体(reverse complement)) SEQ ID NOs 1-132的那些，其中对应于所述靶序列的反义寡核 苷酸(寡聚物)能下调β-联蛋白。例如，分别对应于反义寡核苷酸序列SEQ ID NOs :1、16、 17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103和 118 的靶序列示于图 1 (粗体 且有下划线，且对应上述寡SEQ ID NOs)。本发明的寡聚物可适当地包含以下序列或由以下组成或衍生自以下序列(如包 含所述SEQ ID中的对应的连续核碱基序列)，选自SEQ ID NOS 174-193的序列。优选地， 该序列包括10-16个核碱基的序列。包含16个核碱基的序列的实例示于选自SEQ ID NOS 1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118 的 SEQ ID。因此 具有较少核碱基(如10，11，12，13，14或15个)的序列可具有以下连续核碱基序列，其对 应于子序列，例如至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14或15个SEQ ID NOS :1、16、17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118 中的连续核 碱基。因此，较短的序列可从它们衍生。较长的序列可包括所有、或至少10个源自示例的SEQ ID NOs的核碱基。通常如果仅有部分寡核苷酸的序列存在于选自SEQ ID NOS 1,16, 17，18，33，34，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，73，88，103 和 118 的 SEQ ID 中，则剩余部 分的寡核苷酸序列与位于所述SEQ ID侧翼的对应核苷酸同源。两个感兴趣的序列基序为 SEQ ID NO 58 和 SEQ IDNO 103。还公开了本发明的寡聚物的具体设计，例如示于SEQ ID NOS 133-152的那些，特 别是 SEQ ID NOs :133，134，135，136，138，141，148，149，150，151 和 152。还公开了 LNA 寡核 苷酸的具体设计，例如示于SEQ ID NOS :153-172的那些，特别是SEQ ID NOS 153，154，155， 156，158，161，168，169，170，171和172。在优选实施方案中，认为本发明的寡聚物为β-联 蛋白mRNA和蛋白质表达的有效抑制剂。在某些实施方案中，该寡聚物可包含以下连续核碱基序列或由以下连续核碱基序 列组成该连续核碱基序列与编码哺乳动物联蛋白的核酸的等效区完全互补(完美互 补)。然而，在一些实施方案中，当寡聚物与靶序列杂交至且还足以与靶结合以显示所 需作用(即下调靶)时，该寡聚物可包括1，2，3，或4(或更多)个错配。错配可通过，例如， 增加寡聚物核碱基序列的长度和/或增加核碱基序列中存在的核苷酸类似物(如LNA)的 数量而补偿。在多种实施方案中，该连续核碱基序列包含不超过3个，例如不超过2个相对于靶 序列的错配，如相对于编码哺乳动物β “联蛋白的核酸的对应区的错配。在多种实施方案中，该连续核碱基序列包含不超过1个相对于靶序列(如编码哺 乳动物β-联蛋白的核酸的对应区)的错配。本发明的寡聚物的核碱基序列或该连续核碱基序列优选与选自SEQ IDNOS :1_132 的对应序列至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，同源，如100%同源(相同)。本发明的寡聚物的核碱基序列或该连续核碱基序列优选与SEQ ID Ν0:173中存在 的对应序列至少80%同源，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，同源，如100%同源(相同)。本发明的寡聚物的核碱基序列或该连续核碱基序列优选与SEQ ID Ν0:173中存 在的子序列至少80%互补，如至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94 %，至少95 %，至少96 %互补，至少97 %，至少98 %，至少99 %，如100 %互补(完美互 补)。在多种实施方案中，该寡聚物(或其连续核碱基部分)选自，或包含，选自SEQ ID NOS :1-132或SEQ ID NOS 174-193的序列之一，或其至少10个连续核碱基的子序列，其中 所述寡聚物(或其连续核碱基部分)可任选包含1个、2个或3个相对于所述选择的序列的 错配。在多种实施方案中，该子序列可由11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28或29个连续核碱基组成，如10-15，12-25，12-22，如12-18个核碱基。合 适地，在多种实施方案中，该子序列的长度与本发明寡聚物的连续核碱基序列的长度相同。然而，认识到在多种实施方案中寡聚物的核碱基序列可包含附加的5’或3’核碱 基，如，独立地，1，2，3，4或5个附加的核碱基5’和/或3’，它们不与靶序列互补。多种实施方案中，在这方面，本发明的寡聚物在可包含在5’和或3’侧翼有附加的核碱基的连续核 碱基序列。在多种实施方案中，连续核碱基序列的3’端的侧翼为1，2或3个DNA或RNA单 元。在固态合成寡聚物过程中经常使用3’DNA单元。在多种实施方案中，其可相同或不同， 连续核碱基序列的5’端的侧翼为1，2或3个DNA或RNA单元。在多种实施方案中，附加的 5’或3’核碱基为天然存在的核苷酸，如DNA或RNA。在多种实施方案中，附加的5’或3’ 核碱基可表示本文的缺口聚物(gapmer)寡聚物涉及的D区。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO 1的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO 16的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO: 17的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO 18的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :33的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :34的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :49的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :50的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO 51的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :52的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :53的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :54的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :55的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :56的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :57的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :58的核碱基序列或其子序列。 在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据SEQ ID NO :73的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO :88的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO 103的核碱基序列或其子序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由以下序列组成或包含以下序列根据 SEQ ID NO 118的核碱基序列或其子序列。当确定本发明的寡聚物(或连续核碱基序列)和编码哺乳动物β _联蛋白(如本 文公开的那些)的核酸之间的“同源性”或“互补性”时，同源性可用本发明化合物的对应核 碱基序列和编码哺乳动物联蛋白的核酸(或靶核酸)的对应区或其补体通过简单比对 (alignment)而确定，且同源性通过计数对齐(align)的碱基数并除以本发明的化合物(寡 聚物)中的连续核碱基的总数，再乘以100而确定。在该比较中，如果存在缺口(gaps)，优 选该缺口仅为错配而不是下述区域，其中缺口内核碱基数在本发明的核碱基序列和靶核酸 之间不同。氨基酸和多核苷酸同源性可使用ClustalW算法使用标准设置确定参见httD:// www, ebi. ac. uk/emboss/aliRn/index, html, Tffe EMBOSS /jC (局部)Gap Open(缺口 产生)=10.0，Gap extend(缺口延伸)=0· 5，使用Blosum 62 (蛋白质)，或用于核苷酸 /核碱基序列的DNAful 1。该比对也可用于从人和不同哺乳动物种类(如猴、小鼠和/或大 鼠)识别编码联蛋白的核酸的区，在该区有足够的长度核酸互补性，以允许设计靶向人 β-联蛋白靶核酸和不同哺乳动物种类中存在的对应核酸的寡核苷酸，如由以下区域组成 或包含以下区的寡聚物至少10，如至少12，如至少14，如至少16，如至少18，如11，12，13， 14，15，16，17或18个连续核碱基的区域，该连续核碱基与编码人β _联蛋白的核酸和编码 不同哺乳动物种类联蛋白的核酸的等效区100%互补。