专利名称：有效清除肿瘤细胞的化合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种全新的、有效清除肿瘤和癌症细胞的方法和小分子化合物，更确切的说涉及一种引导自体免疫系统发现并清除肿瘤和癌症细胞的方法和小分子化合物。
背景技术：
肿瘤、癌症是造成人类生命和健康重大损害的主要原因。随着环境污染的加剧、各种压力的增大，肿瘤癌症的发病率逐年上涨。虽然人类已经研发和临床应用了多种治疗方法，如手术(operation)、放射疗法(radiotherapy)、化学疗法(chemotherapy)、和光动力疗法(photodynamic therapy)，由于这些方法无法清除恶性肿瘤癌症细胞，它依然是最主要的致死原因之一。
找到如何清除肿瘤癌症细胞的手段，是当前生命科学领域研究人员的主攻方向、和对抗这种细胞严重异化的发展方向。
起源于生命衰老研究的氧化应激窗口期理论(Window Period for Oxidative StressAttenuating Intervention，WPOS Theory)，从小分子水平阐述了生命的平衡理念。这个理论的出现，不仅为传统中医药的宏观平衡学说提供了现代科学基础，为传统中医药的定量研究提供了方法论；还为现代西药开发开辟了一个新的研发方向。
在WPOS理论的指导下，西药的研发方向主要有两个。一是协助维护机体内部有益的平衡状态，如调解糖尿病患者、高血压患者等的不平衡状态；二是干扰破坏对机体有害的内部平衡，如打破致病微生物在生命体内的平衡状态、打破已经发生变异的机体原有组织和系统(如肿瘤癌症等)的平衡状态。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种通过免疫标识肿瘤癌症细胞，从而使机体的免疫系统能够发现肿瘤癌症细胞的方法，即通过干扰肿瘤癌症细胞的微观平衡、清除肿瘤癌症细胞，从而实现生命体自身内部微观平衡，也即验证氧化应激窗口期干扰法在疾病治疗方面的应用。
本发明的第二目的在于揭示如何寻找能够免疫标识肿瘤癌症细胞的物质的方法，即提供一种免疫标识肿瘤癌症细胞的、可以粘附在细胞表面的分子的有机分子。
本发明的第三目的在于提供粘附于细胞表面的、尾端含有糖类分子功能基团的有机分子。
在本发明的第一方面，提供了一种尾端含有糖类分子功能基团的有机化合物的用途，用于免疫标识肿瘤细胞以使哺乳动物体免疫系统发现；或用于制备治疗肿瘤的药物； 所述的糖类分子是单糖、或由单糖组合的双糖或多糖，所述的单糖是如式I或式II所示的结构
式I
式II 在式I中，M为CH2、或NH，在式II中，M为O、CH2、或NH。
在另一优选例中，所述的单糖是六碳碳糖、六碳氮糖、阿拉伯糖、阿拉伯碳糖、阿拉伯氮糖、木糖、木碳糖、或木氮糖。
在另一优选例中，所述多糖由3、4、或5个单糖组成。
在另一优选例中，所述的有机化合物可以粘附在细胞表面。
在另一优选例中，所述的有机化合物是如下结构的化合物
在另一优选例中，所述的肿瘤包括颅脑、头颈、呼吸、循环、消化、泌尿、内分泌、生殖、骨骼，以及皮肤、软组织肿瘤等，如乳腺肿瘤、肝肿瘤、等等。
在本发明的第二方面，提供了一种能使哺乳动物机体免疫系统发现肿瘤细胞的方法，所述的方法是对肿瘤癌症细胞进行免疫标识；所述的免疫标识是提供一种可以粘附在细胞表面、尾端含有糖类分子功能基团的有机化合物作为免疫标识物质。
在另一优选例中，所述的糖类分子是单糖、或由单糖组合的双糖或多糖，所述的单糖是如式I或式II所示的结构
式I
式II 在式I中，M为CH2、或NH，在式II中，M为O、CH2、或NH。
在另一优选例中，所述的单糖是六碳碳糖、六碳氮糖、阿拉伯糖、阿拉伯碳糖、阿拉伯氮糖、木糖、木碳糖、或木氮糖；所述多糖由3、4、或5个单糖组成。
在另一优选例中，所述的有机化合物是如下结构的化合物
据此，本发明提供了一种通过免疫标识肿瘤癌症细胞，从而使机体的免疫系统能够发现肿瘤癌症细胞的方法，从而治疗肿瘤。
具体实施例方式 发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现了一些有机化合物，它们可以粘附于肿瘤细胞表面，便于机体免疫系统识别，从而利用机体免疫系统有效清除肿瘤细胞。