在多种实施方案中，本发明的寡聚物包含以下连续核碱基序列或由以下连续核 碱基序列组成该连续核碱基序列与编码人联蛋白的核酸和编码不同哺乳动物种类 β-联蛋白的核酸(如编码小鼠β-联蛋白的核酸)的对应区至少80%，如至少85%，如 至少90%，如至少95%，如至少98%，如至少99%，或100%同源-(即与人和小鼠序列的 等效区80% -100%互补)。优选寡聚物的连续核碱基序列与人β _联蛋白mRNA的等效区 100%互补。术语"对应于"和"相应于"是指寡聚物的核碱基序列或连续核碱基序列与等 效核苷酸序列的比较，该等效核苷酸序列为i)核酸靶的反向补体，如编码β-联蛋白蛋白 质的mRNA，如SEQ ID NO 173，和/或ii)本文提供的核苷酸的序列，如选自SEQ ID NOS 1-132或SEQ ID Nos 174-193。核苷酸类似物直接与它们的等效或对应核苷酸比较。术语"对应核苷酸类似物"和"对应核苷酸"是指核苷酸类似物和天然存在的核苷酸中的核碱基是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元连接至腺嘌呤时，该"对 应核苷酸类似物"包含连接至腺嘌呤的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。长度该寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总共为10-50个核碱基，如10，11，12， 13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29 或 30 个连续核碱基长度的连续核碱基序列。在多种实施方案中，该寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总共为10-25，10-24，12-25，12-24，或 10-22，如 12-18，如 13-17 或 12-16，如 13，14，15，16 个连续核碱基 长度的连续核碱基序列。在多种实施方案中，该寡聚物包含以下序列或由以下序列组成总共为10，11， 12，13，或14个连续核碱基长度的连续核碱基序列。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物由不超过22个核碱基组成，如不超过20 个核碱基，如不超过18个核碱基，如15，16或17个核碱基。在多种实施方案中，本发明的寡聚物包含少于20个核碱基。核苷酸和核苷酸类似物本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分、碱基部分和共价连接的磷酸基的糖苷，且包括天然存在的核苷酸，如DNA或RNA，优选DNA。包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸在此称为“核苷酸类似物”。术语“核碱基”用于包括天然(DNA-或 RNA-型)核苷酸以及核苷酸类似物。非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，如双环核苷酸或2’修饰的 核苷酸，如2’取代的核苷酸。“核苷酸类似物”为通过在糖和/或碱基部分修饰而得到的天然核苷酸，如DNA或 RNA核苷酸的变体。在寡核苷酸的情况下类似物可以原则上仅仅“沉默(silent)”或“等效 (equivalent)，，于天然核苷酸，即对于寡核苷酸抑制靶基因表达的作用方式没有功能上的 影响。如果例如，它们更容易制备或制备更廉价，或对储存或制备条件更稳定，或表示标签 或标记，这种“等效”类似物还是可以使用的。然而，优选地，该类似物将对寡聚物抑制表达 的作用方式有功能上的影响；例如通过产生增加的对靶的结合亲和力和/或增加的对细胞 内核酸酶的抗性和/或更方便性地转运至细胞。术语“核碱基”是用作集合术语，其包括核苷酸和核苷酸类似物两者。核碱基序列 是包括至少两个核苷酸或核苷酸类似物的序列。在多种实施方案中，该核碱基序列可仅包 括核苷酸，如DNA单元，在另一实施方案中，该核碱基序列可仅包括核苷酸类似物，如LNA单 元，或在多种实施方案中，该核碱基序列可包含核苷酸和核苷酸类似物单元两者。术语"核酸"定义为通过共价连接两个或更多个核苷酸形成的分子。本文中术语"核酸"和"多核苷酸"可互换使用。核碱基的“碱基部分”包括天然存在的以及非天然存在的核碱基的碱基。因此，该 碱基部分不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而且还包括杂环类似物及其互变异构体。该碱基部分的实例包括，但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷嘧啶、尿 嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、5-甲基胞嘧啶、异胞嘧啶(isocytosine)、假异胞嘧啶 (pseudoisocytosine)、5_溴尿嘧啶、5_丙炔基尿嘧啶、6_氨基嘌呤、2_氨基嘌呤、肌苷、二 氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在多种实施方案中，寡聚物中存在的至少一个核碱基包括修饰的碱基，如选自 5_甲基胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、6-氨基嘌呤、2-氨基 嘌呤、肌苷、二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。核苷/核苷酸类似物的具体实例描述于例如Freier & Altmann ；Nucl. AcidRes.，1997，25，4429-4443 禾口 Uhlmann ;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2), 293-213，和示例 1
示例 1因此该寡聚物可包含以下序列或由以下序列组成天然存在的核苷酸的简单序 列-优选2’ -脱氧核苷酸(在此通常称为“DNA”)，但也可能为核糖核苷酸(在此通常称 为“RNA”)，或该天然存在的核苷酸和一种或多种非天然存在的核苷酸，即核苷酸类似物的 组合。该核苷酸类似物可适当地增强寡聚物对靶序列的亲和力。合适和优选的核苷酸类似物的实例描述于W02007/031091，在此引入作为参考，或 在其中参考。核苷酸的一个优选修饰包括其中糖部分被修饰以提供2’-取代基或产生桥接 的(锁核酸-LNA)结构的核苷酸，该桥接的(锁核酸-LNA)结构增强结合亲和力且很可能还 提供一些增加的核酸酶抗性；将核苷酸间连接从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶侵袭更有 抗性的那些，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯-这两个可被RNase H裂解，也产生调节β -联蛋 白表达中反义抑制的途径。在寡聚物中掺入增强亲和力的核苷酸类似物，如LNA或2’ -取代的糖，可使得特异结合的寡聚物的尺寸减小，也可在非特异或异常结合发生前将上限减 小至寡聚物的尺寸。在多种实施方案中，该寡聚物包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，该寡聚物包含3-8个核苷酸类似物，例如6或7个核苷酸类似物。在一些优选的实施方案中， 所述核苷酸类似物的至少一个为锁核酸(LNA)；例如至少3或至少4，或至少5，或至少6，或 至少7，或8个核苷酸类似物可为LNA。在一些实施方案中所有核苷酸类似物可为LNA。应认识到当涉及优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列(其仅由核苷酸组成)时， 由该序列限定的本发明的寡聚物可包含对应的核苷酸类似物代替一个或多个所述序列中 存在的核苷酸，如LNA单元或其它核苷酸类似物，其增加寡聚物/靶双链体的双链体稳定性 /Tffl (即增强亲和力的核苷酸类似物)。在多种实施方案中，寡聚物的核苷酸序列和靶序列之间的任何错配优选在增强亲 和力的核苷酸类似物(例如A和C区)之外的区域，如在本文所述的B区内，和/或在本文 所述的D区内，和/或在非修饰的位点如寡核苷酸中的DNA核苷酸，和/或在相对连续核碱 基序列的5’或3’的区。核苷酸的这些修饰的实例包括修饰糖部分以提供2’_取代基或产生桥接的(锁核 酸)结构，其增强结合亲和力且也可提供增加的核酸酶抗性。优选的核苷酸类似物为LNA，如氧基-LNA(如β-D-氧基-LNA，和α-L-氧 基-LNA)，和/或氨基_LNA(如β -D-氨基-LNA和α -L-氨基-LNA)和/或硫基 (thio)-LNA (如 β -D-硫基-LNA 和 α -L-硫基-LNA)和 / 或 ENA (如 β -D-ENA 和 α -L-ENA)。 在多种实施方案中，该LNA单元为0-0-氧基-1^·。在一些实施方案中，本发明的寡聚物中存在的核苷酸类似物(如在本文提及的A 和C区中)独立地选自，例如2，-0-烷基-RNA单元，2，-氨基-DNA单元，2，-氟-DNA单元， LNA 单元，阿糖核酸(ANA)单元，2，-氟-ANA 单元，HNA 单元，INA (intercalating nucleic acid-Christensen, 2002. Nucl. Acids. Res. 2002 30 :4918_4925，在此引入作为参考)单元 和2’ MOE单元。在多种实施方案中，仅有一个上述类型的核苷酸类似物存在于本发明的寡 聚物或其连续核碱基序列中。在多种实施方案中，该核苷酸类似物为2’ -0-甲氧基乙基_RNA(2’ Μ0Ε)， 2’ -氟-DNA单体或LNA核苷酸类似物，因此本发明的寡核苷酸可包括独立地选自这三种 类型类似物的核苷酸类似物，或可包括选自这三种类型类似物中的仅一种类型。在多种 实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2，-MOE-RNAjB 2，3，4，5，6，7，8，9或10个 2’-MOE-RNA核苷酸单元。在多种实施方案中，所述核苷酸类似物的至少一种为2’-氟DNA， 如2，3，4，5，6，7，8，9或10个2，-氟-DNA核苷酸单元。在多种实施方案中，根据本发明的寡聚物包含至少一个锁核酸(LNA)单元，如1， 2，3，4，5，6，7，或8个LNA单元，如3_7或4至8个LNA单元，或3，4，5，6或7个LNA单元。在 多种实施方案中，所有核苷酸类似物为LNA。在一些实施方案中，该寡聚物可包含β-D-氧 基-LNA和一种或多种以下LNA单元β -D或α -L构型的硫基-LNA、氨基-LNA、氧基-LNA、 和/或ENA或其组合。在多种实施方案中，所有LNA胞嘧啶单元为5’甲基-胞嘧啶。在本 发明多种实施方案中，该寡聚物可包含LNA和DNA单元。优选LNA和DNA单元的组合总共 为10-25，优选10-20，甚至更优选12-16。在本发明多种实施方案中，寡聚物的核碱基序列，如连续核碱基序列由至少一个LNA组成，且剩余核苷酸单元为DNA单元。在多种实施方案 中，该寡聚物仅包含LNA核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(如RNA或DNA，最优选DNA核 苷酸)，任选具有修饰的连接基如硫代磷酸酯(phosphorothioate)。在多种实施方案中，寡聚物中存在的至少一个核碱基具有选自以下的修饰的碱 基5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤， 2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。 LNA术语“LNA”是指双环核苷酸类似物，称为“锁核酸(Locked Nucleicacid) ”。其可 表示LNA单体，或当在“LNA寡核苷酸”或LNA “寡聚物”的环境中使用时是指包含一种或多 种该双环核苷酸类似物的寡聚物。本发明的寡聚物中使用的LNA优选具有通式I的结构，及其碱盐(basicsalts)和
酸加成盐 其中X 选自-0-、-S-、-N(Rn*) _、-C (R6R6*)-；B选自氢、任选取代的Cy-烷氧基、任选取代的CV4-烷基、任选取代的Cy-酰基 氧基、核碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基(import groups) 和配体；P表示与在后的单体之间的核苷酸间连接(internucleotide linkage)的基团位 置，或5'-末端基团，该核苷酸间连接或5'-末端基团任选包括取代基R5或等同适用取 代基R5、P*表示与在前的单体的核苷酸间连接，或3'-末端基团；R4*和R2* —起表示由1-4个选自下列的基团/原子组成的二价基团 (biradical) -C (RaRb)-、-C (Ra) = C (Rb)-、-C (Ra) = N-、-0-、-Si (Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-禾口> C = Z，其中Z选自-0-、-S-和-N (Ra) _，且Ra和Rb各自独立地选自氢、任选取代的CV12-烷基、任选取代的C2_12_烯基、任选取代的C2_12_炔基、羟基、C1^12-烷 氧基、C2_12-烷氧基烷基、c2_12-烯基氧基、羧基、C1^12-烷氧基羰基、C1^12-烷基羰基、甲酰基、 芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳 基羰基、氨基、单和二(Cu-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二沁_6-烷基)-氨基-羰基、氨 基-Ch6-烷基-氨基羰基、单和二(Cu-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、Ch6-烷基-羰 基氨基、脲基、CV6-烷酰基氧基、磺基(sulphono)、(^_6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基 (SUlphanyH6-烷基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道 基和配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的(geminal)取代基Ra和Rb一起可表示任选取代的亚甲基(=CH2)，和存在的取代基R1*、R2、R3、R5、R5*, R6和Rw各自独立地选自氢、任选取代的C^12-烷 基、任选取代的C2_12-烯基、任选取代的c2_12-炔基、羟基、CV12-烷氧基、c2_12-烷氧基烷基、 c2_12-烯基氧基、羧基、CV12-烷氧基羰基、CV12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二 ((V6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二((V6-烷基)-氨基-羰基、氨基-Cu-烷基-氨基 羰基、单和二(Cp6-烷基)氨基-CV6-烷基-氨基羰基、(V6-烷基-羰基氨基、脲基、Cp6-烷 酰基氧基、磺基、CV6-烷基磺酰基氧基、硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、Cp6-烷基硫基、 卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学活性基、螯合基、报道基和配体、其中芳基和杂芳 基可任选被取代，且其中两个成对的取代基一起可表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚 甲基，或一起可形成由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺环二价基团，所述亚烷基链任选插 入一个或多个杂原子/基团和/或被一个或多个杂原子/基团终止，所述杂原子/基团选 自-0-、-S-和-(NRn)-，其中Rn选自氢和Cy-烷基，且其中两个相邻的(非成对的)取代 基可表示另一键，导致形成双键；且Rw，当存在且不涉及二价基团时，选自氢和CV4-烷基；在多种实施方案中，R5*选自 H，-CH3, -CH2-CH3, -CH2-O-CH3 和 _CH = CH2。在多种实施方案中，R4*和R2*—起表示二价基团，其选自-C(RaRb)-0-、-C(RaRb)-C (RcRd) -0-、-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) _0_、-C (RaRb) -O-C (RcRd) -、-C (RaRb) -O-C (RcRd) _0_、-C (RaR b) -C (RcRd) -、-C (RaRb) -C (RcRd) -C (ReRf) -、-C (Ra) = C (Rb) -C (RcRd) -、-C (RaRb) -N (Rc) -、-C (RaR b) -C (RcRd) -N (Re) -、-C (RaRb) -N (Rc) -0-和-C (RaRb) -S-、-C (RaRb) -C (RcRd) _S_，其中 Ra、Rb、Rc、 Rd、Re和Rf各自独立地选自氢、任选取代的Ch2-烷基、任选取代的C2_12-烯基、任选取代 的C2_12-炔基、羟基、C1^12-烷氧基、C2_12-烷氧基烷基、C2_12-烯基氧基、羧基、C1^12-烷氧基羰 基、Ch2-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳基氧基-羰基、芳基氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳基氧 基-羰基、杂芳基氧基、杂芳基羰基、氨基、单和二((V6-烷基)氨基、氨基甲酰基、单和二 ((V6-烷基)_氨基-羰基、氨基-Ch-烷基-氨基羰基、单和二沁_6-烷基)氨基-Cu-烷 基_氨基羰基、C1^6-烷基-羰基氨基、脲基、C1^6-烷酰基氧基、磺基、CV6-烷基磺酰基氧基、 硝基、叠氮基、硫基(sulphanyl)、C^6-烷基硫基、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基、热化学 活性基、螯合基、报道基和配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代，且其中两个成对的取代 基Ra和Rb —起可表示任选取代的亚甲基(=CH2)，在另一实施方案中R4*和R2*—起表示二价基团，其选自-CH2-0-、-CH2-S-、-CH2-NH -、-CH2-N (CH3) _、-CH2-CH2-0-、-CH2-CH (CH3) -、-CH2-CH2-S-、-CH2-CH2-NH-、-CH2-CH2-CH2-、-CH2-C H2-CH2-O-、-CH2-CH2-CH (CH3) -,-CH = CH-CH2-, -CH2-O-CH2-O-, -CH2-NH-O-, -CH2-N (CH3) -0-、 -CH2-O-CH2-、-CH (CH3) -0-、-CH (CH2-O-CH3) -0-。对于所有手性中心，不对称的基团可为R或S取向。优选地，本发明的寡聚物中使用的LNA包括至少一个根据任一下式的LNA单元 其中Y为-0-、-O-CH2-, -S-、-NH-或N(Rh) ；Z和t独立地选自核苷酸间连接、末 端基团或保护基；B构成天然或非天然核苷酸碱基部分，且Rh选自氢和Cy-烷基。特别优选的LNA单元示于示例2 示例 2术语〃硫基-LNA〃包括其中上述通式中的Y选自S或-CH2-S-的锁核碱基(locked nucleobase) (LNA)。硫基-LNA 可为 β -D 和 α -L-构型。术语〃氨基-LNA 〃包括其中上述通式中的Y选自-N(H)-、N(R)-, CH2-N(H)-和-CH2-N(R)-,其中R选自氢和C^4-烷基的锁核碱基(LNA)。氨基-LNA可为β -D 和α-L-构型。术语〃氧基-LNA 〃包括其中上述通式中的Y表示-0-或-CH2-O-的锁核碱基 (LNA)。氧基-LNA可为β -D和α -L-构型。术语〃 ΕΝΑ"包括其中上述通式中的Y为-CH2-0-(其中-CH2-O-的氧原子连接至 相对碱基B的2’ -位)的锁核碱基(LNA)。在优选实施方案中LNA选自β -D-氧基-LNA、α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和β -D-硫基-LNA，特别是β -D-氧基-LNA。在本文中，术语"Cy-烷基"是指直链或支链的饱和烃链，其中该链具有1至4个 碳原子，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。RNAse H 募集