免疫系统是生命体确保自身平衡的最强大系统功能，在没有被破坏的情况下，具备清除所有可以辨识的变异细胞的能力。
肿瘤癌症细胞特殊的构造使它们可以源源不断地从生命体获取各种物质，又通过生命体排泄它们的代谢废物，但生命体的免疫系统却发现不了这些已经变异、需要清除的细胞。
免疫系统通过确认细胞表面的糖蛋白、或糖脂分子，来分辨细胞是否是异源物或者变异体。我们通过对现有已知的药物分子进行结构修饰，就可以达到干扰肿瘤癌症细胞自体平衡，让生命体免疫系统有效发现这些肿瘤癌症细胞的目的，从而将它们清除干净。这些已知的药物分子能够粘附在细胞表面，药物分子被修饰的位置不影响这些分子在细胞表面的粘附。用于修饰这些药物分子的物质是生命体内本身不具备的物质，如天然产物木糖、阿拉伯糖的单体或多聚体、以及它们的氮糖(aza-sugar)、碳糖(carba-sugar)结构分子。
由于新发明的分子药物的主体是已知的药物，安全性高，它们可以用于肿瘤癌症早、中期的治疗，甚至于预防。
能够吸附在细胞表面、又能被免疫系统接触到的分子，是下面这些已被验证作用于细胞表面、分子又较大的物质，如β-内酰胺类抗生素分子、糖肽、多肽、大环醚结构分子、卟啉分子、等等。本发明包括所有能够有效粘附在细胞表面的分子药物，糖分子在它们上面的链接点只要不影响这些分子在细胞表面的粘附即可。
本发明中所说的糖分子是单糖或单糖自由组合的双糖或多糖等，所述的单糖是六碳碳糖、六碳氮糖、阿拉伯糖、阿拉伯碳糖、阿拉伯氮糖、木糖、木碳糖、木氮糖，如下结构所示
M＝O，阿拉伯糖、木糖 M＝CH2，碳糖M＝CH2，碳糖 M＝NH，氮糖 M＝NH，氮糖 所说的多糖一般不超过5个这些单糖的组合。
除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock，Comprehensive Organic Transformations，VCHPublishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，3rd Ed.，John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser，Fieser and Fieser’sReagents for Organic Synthesis，John Wi ley and Sons(1994)；and L.Paquette，ed.，Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)中都有公开。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
本发明中的重量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例一卟啉类化合物N-乙氧基氮戊糖-H2T 4-PyP(化合物A)
分子合成 氮气保护、2000毫升的无水DMF中，加入10克的卟啉H2T-4-PyP、100克的对甲基苯磺酸乙氧基碳戊糖酯，在100℃的温度下加热24小时。反应进程使用薄层硅胶色谱法(TLC)检测，展开剂是硝酸钠饱和的水∶水∶乙腈＝1∶1∶8.反应结束后，冷却到室温。在搅拌下，向反应体系中慢慢滴加2000毫升的水，然后是2000毫升的三氯甲烷。分离除去三氯甲烷层，然后再用三氯甲烷萃取3次后，水相过滤除去不溶物。向过滤后的水相滴加饱和六氟磷化铵，得到六氟磷N-乙氧基氮戊糖-H2T-4-PyP沉淀，沉淀使用异丙醇∶乙醚＝1∶1溶剂洗涤三次后，真空干燥。
粗产物用丙酮水溶剂重结晶，得淡黄色固体产物(7克，68％产率)，熔点189-193℃。
1H-NMR(ppm，CD3Cl) 8.64(m，4H)，7.53(m，4H)，7.32-7.19(m，10H)，6.48(m，6H)，4.2-2.0(m，32H)； 13C-NMR(ppm，CD3Cl)154(2C)，152(6C)，149(2C)，143(2C)，140-49(44个碳)； 元素分析碳＝60.93％(理论值61.49％)，氢＝5.32％(理论值4.98％)，氮＝9.89％(理论值10.24％)。
实施例二大环醚类化合物C1-碳六糖酯沙利霉素(化合物B)