应认识到寡聚化合物可通过非RNase介导的靶mRNA的降解起作用，如通过翻译的 位阻，或其它方法，然而，本发明优选的寡聚物能募集核糖核酸内切酶(RNase) ^RNase H。
在多种实施方案中，该寡聚物或连续核碱基序列，包含至少6个，如至少7个连续 核苷酸或核碱基单元，如至少8或至少9个相连核碱基单元(残基)，包括7，8，9，10，11， 12，13，14，15或16个连续核苷酸或核碱基的区域，当其与互补靶RNA形成双链体时能募集 RNase。能募集RNAse的连续序列可为本文所述的缺口聚物(gapmer)涉及的B区。在多种 实施方案中，能募集RNAse的连续序列(如B区)的尺寸可更大，如10，11，12，13，14，15， 16，17，18，19或20个核碱基单元。EP 1 222 309提供了体外测定RNaseH活性的方法，其可用于测定募集RNaseH的 能力。使用EP 1 222 309的实施例91-95提供的方法，如果当提供互补RNA靶时，具有的 初始速率(以pmol/1/min测量)，为等效DNA(equivalent DNA)的至少1 %，如至少5%，如 至少10%或少于20%，该等效DNA仅为寡核苷酸，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核 苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物能募集RNase H。在多种实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91_95提供的方法，如果当提供 互补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/1/min测量)，少于使用等效DNA测 定的初始速率的1 %，如少于5%，如少于10%或少于20%，该等效DNA仅为寡核苷酸，没有 2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物基本不 能募集RNase H。在其它实施方案中，使用EP 1 222 309的实施例91_95提供的方法，如果当提供 互补RNA靶和RNaseH时，该RNaseH初始速率(以pmol/1/min测量)，为使用等效DNA测定 的初始速率的至少20 %，如至少40 %，如至少60 %，如至少80 %，该等效DNA仅为寡核苷酸 (即具有相同的碱基序列，但仅含有DNA单元)，没有2’取代，且在寡核苷酸中的所有核苷 酸间具有硫代磷酸酯连接基，则认为该寡聚物能募集RNase H。通常，形成连续核碱基序列的寡聚物的区域，当与互补靶RNA形成双链体时，能募 集由核苷酸单元(其与RNA靶形成DNA/RNA状的双链体)组成的RNase-且可包括α -L构 型的DNA单元和LNA单元，特别优选为α -L-氧基LNA。本发明的寡聚物可包含核碱基序列，其包括核苷酸和核苷酸类似物，且可为缺口 聚物(gapmer)、头聚物(headmer)或混合聚物(mixmer)的形式。头聚物如下定义在5’ -端的连续的一段非_募集RNase的核苷酸类似物，接着 直到3’ -端的连续的一段可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸(类似物)单元 (如至少7个该核苷酸)，而尾聚物(tailmer)如下定义在5’-端的连续的一段可由RNAse 识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸(类似物)(如至少7个该核苷酸)，接着直到3’-端的 连续的一段非-募集RNase的核苷酸类似物。其它根据本发明的“嵌合”寡聚物，称为“混 合聚物”，其由下述交替组分构成i)可由RNAse识别和裂解的DNA或修饰的核苷酸，和ii) 非-募集RNase的核苷酸类似物。一些核苷酸类似物也能介导RNase (如RNaseH)，结合和 裂解。因为α -L-LNA募集RNase活性到一定程度，可能需要可由RNAse识别和裂解的DNA 或修饰的核苷酸的较小区域(例如缺口-或B区)用于缺口聚物构建体，且混合聚物构建 中会引入更多的柔性。缺口聚物设计
优选地，本发明的寡聚物是缺口聚物。缺口聚物寡聚物是包含一段连续的核苷酸 或核碱基的寡聚物(该核苷酸或核碱基能募集RNAse，如RNAseH)，如至少6或7个DNA核 苷酸的区域，在本文涉及的为B区，其中B区的5’和3’的侧翼均为核苷酸类似物的区域， 如增强亲和力的核苷酸类似物，如1-6个核苷酸类似物，5’和3’连接至一段连续的能募集 RNAse的核苷酸-涉及的这些区分别称为A区和C区。优选该缺口聚物包含下式的(聚)核苷酸序列(5’至3’)A-B_C，或任选A-B-C-D 或D-A-B-C，其中；A区(5’区)由以下组成或包含以下至少一个核苷酸类似物，如至少一 个LNA单元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；B区由以下组成或包含以下至少5 个能募集RNAse (当与互补RNA分子，如mRNA靶形成双链体时)的连续核苷酸或核碱基，如 DNA核苷酸，和；C区(3’区)由以下组成或包含以下至少一个核苷酸类似物，如至少一个 LNA单元，如1-6个核苷酸类似物，如LNA单元，和；D区，当存在时由以下组成或包含以下 1，2或3个核苷酸单元，如DNA核苷酸。在多种实施方案中，A区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成， 如2-5个核苷酸类似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单 元；和/或C区由1，2，3，4，5或6个核苷酸类似物(如LNA单元)组成，如2_5个核苷酸类 似物，如2-5个LNA单元，如3或4个核苷酸类似物，如3或4个LNA单元。在多种实施方案中，B由以下组成或包含以下5，6，7，8，9，10，11或12个能募集 RNAse的连续核苷酸或核碱基，或6-10，或7_9，如8个能募集RNAse的连续核苷酸或核碱 基。在多种实施方案中，B区由以下组成或包含以下至少一个DNA核苷酸单元，如1-12个 DNA单元，优选4-12个DNA单元，更优选6_10个DNA单元，如7_10个DNA单元，最优选8，9 或10个DNA单元。在多种实施方案中，A区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成，B区由7，8， 9或10个DNA单元组成，且C区由3或4个核苷酸类似物(如LNA)组成。这些设计包括 (A-B-C)3-10-3，3-10-4，4-10-3，3—9—3，3—9—4，4—9—3，3—8—3，3—8—4，4—8—3，3—7—3，3—7—4， 4-7-3，且可进一步包括D区，其可具有1个或2个核苷酸单元，如DNA单元。其它缺口聚物设计公开于W02004/046160且在此引入作为参考。美国临时申请，60/977409，在此引入作为参考，涉及‘短聚物(shortmer)，缺口聚物寡聚物，在多种实施方案中，其可为本发明的缺口聚物寡聚物。在多种实施方案中，该寡聚物由总共10，11，12，13或14个核碱基单元的连续核碱 基序列组成，其中该连续核碱基序列为式(5’ -3’)，A-B-C，或任选A-B-C-D或D-A-B-C，其 中；A由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成；B由7，8或9个连续核苷酸或 核碱基单元组成，当与互补RNA分子(如mRNA靶)形成双链体时，所述核苷酸或核碱基单 元能募集RNAse;且C由1，2或3个核苷酸类似物单元(如LNA单元)组成。当存在时，D 由单一 DNA单元组成。在多种实施方案中，A由1个LNA单元组成。在多种实施方案中，A由2个LNA单 元组成。在多种实施方案中，A由3个LNA单元组成。在多种实施方案中，C由1个LNA单 元组成。在多种实施方案中，C由2个LNA单元组成。在多种实施方案中，C由3个LNA单 元组成。在多种实施方案中，B由7个核苷酸单元组成。在多种实施方案中，B由8个核 苷酸单元组成。在多种实施方案中，B由9个核苷酸单元组成。在多种实施方案中，B包含1-9个DNA单元，如2，3，4，5，6，7或8个DNA单元。在多种实施方案中，B由DNA单元组 成。在多种实施方案中，B包含至少一个α-L构型的L NA单元，如2，3，4，5，6，7，8或9个 α-L-构型的LNA单元。在多种实施方案中，B包含至少一个α-L-氧基LNA单元或其中所 有α -L-构型的LNA单元为α -L-氧基LNA单元。在多种实施方案中，A-B-C中存在的核 苷酸数选自(核苷酸类似物单元-B区-核苷酸类似物单元)1-8-1，1-8-2，2-8-1，2-8-2， 3-8-3，2-8-3，3-8-2，4-8-1，4-8-2，1-8-4，2-8-4，或；1-9-1，1-9-2，2-9-1，2-9-2，2-9-3， 3-9-2，1-9-3，3-9-1，4-9-1，1—9—4，或；1-10-1,1_10_2，2-10—1，2-10—2，1-10-3,3-10-1。 在多种实施方案中，A-B-C中的核苷酸数选自2-7-1，1-7-2，2-7-2，3-7-3，2-7-3，3-7-2， 3-7-4和4-7-3。在多种实施方案中，A和C各自都由两个LNA单元组成，且B由8或9个 核苷酸单元，优选DNA单元组成。
其它缺口聚物设计包括以下那些其中A区和或C区由3，4，5或6个核苷酸类似 物组成，如选自2’-0-甲氧基乙基-RNA(2’ Μ0Ε)和2’ -氟-DNA单体的核苷酸类似物，且B 区由8，9，10，11或12个核苷酸，如DNA单元(或核碱基)组成，如5_10_5和4_12_4缺口 聚物设计。其它缺口聚物设计公开于WO 2007/146511Α2，在此引入作为参考。连接基术语〃连接基〃或“核苷酸间连接(internucleotide linkage) ”是指能将两个核 苷酸或核碱基、两个核苷酸类似物、以及核苷酸和核苷酸类似物等共价结合在一起的基团。 具体且优选的实例包括磷酸基(phosphate group)和硫代磷酸酯基(phosphorothioate)。本发明的寡聚物或其连续核碱基序列的核碱基通过连接基结合在一起。合适地， 各核碱基通过连接基连接至3’邻近(adjacent)的核碱基。合适的连接基包括列于W02007/031091的那些，例如列于W02007/031091的第34
页第一段的连接基(在此引入作为参考)。也就是说，在多种实施方案中，优选将连接基从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶 攻击更有抗性的基团，如硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate)-这两个可被RNase H裂解，也产生在减少靶基因的表达中反义抑制的途径。本文提供的合适的含硫(S)连接基可为优选的。硫代磷酸酯连接基也是优选的， 尤其对于缺口聚物的缺口(gap)区(B)。硫代磷酸酯连接也可用于侧翼区(A和C，且用于 将A或C连接至D，且在D区内，视情况而定)。然而A、B和C区可包含除硫代磷酸酯外的其它连接基，如磷酸二酯连接，特别地， 例如当使用核苷酸类似物防止A和C区内的连接基进行内切核酸酶降解-如当A和C区包 含LNA核苷酸时。寡聚物中的连接基可为磷酸二酯、硫代磷酸酯或硼烷磷酸酯以使得RNase H裂解 靶向的RNA。优选硫代磷酸酯，这是由于改善的核酸酶抗性和其它原因，如易于制造。在本发明的寡聚物的一方面，该核苷酸和/或核苷酸类似物通过硫代磷酸酯基彼 此连接。应认识到将磷酸二酯连接，如一个或两个连接，加入到其它硫代磷酸酯寡聚物，特 别是介于核苷酸类似物单元之间或相邻于核苷酸类似物单元(典型地在A区和或C区)可 修饰寡聚物的生物利用度和/或生物分布_参见W02008/053314，在此引入作为参考。在一些实施方案中，如上述实施方案，其中适当且非特异表明，所有剩余的连接基为磷酸二酯或硫代磷酸酯，或其混合物。在一些实施方案中所有核苷酸间连接基为硫代磷酸酯。当涉及具体的缺口聚物寡核苷酸序列，如那些在此提供的，应理解在多种实施方 案中，当该连接为硫代磷酸酯连接时，可使用如那些在此公开的其它连接，例如可使用磷酸 酯(磷酸二酯)连接，特别是用于核苷酸类似物，如LNA单元之间的连接。同样，当涉及具 体缺口聚物寡核苷酸序列时，如在此提供的那些，当C残基注释为5’甲基修饰的胞嘧啶时， 在多种实施方案中，寡聚物中存在的一个或多个C可为未修饰的C残基。寡聚化合物本发明的寡聚物可选自SEQ ID NO 133-152，如表2所示。表2寡聚物设计SEQ ID NOS 133-152，大写字母表示核苷酸类似物单元而下标 “S”表示硫代磷酸酯连接。小写字母表示核苷酸(DNA)单元。“S”缺失(若有的话)指示 磷酸二酯连接。
缀合物在本文中术语"缀合物(conjugate)“是表示通过将本文所述的寡聚物共价连接 (“缀合”)至一个或多个非核苷酸/非核苷酸_类似物(即非核碱基)，或非多核苷酸部分 形成的异源(heterogenous)分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的实例包括大分子试剂如 蛋白质、脂肪酸链、糖残基、糖蛋白、聚合物或其组合。典型的蛋白质可为靶蛋白的抗体。典 型聚合物可为聚乙二醇。因此，在多种实施方案中，本发明的寡聚物可包含多核苷酸区和非核苷酸区，该多 核苷酸区即为核苷酸/核碱基区，其通常由核碱基的连续序列组成。当涉及本发明的由连 续核碱基序列组成的寡聚物，该化合物可包含非核苷酸/非核碱基组分，如缀合物组分。在本发明多种实施方案中，该寡聚化合物连接至配体/缀合物，其可用于例如增 加寡聚化合物的细胞吸收。W02007/031091提供了合适的配体和缀合物，其在此引入作为参 考。本发明还提供缀合物，其包含本文所述的根据本发明的化合物和至少一种共价连 接至所述化合物的非核苷酸或非多核苷酸部分。因此，在多种实施方案中，其中本发明的化 合物由特定的核酸或核碱基序列组成，如本文所公开，该化合物也可包含至少一种非核苷 酸或非多核苷酸部分(例如不包含一种或多种核苷酸或核苷酸类似物)共价连接至所述化 合物。缀合物可增强本发明的寡聚物的活性、细胞分布或细胞吸收。这些部分包括，但不 限于，抗体、多肽、脂质部分如胆固醇部分、胆酸、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇、硫胆固 醇(thiocholesterol)、脂肪链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基、磷脂，例如，二-十六烷 基-rac-甘油或1，2- 二 _o_十六烷基-rac-甘油_3_h_膦酸三乙基铵、聚胺或聚乙二醇链、 金刚烷乙酸、棕榈基部分、十八烷基胺或己基氨基_羰基-氧基胆固醇部分。本发明的寡聚物也可缀合至活性药物，例如，阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗糖尿 药，抗菌药或抗生素。在某些实施方案中该缀合的部分为固醇，如胆固醇。在多种实施方案中，该缀合的部分包含或由以下组成带正电荷的聚合物，如带正 电荷的肽，例如长度为1-50，如2-20如3-10个氨基酸残基，和/或聚环氧烷如聚乙二醇 (PEG)或聚丙二醇-参见WO 2008/034123，在此引入作为参考。合适地该带正电荷的聚合 物，如聚环氧烷可通过连接基连接至本发明的寡聚物，如描述于WO 2008/034123的可释放的连接基。
活化的寡聚物本文所用的术语“活化的寡聚物”，是指共价连接(即，官能化)至至少一个官能 部分(functional moiety)的本发明的寡聚物，该官能部分允许寡聚物共价连接至一个或 多个缀合的部分(即本身不为核酸或单体的部分)，以形成本文描述的缀合物。典型地，官 能部分将包含能通过以下连接共价连接至寡聚物的化学基团例如，3’ -羟基或腺嘌呤碱 基的环外NH2基，优选亲水性间隔基(spacer)和能结合至缀合的部分的末端基团(例如， 氨基、巯基或羟基)。在一些实施方案中，末端基团未被保护，例如，为NH2基团。在其它 实施方案中，末端基团被保护，例如，被任何合适的保护基，如描述于Theodora WGreene和 Peter G M Wuts,第三版(John Wiley & Sons, 1999)的"ProtectiveGroups in Organic Synthesis"的那些保护。合适的羟基保护基的实例包括酯如乙酸酯，芳烷基如苄基，二苯 基甲基，或三苯基甲基和四氢吡喃基。合适的氨基保护基的实例包括苄基，α-甲基苄基，二 苯基甲基，三苯基甲基，苄基氧基羰基，叔丁氧基羰基和酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。 在一些实施方案中，该官能部分是自裂解的(self-cleaving)。在其它实施方案中，该官能 部分为生物可降解的。参见例如，美国专利号7，087，229，其以其整体在此引入作为参考。在一些实施方案中，本发明的寡聚物在5’端官能化以使缀合的部分共价连接至寡 聚物的5’端。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在3’端官能化。在其它实施方案中， 本发明的寡聚物可沿着主链或在杂环碱基部分上官能化。在其它实施方案中，本发明的寡 聚物可在多于一个位置官能化，所述位置独立地选自5’端、3’端、主链和碱基。在一些实施方案中，本发明的活化的寡聚物通过在合成过程中掺入一个或多个共 价连接至官能部分的单体而合成。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物使用未被官 能化的单体合成，且该寡聚物在合成完成后立即官能化。在一些实施方案中，该寡聚物使 用含氨基烷基连接基的位阻酯官能化，其中该烷基部分具有式(CH2)w，其中w为1至10 的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的，且其中该官能团通过酯基 (-O-C(O)-(CH2)wNH)连接至寡聚物。在其它实施方案中，该寡聚物使用含(CH2)w_巯基(SH)连接基的位阻酯官能化， 其中w为1至10的整数，优选约6，其中烷基氨基的烷基部分可为直链或支链的，且其中该 官能团通过酯基(-O-C(O)_(CH2)wSH)连接至寡聚物。在一些实施方案中，巯基-活化的寡核苷酸与聚合物部分如聚乙二醇或肽缀合 (通过二硫键的形成)。上述包含位阻酯的活化的寡聚物可通过任何本领域已知的方法合成，且特别是通 过公开于PCT公开号WO 2008/034122和其实施例中的方法，其以其整体在此引入作为参考。在其它实施方案中，本发明的寡聚物通过使用官能化试剂(functionalizing reagent)向寡聚物引入巯基、氨基或羟基而官能化，该官能化试剂基本上描述于美国 专利号4，962，029和4，914，210，S卩，为基本上链状的试剂，其在一端具有亚磷酰胺 (phosphoramidite)通过亲水性间隔基链连接至相对的端，该相对的端包含保护的或未保 护的巯基、氨基或羟基。这些试剂主要与寡聚物的羟基反应。在一些实施方案中，该活化的 寡聚物具有官能化试剂结合至寡聚物的5’ -羟基。