分子的合成 配制N-硫代羟基琥珀酰亚胺(n-hydroxysulfosuccinimide)在二甲基甲酰胺(DMF)中的饱和溶液(共23毫摩尔的量)，然后氮气保护下将这个溶液加入到含20毫摩尔的沙利霉素的二甲基甲酰胺溶液中。摇匀后，加入200毫升含有24毫摩尔的N，N’一二环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液，室温下搅拌过夜。
在室温下加入30毫摩尔TBDMS保护的分子中的碳糖，搅拌两个小时后，加入氟化钾(KF)12毫摩尔，搅拌过夜，纯水沉淀出固体粗产物。
粗产物用丙酮水溶剂重结晶，得淡黄色固体产物(15克，80％产率)，熔点118-121℃。
1H-NMR (ppm，(CD3)2CO)5.64(m，2H)，4.83(m，1H)，4.49(m，2H)，4.18(m，1H)，4.01(m，1H)，3.8-3.30(m，7H)，2.89(br，7H)，2.57(m，3H)，2.19-1.38(m，24H)，1.33(s，6H)，1.29(m，9H)，1.11(m，12H)，0.88(m，9H)； 13C-NMR(ppm，(CD3)2CO)211，176，131，127，109，89，81-9(44个碳)； 元素分析碳＝64.13％(理论值64.91％)，氢＝9.32％(理论值9.15％)。
实施例三 大环醚类化合物C-20丁二酸-N-六氮糖酯沙利霉素(化合物C)
分子的合成 氮气保护无水状态下，沙利霉素的钠盐和等摩尔的丁二酸酐溶解在无水吡啶中，封口，然后加热到100℃，并维持在该温度下5小时。
冷却到室温后，加入等摩尔的氮糖氨，再搅拌过夜后，用冷的2N盐酸稀释，氯仿萃取。萃取液蒸干后，硅胶柱分离，展开剂为二氯甲烷∶丙酮∶甲醇(80∶20∶4)，分出C-20丁二酸-N-六氮糖酯沙利霉素产物。
粗产物用丙酮水溶剂重结晶，得淡黄色固体产物，熔点133-136℃。
1H-NMR(ppm，(CD3)2CO) 10.2(br，1H)，7.68(br，1H)，5.78(m，2H)，5.28(m，1H)，4.08(m，1H)，3.9-1.38(m，46H)，1.33(s，6H)，1.29(m，9H)，1.11(m，12H)，0.88(m，9H)； 13C-NMR(ppm，(CD3)2CO)197，179，174.2，172.1，132，126，108，89，81-9(45个碳)； 元素分析碳＝63.13％(理论值62.09％)，氢＝9.05％(理论值8.65％)，氮＝2.18％(理论值2.73％)。
实施例四长链化合物N-Estra-O-双糖(化合物D)。
化合物的合成
TBDMS-双糖溴 37毫摩尔的N-Estra-OH溶解在100毫升的二氯甲烷中，然后加入44亳摩尔的TBDMS-双糖溴，300毫克的硫酸氢四丁基氨，25毫升20％的氢氧化钠溶液。回流条件下激烈搅拌24小时后，加入10毫摩尔氟化钾，搅拌过夜。加入300毫升的冷水到反应混合物中，然后加入300毫升的乙醚，再用各200毫升的水洗涤两次，有机层用无水硫酸镁干燥，过滤、蒸干，得固体产物，然后用乙醇和水重结晶，淡黄色固体(20克，产率79％)，熔点168-172。
1H-NMR(ppm，CD3Cl) 8.64(m，1H)，7.79(m，1H)，7.58(m，1H)，7.21(m，1H)，6.98(m，1H)，6.53(m，1H)，6.45(m，1H)，5.85(m，1H)，5.08(m，1H)，4.15(s，2H)，3.9-1.35(m，43H)； 13C-NMR(ppm，CD3Cl)156，154，148，136，134，132，127，123，121，113，111，107，106，78-26(25个碳)； 元素分析碳＝65.18％(理论值66.84％)，氢＝8.31％(理论值7.97％)，氮＝4.38％(理论值4.10％)。
实施例五 化合物的抗肿瘤效果 使用B6C3F1小鼠，预先饲养1周，将每只小鼠单独置于塑料笼中，保持23±1℃，在12小时亮-暗循环(早7点到晚7点亮环境，晚7点到第二天早7点暗环境)下饲养，小鼠自由摄取食物和水。人类乳腺肿瘤细胞(30-40毫克)被种植在乳腺脂肪区。抗肿瘤效果试验在种植肿瘤后第五天开始(肿瘤长大到约300毫克)。