在其它实施方案中，该活化的寡聚物具有官能化试剂结合至3’ -羟基。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚物具有官能化试 剂结合至寡聚物的主链上的羟基。在其它实施方案中，本发明的寡聚物使用多于一种官能 化试剂官能化，该官能化试剂描述于美国专利号4，962，029和4，914，210中，以其整体在此 引入作为参考。合成该官能化试剂和将它们加入单体或寡聚物的方法公开于美国专利号 4，962，029 和 4，914，210。在一些实施方案中，固相结合的寡聚物的5’-端使用二烯基亚磷酰胺衍生物官能 化，然后将脱保护的寡聚物与例如氨基酸或肽通过Diels-Alder环加成反应而缀合。在多种实施方案中，将含2’ _糖修饰的单体，如2’ _氨基甲酸酯取代的糖或 2' -(0-戊基-N-邻苯二甲酰亚氨基)_脱氧核糖的糖掺入寡聚物促进缀合的部分与寡聚 物的糖的共价连接。在其它实施方案中，一个或多个单体的2'-位具有含氨基的连接基 的寡聚物使用以下试剂制备例如，5' -二甲氧基三苯甲基-2' -0-(e-邻苯二甲酰亚氨 基氨基戊基)_2'-脱氧腺苷-3' -N，N-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺。参见，例如， Manoharan，等人，Tetrahedron Letters，1991，34，7171。在其它实施方案中，本发明的寡聚物可在核碱基上具有含胺的官能部分，包括在 N6嘌呤氨基上，在鸟嘌呤的环外N2上，或在胞嘧啶的N4或5位上。在一个实施方案中，该 官能化可通过使用已在寡聚物合成中官能化的商业试剂实现。一些官能部分是可商购的，例如，异双官能(heterobifunctional)和同双官 能(homobifunctional)连接部分可购自 Pierce Co. (Rockford, 111·)。其它可商购的 连接基为5'-氨基-修饰体(Modifier)C6和3'-氨基-修饰体试剂，均可购自Glen Research Corporation (Sterling，Va.)。5'-氨基-修饰体 C6 也可作为 Aminolink-2 购 自 ABI (Applied Biosystems Inc. ,Foster City，Calif.)，且 3‘-氨基-修饰体也可购自 Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Calif.)。组合物本发明的寡聚物可用于药物制剂和组合物。合适地，该组合物包含药学可接受的 稀释剂、载体、盐或佐剂。W02007/031091提供了合适和优选的药学可接受的稀释剂、载体和 佐剂-其在此引入作为参考。合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的 组合，前药制剂也提供于W02007/031091-其也在此引入作为参考。如本文所述，术语"药学可接受的盐"是指保持本文鉴别的化合物的所需生物活 性且显示最小的不希望有的毒理学作用的盐。这些盐的非限制性实例可通过与有机氨基酸 形成，以及与金属阳离子形成的碱加成盐，该金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、 镉、钠、钾等，或与由氨形成的阳离子，N, N-二苄基乙二胺，D-葡糖胺，四乙基铵，或乙二胺 形成的碱加成盐；或(c) (a)和(b)的组合；例如，鞣酸锌盐等。
应用本发明的寡聚物可用作研究试剂，用于例如，诊断、治疗和预防。在研究中，该寡聚物可用于特异抑制细胞和实验动物中β-联蛋白的表达或合成 (通常通过降解或抑制mRNA从而防止蛋白质形成)，从而促进该靶的功能分析或评估其作 为治疗干预的靶的有用性。在诊断中该寡聚物可用于通过RNA印迹法、原位杂交或类似技术检测和定量细胞 和组织中的β-联蛋白表达。
对于治疗，疑患疾病或病症的动物或人(其可通过调节β-联蛋白的表达治疗) 通过给药本发明的寡聚化合物，如有效量的寡聚物(或其缀合物)而治疗。本文进一步提 供了治疗哺乳动物的方法，如治疗人，其疑患疾病或症状或易患疾病或症状，该疾病或症状 与联蛋白的表达相关，该方法通过给药治疗或预防有效量的本发明的一种或多种寡聚 物或组合物。本发明还提供本发明所述的化合物或缀合物在制备用于治疗本文涉及的疾病的 药物中的用途，或提供治疗本文所述的疾病的方法。本发明还涉及本文所述的寡聚物、组合物或缀合物用作药物。合适地，当涉及本发 明的方法时，本发明的寡聚物或缀合物的给药通过给药有效量的寡聚物或缀合物进行，例 如能有效提供治疗的量或有效抑制或下调细胞中β“联蛋白表达的量。本发明还提供治疗本文涉及的疾病的方法，所述方法包括向需要的患者给药本发 明的化合物，和/或本发明的缀合物，和/或本发明的药物组合物。在多种实施方案中，该寡聚物或其缀合物，通过例如氢键合至靶核酸而结合，在人 体内引起所需的治疗效果。该寡聚物或其缀合物，通过氢键合(杂交)至靶的mRNA导致基 因表达减少，引起靶的表达减少(抑制)。还可看出本文公开的寡聚化合物和缀合物可具有 非治疗应用，如诊断应用。医药适应症在多种实施方案中，本文涉及的疾病选自过度增生性疾病，如癌症，如选自以下的 癌症结肠直肠癌，肝细胞癌，子宫内膜癌，恶性黑素瘤，卵巢癌，胰腺癌，垂体癌，食管癌，肺 癌，乳腺癌，肾癌，造血系统癌，子宫颈癌，CNS癌，骨癌，胆道癌和肾上腺癌。在多种实施方案中，本文涉及的疾病为选自以下的癌症结肠直肠癌、肝细胞癌、 子宫内膜癌和恶性黑素瘤。在多种实施方案中，本文涉及的疾病为选自以下的癌症肝癌和肾癌。根据本发明的寡聚物和其它组合物可用于治疗与β _联蛋白的过表达或β _联蛋 白的突变体的表达相关的疾病。本发明进一步提供本发明的化合物在制备或制造用于治疗本文提及的疾病、病症 或症状的药物中的用途。本发明进一步涉及本文定义的化合物、组合物或缀合物在制备用于治疗异常水平的联蛋白或突变体形式的联蛋白(如等位变体，如与本文提及的疾病之一相关的 那些)的表达的药物中的用途。本发明一个方面涉及治疗患有以下疾病或对以下疾病敏感的哺乳动物的方法， 所述疾病与异常水平的联蛋白相关，该方法包括向哺乳动物给药治疗有效量的靶向 β _联蛋白的寡聚物，如包括一个或多个LNA单元的寡聚物。因此本发明的方法可用于治疗 或预防异常水平的联蛋白引起的疾病。或者，在多种实施方案中，本发明进一步涉及治 疗异常水平的联蛋白的方法，所述方法包括向需要的患者给药本发明的寡聚物，或本 发明的缀合物或本发明的药物组合物。在多种实施方案中，本文涉及的疾病或病症与β-联蛋白基因或其蛋白产物与 联蛋白相关或与联蛋白相互作用的基因的突变相关。因此，在多种实施方案中，该
靶mRNA为β-联蛋白序列的突变形式。
本发明一个感兴趣的方面涉及本文定义的寡聚物(化合物)或本文定义的缀合物 在制备用于治疗本文提及的疾病、病症或症状的药物中的用途。本发明还涉及本文定义的寡聚物、组合物或缀合物，其用作药物。而且，本发明涉及治疗患有如本文涉及的那些疾病或症状的患者的方法，所述方 法包括向需要的患者给药如本文所述的本发明化合物，和/或本发明的缀合物，和/或本发 明的药物组合物。合适的剂量、制剂、给药途径、组合物、剂型、与其它治疗剂的组合，前药制剂也在 W02007/031091中提供-其在此引入作为参考。本发明还提供包含本文描述的化合物或缀 合物和药学可接受的稀释剂、载体或佐剂的药物组合物。W02007/031091提供合适和优选的 药学可接受的稀释剂、载体和佐剂-其在此引入作为参考。本发明的方法优选用于治疗或预防异常水平的联蛋白引起的疾病。而且，本文描述的发明包括预防或治疗疾病的方法，包括向需要该治疗的人给药 治疗有效量的调节联蛋白的寡聚物。本发明进一步包括短期给药调节联蛋白的寡 核苷酸化合物(寡聚物或缀合物)的用途。或者，在多种实施方案中，本发明进一步涉及治疗异常水平的联蛋白的方法， 所述方法包括向需要的患者给药本发明的寡聚物、或本发明的缀合物或本发明的药物组合 物，且进一步包括给药其它药物或其它活性成分。所述进一步给药可为以下情况该其它药 物或其它活性成分缀合至本发明的化合物、存在于药物组合物中或以单独制剂给药。本发明还涉及本文定义的寡聚物、组合物或缀合物，其用作药物。本发明进一步涉及本文定义的化合物、组合物或缀合物在制备用于治疗异常水平 的联蛋白或表达联蛋白突变体形式(如等位变体，如与本文提及的疾病之一相关 的那些)的药物中的用途。而且，本发明涉及治疗患有如那些本文涉及的疾病或症状的患者的方法。需要治疗的患者为患有或很可能患有疾病或病症的患者。在多种实施方案中，本文使用的术语‘治疗’是指治疗存在的疾病(例如本文涉及 的疾病或病症)，或预防疾病，即预防(prophylaxis)。因此应认识到在多种实施方案中，本 文涉及的治疗可为预防的。在多种实施方案中，本发明涉及的疾病或病症可与β-联蛋白基因或其蛋白产物 与β-联蛋白相关或与β-联蛋白相互作用的基因(如APC基因)的突变相关。因此，在 多种实施方案中，该靶mRNA为β-联蛋白序列的突变形式，例如其可包括一个或多个单点 突变，如与癌症相关的SNPs。这些疾病的实例(其中联蛋白或APC基因中的突变导致异常水平的β-联蛋 白活性)为⑴结肠直肠癌，所有情况中多于70%的APC和β-联蛋白互相突变(Powell 等人，Nature, 1992 ；Morin 等人，Science, 1997 ；Sparks 等人，Cancer Res, 1998) ； (2)肝 细胞癌，多于25%的情况下β-联蛋白突变(de LaCoste A，PNAS, 1998) ； (3)子宫内膜 癌，β-联蛋白突变> 10% ；和(4)恶性黑素瘤，B-联蛋白突变> 10% (Rubinfeld等人， Science,1997)。这些疾病的其它实例为以下癌症卵巢癌，胰腺癌，垂体癌，食道癌，肺癌，乳腺癌， 肾癌，造血系统癌，子宫颈癌，CNS癌，骨癌，胆道癌和肾上腺癌。已显示β-联蛋白或APC基因中的突变与这些疾病相关(Catalogue ofSomatic Mutations in Cancer available from the Sanger Institute (UnitedKingdom) homepage http://www· Sanger· ac· uk/)0本发明涉及的癌症可选自上述形式的癌症之一。