化合物药物被配置成均匀混合物，溶剂为含3％的羟丙基纤维素和1.92％吐温80的生理盐水。不含药物的溶剂为空白，药物被注射使用，每周测定两次肿瘤的大小，以肿瘤长大到1克作为时间上的止点(或者用药后的第60天)。
试验每组5个小鼠，种植肿瘤时没有出现发病的现象。“2/5”表示5个小鼠有2个肿瘤消失，其它类推。结果显示，所有新合成的化合物，它们的抗肿瘤作用都优于紫杉醇。
实施例6化合物对肿瘤细胞氧化应激水平的影响 人类亲代肝肿瘤细胞(HepG2)在75平方厘米表面积的细胞培养皿内培养，培养基是DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Minimal Essential Medium)，添加10％的胎牛血清和1％的链霉素及青霉素。24小时、37℃、5％二氧化碳的环境下培养为单层细胞后，用pH＝7.4的磷酸盐缓冲液洗涤，然后移植到单孔培养板上，换新的培养基在相同条件下再培养24小时，使用合成化合物溶液作用于这些细胞24小时后，使用TBARS方法测定细胞的MDA含量。MDA是氧化应激水平指标物质。
结果显示，这类化合物有效影响肿瘤细胞的微观平衡，即氧化应激水平被调升很多，且氧化应激水平对变化和物质浓度成正比(正相关)。
权利要求
1.一种尾端含有糖类分子功能基团的有机化合物的用途，其特征在于，用于免疫标识肿瘤细胞以使哺乳动物体免疫系统发现；或用于制备治疗肿瘤的药物；
所述的糖类分子是单糖、或由单糖组合的双糖或多糖，所述的单糖是如式I或式II所示的结构
在式I中，M为CH2、或NH，在式II中，M为O、CH2、或NH。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的单糖是六碳碳糖、六碳氮糖、阿拉伯糖、阿拉伯碳糖、阿拉伯氮糖、木糖、木碳糖、或木氮糖。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述多糖由3、4、或5个单糖组成。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的有机化合物可以粘附在细胞表面。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的有机化合物是如下结构的化合物
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤包括颅脑、头颈、呼吸、循环、消化、泌尿、内分泌、生殖、骨骼，以及皮肤、软组织肿瘤等，如乳腺肿瘤、肝肿瘤、等等。
7.一种能使哺乳动物机体免疫系统发现肿瘤细胞的方法，其特征在于，对肿瘤癌症细胞进行免疫标识；所述的免疫标识是提供一种可以粘附在细胞表面、尾端含有糖类分子功能基团的有机化合物作为免疫标识物质。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的糖类分子是单糖、或由单糖组合的双糖或多糖，所述的单糖是如式I或式II所示的结构
在式I中，M为CH2、或NH，在式II中，M为O、CH2、或NH。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的单糖是六碳碳糖、六碳氮糖、阿拉伯糖、阿拉伯碳糖、阿拉伯氮糖、木糖、木碳糖、或木氮糖；所述多糖由3、4、或5个单糖组成。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的有机化合物是如下结构的化合物
全文摘要
本发明公开了有效清除肿瘤癌症细胞的化合物及相关方法，即一种全新的能使机体免疫系统发现并清除肿瘤癌症细胞的方法，可用于治疗和预防肿瘤癌症，具体的说，就是通过免疫标识肿瘤癌症细胞而使机体的免疫系统可以及时发现和清除肿瘤癌症细胞。用于免疫标识的物质是粘附在细胞表面的有机化合物(包括金属有机物)，这些有机化合物上链接有糖分子。
文档编号A61K31/7048GK101766616SQ20101000473
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月13日 优先权日2010年1月13日
发明者朱作霖, 孙萌, 叶红平 申请人:安徽辉克药业有限公司, 美国升阳制药公司