进一步的实施方案以下实施方案也涉及说明书和发明内容，且可与本发明的实施方案(包括权利要 求中涉及的实施方案)组合1.反义寡核苷酸(如寡聚物)，其能结合至SEQ ID NO :173的β-联蛋白基因或其 等位基因的靶序列，且能下调联蛋白的表达，所述寡核苷酸包含对应于靶序列的10-50 个核碱基的序列。2.实施方案1的反义寡核苷酸，其中该靶序列选自SEQ ID N0S:1_132表示的 β-联蛋白基因或其等位变体的区域。3.实施方案1或实施方案2的寡核苷酸，其包含10-16个示于SEQ IDNOS :1、16、 17、18、33、34、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、73、88、103 和 118 的核碱基序列或其等位变体。4.根据实施方案1-3中任一项的寡核苷酸，其包含示为SEQ ID NOS :1_132的序 列。5.前述实施方案任一项的寡核苷酸，其由SEQ ID NOS 133-172所表示。6.根据前述实施方案任一项的寡核苷酸，其中所述核碱基序列包含独立地选自磷 酸二酯、硫代磷酸酯和硼烷磷酸酯的核碱基间连接。7.前述实施方案任一项的寡核苷酸，其中所述核碱基中的至少两个为核苷酸类似 物。8.根据实施方案5的寡核苷酸，其中所述核碱基的序列沿5’至3’的方向包含(i) A区一段2-4个核苷酸类似物，接着(ii)B区不同于A区的一段6-11个核苷酸或核苷酸 类似物，接着(iii)C区一段2-4个核苷酸类似物，和任选接着(iv)D区1个或2个核苷酸。9.根据实施方案8的寡核苷酸，其中A区在两个核苷酸类似物单元之间和/或在 核苷酸类似物单元和B区的核碱基单元之间包括至少1个磷酸二酯连接。10.根据实施方案8或实施方案9的寡核苷酸，其中C区在两个核苷酸类似物单元 之间和/或在核苷酸类似物单元和B区的核碱基单元之间包括至少1个磷酸二酯连接。11.根据实施方案1-6中任一项的寡核苷酸，其中所有核碱基间连接为硫代磷酸 酯。12.根据实施方案7-11中任一项的寡核苷酸，其中所述核苷酸类似物单元独立 地选自2，-0-烷基-RNA、2，-氨基-DNA、2，-氟-DNA、锁核酸(LNA)、阿糖核酸(ANA)、 2，_ 氟-ANA、HNA、INA 禾口 2，Μ0Ε。13.根据实施方案12的寡核苷酸，其中该核苷酸类似物独立地选自2’ -M0E-RNA、 2，_ 氟-DNA 禾口 LNA014.根据实施方案13的寡核苷酸，其中所述核苷酸类似物的至少一个为锁核酸 (LNA)。15.根据实施方案14的寡核苷酸，其中所有核苷酸类似物为LNA。
16.根据实施方案12-15中任一项的寡核苷酸，其中LNA选自β-D-氧基-LNA、 α -L-氧基-LNA、β -D-氨基-LNA 和 β -D-硫基-LNA。17.缀合物，其包含根据前述实施方案任一项的寡核苷酸和共价连接至所述寡核 苷酸的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分。18.根据实施方案17的缀合物，其中所述非核苷酸或非多核苷酸部分由固醇基团 如胆固醇组成或包含固醇基团如胆固醇。19.药物组合物，其包含根据实施方案1-16中任一项的寡核苷酸或根据实施方案 17或实施方案18的缀合物，以及药学可接受的稀释剂、载体或佐剂。20.根据实施方案1-18中任一项的寡核苷酸或缀合物，其用作药物。21.根据实施方案1-18中任一项的寡核苷酸或缀合物在制备用于治疗异常水平 的β-联蛋白或需要(indicated) β-联蛋白表达的下调的疾病或症状的药物中的用途。22.根据实施方案21的用途，其中所述疾病或症状为癌症。23.治疗患有癌症的患者的方法，该方法包括向需要的患者给药根据实施方案 1-19中任一项的药物组合物、寡核苷酸或缀合物的步骤。24.实施方案21-23中任一项的用途或方法，其中所述癌症选自结肠直肠癌、肝细 胞癌、子宫内膜癌、恶性黑素瘤、卵巢癌、胰腺癌、垂体癌、食道癌、肺癌、乳腺癌、肾癌、造血 系统癌、子宫颈癌、CNS癌、骨癌、胆道癌和肾上腺癌。25. β-联蛋白基因中的靶序列，其中对应于所述靶序列的反义寡核苷酸能下调 β-联蛋白的表达。26.实施方案25的靶序列，其中该靶序列选自与SEQ ID NOs 1_132互补的β-联 蛋白基因或其等位变体的区域。27.下调细胞中β-联蛋白的表达的方法，包括将细胞与根据实施方案1-16中任 一项的寡核苷酸接触。
实施例实施例1 单体合成该LNA单体构件(building blocks)和衍生物按照公开的方法和其中引用的文献 制备-参见W007/031081和其中引用的文献。实施例2 寡核苷酸合成寡核苷酸根据描述于W007/031081的方法合成。表1显示本发明的反义寡核苷酸 基序的实施例。实施例3 寡核苷酸的设计根据本发明，一系列寡核苷酸使用公开的序列(GenBank登记号NM_001904)设计 为靶向人β-联蛋白的不同区域，所述序列在本文中为SEQID Ν0:173。表2显示本发明的寡聚物设计。表3显示24聚物(24mer)序列基序，从该基序可设计本发明的寡聚物_粗体表示如表1所示的16聚物(16mer)序列基序。
实施例4 体外模型细胞培养反义寡核苷酸对靶核酸表达的作用可以在多种细胞类型的任一种中测试，条件是 该靶核酸以可检测的水平存在。靶可内源性表达或通过对编码所述核酸的核酸进行瞬时转 染或稳定的转染而表达。靶核酸的表达水平可常规地使用，例如，RNA印迹分析、实时PCR、 核糖核酸酶保护测试而确定。为了例示，提供以下细胞类型，但可常规使用其它细胞类型， 条件是该靶在所选的细胞类型中表达。细胞如下所述在合适的培养基中培养，并保持在37°C和95-98%湿度和5% CO2下。细胞每周常规传代2-3次。SW480 将人结肠盲肠癌细胞株SW480在L_15培养基(Leibovitz)+10%胎牛血清 (FBS) +Glutamax 1+青霉素 / 链霉素(pen/strep)中培养。HCTl 16 将人结肠直肠癌细胞株HCTl 16在McCoy，s 5a改良培养基(Sigma)+10% 胎牛血清(FBS)+Glutamax 1+青霉素/链霉素中培养。实施例5 体外模型用反义寡核苷酸处理将细胞用寡核苷酸处理，使用阳离子脂质体制剂LipofectAMINE 2000 (Gibco)作 为转染载体。将细胞接种于6-孔细胞培养板(NUNC)并当铺满75-90%时进行处理。使用的 寡核苷酸浓度范围为InM至25nM终浓度。寡核苷酸-脂质复合物的配制基本上按照制造商 的说明进行，其使用无血清OptiMEM(Gibco)且最终脂质浓度为10 μ g/mL的LipofectAMINE 2000。将细胞在37°C培养4小时且通过去除含寡核苷酸的培养基终止处理。清洗细胞且添 加含血清的培养基。寡核苷酸处理后，使细胞恢复20小时，然后将其收集用于RNA分析。实施例6 体外模型RNA的提取和cDNA合成为从细胞株分离RNA，根据制造商提供的方案使用RNeasy小量试剂盒(Qiagen cat. no. 74104)。根据制造商的说明使用Ambion的逆转录酶试剂(Reverse Transcriptasereagents) iH^fT^I一Iil。对于每种样品用无RNase的H2O将0. 5 μ g总RNA调节至(10. 8 μ 1)，并与2 μ 1十 碱基的随机引物(random decamers) (50 μ Μ)和4 μ 1 dNTP混合物(2. 5mM每dNTP)混合， 且加热至70°C保持3分钟，然后将样品在冰上快速冷却。样品在冰上冷却后，将2μ1 IOx 缓冲液RT, 1 μ 1 MMLV逆转录酶(100U/ μ 1)和0. 25 μ 1 RNase抑制剂(10U/ μ 1)添加至各 样品中，然后在42°C培养60分钟，在95°C将酶热灭活10分钟，然后将样品冷却至4°C。实施例7 体外模型通过实时PCR分析β -联蛋白表达的寡核苷酸抑制β-联蛋白表达的反义调节可在多种本领域已知的方式中测试。例如，β-联蛋白 mRNA水平可通过例如，RNA印迹分析、竞争性聚合酶链式反应(PCR)或实时PCR定量。实 时定量的PCR目前是优选的。RNA分析可对总细胞RNA或mRNA进行。RNA分离的方法和 RNA分析方法如RNA印迹分析是本领域中常规的，且在例如John Wiley和Sons的Current Protocols inMolecular Biology 中教导。实时定量(PCR)可方便地使用可商购的获自Applied Biosystem的Multi-Color 实时 PCR Detection System 而实现。β -联蛋白mRNA水平的实时定量PCR分析人β-联蛋白mRNA的样品含量使用人β-联蛋白ABI PrismPre-Developed TaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat. no. Hs00170025_ml)卞艮据制造商的说明定量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的量用作内源性对照用于标准化样品制剂中 的任何变量。人GAPDHmRNA的样品含量使用人GAPDH ABI Prism Pre-DevelopedTaqMan Assay Reagent (Applied Biosystems cat. no. 4310884E)根据制造商的说明定量。实时定量的PCR是本领域公知的技术，且在例如Heid等人Realtimequantitative PCR, Genome Research (1996)，6 :986_994 帛。实时PCR将源自第一链合成的cDNA (按实施例8中的描述进行)稀释2_20倍，且通过实时 定量 PCR 使用 Applied Biosystems 的 Taqman 7500FAST 分析。将引物和探针与 2x Taqman Fast Universal PCR 主、混合物(master mix) (2x) (Applied Biosystems Cat. #4364103) 混合，并添加至4μ1 cDNA至最终体积为10ul。各样品一式三份进行分析。测试2倍稀释 的cDNA得到该测试的标准曲线，该cDNA从表达感兴趣的RNA的细胞株纯化的物质制备。 使用无菌H2O代替cDNA用于无模板对照。PCR程序95°C保持30秒，然后进行40个循环， 95°C，3 秒，60°C，30 秒。靴 mRNA 序列的相对量使用 AppliedBiosystems Fast System SDS Software Version 1. 3. 1. 21从计算的阈值循环确定。实施例8 体外分析通过寡核苷酸反义抑制人β -联蛋白表达评估表2的寡核苷酸在SW480细胞中以浓度1、5和25ηΜ破坏β -联蛋白mRNA的潜能(参见图2)。数据以相对5nM的模拟品(mock)转染的细胞的β-联蛋白mRNA的下调 百分比示于表4。小写字母表示DNA单元，粗体的大写字母表示β-D-氧基-LNA单元。所 有LNA C为5'甲基C。下标“S”表示硫代磷酸酯连接。 如表4 所示，在这些实验中 SEQ ID NOs :153、154、155、156、158、161、168、169、 170、171和172的寡核苷酸在5nM显示对β -联蛋白mRNA表达约74%或更大的抑制，因此是优选的。同样优选的为基于所示反义寡序列的寡核苷酸，例如改变长度(更短或更长)和 /或核碱基含量(例如类似物单元的类型和/或比例)，其也提供对联蛋白表达的良好 抑制。实施例9:体外分析蛋白质印迹分析β-联蛋白蛋白质水平在转染的细胞中寡聚化合物对β-联蛋白蛋白质水平的体外作用通过蛋白质印 迹法测定。收集如实施例5所述用寡核苷酸转染的200.000SW480细胞且在补充有蛋白酶抑 制剂混合物(Roche)的 RIPA裂解缓冲液(50mMTris_HCl pH7. 4,150mM NaCl, ImM EDTA, 1% Triton Χ-100,0. 1% SDS，1%脱氧胆酸钠)中裂解。使用BCA蛋白质测试试剂盒(Pierce) 测量总蛋白浓度。根据制造商的说明(Invitrogen)，将50 μ g总蛋白质在3-8% Tris Acetate凝胶上进行且印迹在PVDF膜上。在封闭缓冲液(补充有5%低脂奶粉的PBS-T) 中过夜温育后，将膜与抗-β-联蛋白抗体(BD Transduction实验室)一起温育过夜。作 为对照，负载微管蛋白使用Neomarker的单克隆抗体检测。然后将膜与二抗一起温育，且 β-联蛋白或微管蛋白用化学发光ECL+检测试剂盒(Amersham)显像。参见图3。实施例10 增殖的活细胞的测量(MTS测试)在转染前一天将HCT116结肠直肠癌细胞以密度为200，000细胞/孔在McCoy，s 5a 改良的培养基(Sigma M8403) +2mM Glutamax I (Gibco35050_038)+10 % FBS (Brochrom#193575010) +25 μ g/ μ 1 Gentamicin (SigmaG1397 50mg/ml)中接种于 6 孔 板。第二天去除培养基,然后添加 1. 2ml 含 7. 5 μ g/ml LipofectAMINE2000 (Invitrogen) 的OptiMEM。将细胞温育7分钟然后添加0.3ml在OptiMEM中稀释的寡核苷酸。最终寡 核苷酸浓度为25nM。处理4小时后，去除培养基且将细胞用胰蛋白酶消化并以5000细胞 / 孔的密度在 100μ1 McCoy，s 5a 改良的培养基(Sigma M8403) +2mM GlutamaxI (Gibco 35050-038)+10 % FBS(Brochrom#193575010)+25 μ g/μ IGentamicin(Sigma G1397 50mg/ ml)中接种于透明的96孔板(ScientificOrange no. 1472030100)。在添加10μ1四唑 鐺化合物[3-(4，5- 二甲基-2-基)-5-(3_羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺基苯基)-2Η_四 唑鐺，内盐；MTS]和电子偶合试剂(吩嗪硫酸乙酯；PES) (CellTiter 96 AQueous One Solution CellProliferation Assay，Promega)所指示的时间测量活细胞。活细胞在 Powerwave (Biotek Instruments)中在490nm测量。将0D490nm相对于时间/小时绘图(参 见图4)。实施例11 抑制小鼠肝中的β _联蛋白mRNA连续三天在匪RI小鼠静脉内给药25mg/kg寡核苷酸(SEQ ID NO :156，158，168， 169，171)(每组5只小鼠)。将反义寡核苷酸溶于0. 9%盐水(NaCl)。最后一次给药24小 时后将动物处死，且将肝组织取样并储存于RNA之后直到RNA提取和QPCR分析。提取总RNA 且通过QPCR按实施例7的描述测量肝样品中的β -联蛋白mRNA表达，其使用小鼠β -联蛋 白 QPCR测试(cat. Mm00483033_ml，Applied Biosystems)。结果标准化为小鼠 GAPDH(cat. no. 4352339E，Applied Biosystems)，且相对盐水处理的对照作图，参见图5。实施例12 =SEQ ID NO 161和聚乙二醇的缀合物的制备具有SEQ ID NO 161的寡聚物通过使用常规亚磷酰胺化学品(phosphoramidite chemistry)将氨基烷基连接至寡聚物的5’磷酸基从而在5’端官能化，该氨基烷基如具有阻断基(如Fmoc)的己-1-胺，氧化所得化合物，将其脱保护且纯化以得到官能化的式(I)
的寡聚物 其中SEQ ID NO 161中的粗体大写字母和下标“S”具有与上述相同的含义。活化的PEG，如式(II)所示物质 其中该PEG部分的平均分子量为12，000，和式(I)化合物在PBS缓冲液中的溶液 在室温搅拌12小时。将该反应溶液用二氯甲烷萃取三次且合并的有机层用硫酸镁干燥，过 滤且溶剂在减压下蒸发。将残余物溶于双蒸水并加载至离子交换柱上。未反应的PEG连接 基用水洗脱且产物用NH4HCO3溶液洗脱。汇集含纯产物的级分并冻干以得到式(III)的缀
合物 其中SEQ ID NO 161的寡聚物通过可释放的连接基连接至平均分子量为12，000 的PEG聚合物。以下为SEQ ID NO 168和171的缀合物的实例
权利要求
长度为10-25个核碱基的寡聚物，其包括总共10-24个核碱基的连续核碱基序列，其中；i)所述连续核碱基序列与选自SEQ 192和SEQ ID NO89的序列的对应区100％同源；或，ii)所述连续核碱基序列相对于选自SEQ192和SEQ ID NO 189的序列的对应区包含不超过1个错配。
2.长度为10-50个核碱基的寡聚物，其包含总共10-50个核碱基的连续核碱基序列，其 中所述连续核碱基序列与对应于哺乳动物β-联蛋白基因或mRNA JnSEQ ID NO 173或其 天然存在的变体的区域至少80%同源。
3.根据权利要求1或2的寡聚物，其中该连续核碱基序列与对应于选自SEQID NOs 1-132和SEQ ID NOs 174-193的序列，如选自SEQ ID NO 189、192、58和103的序列的区域 至少80%同源。
4.根据权利要求1-3中任一项的寡聚物，其中该连续核碱基序列不包含错配或与SEQ ID NO 173的对应区相比包含不超过1个或2个错配。
5.根据权利要求1-4中任一项的寡聚物，其中寡聚物的核碱基序列由连续核碱基序列 组成。
6.根据权利要求1-5中任一项的寡聚物，其中该连续核碱基序列的长度为10-18个核苷酸。
7.根据权利要求1-6中任一项的寡聚物，其中该连续核碱基序列包含核苷酸类似物。
8.根据权利要求7的寡聚物，其中该核苷酸类似物为糖修饰的核苷酸，如选自以下 的糖修饰的核苷酸锁核酸(LNA)单元；2’ -0-烷基-RNA单元、2’ -OMe-RNA单元、2’ -氨 基-DNA单元和2，-氟-DNA单元。
9.根据权利要求7的寡聚物，其中该核苷酸类似物为LNA。
10.根据权利要求7-9中任一项的寡聚物，其为缺口聚物。
11.根据权利要求1-10中任一项的寡聚物，其抑制表达β-联蛋白基因或mRNA的细胞 内β-联蛋白基因或mRNA的表达。
12.根据权利要求1-11中任一项的寡聚物，其中所述寡聚物选自SEQIDNO 133-174， 如 SEQ ID NO 168 和 SEQ ID NO 171。
13.缀合物，其包含根据权利要求1-12中任一项的寡聚物，且至少一种非核苷酸或非 多核苷酸部分与所述寡聚物共价连接。
14.药物组合物，其包含根据权利要求1-12中任一项的寡聚物，或根据权利要求13的 缀合物，和药学可接受的稀释剂、载体、盐或佐剂。
15.根据权利要求1-12中任一项的寡聚物，或根据权利要求13的缀合物，其用作药物， 如用于治疗过度增生性疾病，如癌症。
16.根据权利要求1-12中任一项的寡聚物，或根据权利要求13的缀合物，在制备用于 治疗过度增生性疾病，如癌症的药物中的用途。
17.治疗过度增生性疾病，如癌症的方法，所述方法包括向患有或可能患有过度增生性 疾病，如癌症的患者给药根据权利要求1-12中任一项的寡聚物，或根据权利要求13的缀合 物，或根据权利要求14的药物组合物。
18.在表达β-联蛋白的细胞内抑制β-联蛋白的方法，所述方法包括向所述细胞给药 根据权利要求1-12中任一项的寡聚物，或根据权利要求13的缀合物以抑制所述细胞内的β-联蛋白 。
全文摘要
本发明涉及寡聚化合物(寡聚物)，其靶向细胞内的β-联蛋白mRNA，导致β-联蛋白的表达减少。β-联蛋白表达的减少有利于一系列医学疾病，如过度增生性疾病，包括癌症。本发明提供包含寡聚物的治疗组合物和使用所述寡聚物调节β-联蛋白的表达的方法，包括治疗方法。
文档编号A61K31/7088GK101842483SQ200880022871
公开日2010年9月22日 申请日期2008年4月30日 优先权日2007年5月1日
发明者杰斯珀·沃姆 申请人:桑塔里斯制药公司;安佐制药股份有限公司