专利名称：凝结芽孢杆菌制备治疗炎症性肠病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌的药物新用途，具体涉及酪酸梭菌和凝结芽 孢杆菌单独或组合作为药物活性成份在制备治疗炎症性肠病，即溃疡性结肠炎和克罗恩病 药物中的应用，属于生物药领域。
背景技术：
炎症性肠病Gnflammatory bowel disease, IBD)是溃荡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’ s disease, CD)的统称，传统医学认为病因不明。溃疡 性结肠炎是一种非特异性的慢性结肠炎，病变主要局限于结肠的粘膜层和粘膜下层，表现 为炎症和溃疡，多先累及直肠和远端结肠，而后向近端扩展，以至遍及全结肠，临床表现为 持续或反复发作的粘液血便伴腹痛，可有不同程度的全身症状，如关节、皮肤、眼、口及肝胆 等肠外表现，病程越长癌变率越高。克罗恩病则是一种胃肠道的慢性、反复发作性和非特异 性的全肠壁炎，病变呈节段性分布，可发生于胃肠道的任何部位。由于溃疡性结肠炎和克罗 恩病的患病人数逐年增多，加之其病程的迁延，诊断、治疗的困难，已使本病引起医药行业 人士的广泛重视。但迄今为止，临床上炎症性肠病的防治仍颇为棘手，存在的问题较多，传 统的治疗并未获得突破性进展。IBD的传统治疗药物包括氨基水杨酸类、抗生素及皮质激 素等，因其疗效不高，不良反应较大使患者常不能耐受，导致在临床上应用存在一定的局限 性。应用免疫抑制剂如硫唑嘌呤(AZA)、6_巯基嘌呤(6-MP)、甲氨嘌呤(MTX)和环孢霉素等 能使多数IBD病人，特别是顽固性病例获得一定程度的临床缓解，然而这些免疫抑制剂仍 有毒性大、选择性差且有可能发生继发性感染及致畸等不足之处，故临床上应用仍不尽理 想。本发明的药物新用途在治疗炎症性肠病上取得重大突破，解决了传统治疗药物疗效差 和毒副作用大的难题，可作为治疗药物应用并能预防复发，社会意义巨大，特申请此发明专 利。
发明内容
传统医学认为，炎症性肠病的发病原因和发病机制仍不明确，对于发病原因人们 倾向于免疫学异常，各种发病假说也未得到充分的证实。但本发明人通过深入研究和分析 认为炎症性肠病的发病原因是长期的肠道菌群失调不能及时恢复，有益菌群的减少，造成 肠粘膜再生和代谢所需的酪酸、乳酸等短链脂肪酸合成不足，肠粘膜营养不良，此时，泛滥 的有害菌产生了胺、氨、喷哚等大量毒素，使虚弱的肠粘膜中毒、发炎，导致肠道免疫反应异 常，并引起过度的炎症反应，使肠粘膜，甚至整个肠壁损伤，溃疡和结节病样肉芽肿等形成， 具体的引发机制还有待于进一步深入研究，但目前的研究发现正常的肠道菌群对机体尤其肠道免疫机制的形成和免疫功能的平衡具有非常重要的影响作用，可以调节免疫使之处于 正常的水平。基于以上对炎症性肠病的发病认识，通过基础和临床研究发现和证实，用酪 酸梭菌和凝结芽孢杆菌单独或组合治疗炎症性肠病疗效显著，这主要由于酪酸梭菌和凝结 芽孢杆菌能分泌肠粘膜再生和修复所需的重要营养物质酪酸和乳酸，营养肠道，又可以从 恢复肠道菌群平衡等多个方面发挥作用，有别于目前的治疗药物，能有效的治疗溃疡性结 肠炎和克罗恩病，而且由于酪酸梭菌和凝结芽孢杆菌是益生菌，没有毒副作用，病人易于接 受。本发明人经深入的基础、临床研究和分析发现酪酸梭菌和凝结芽孢杆菌治疗溃疡 性结肠炎和克罗恩病的作用机理主要为以下几个方面1、抗炎和调节机体与粘膜免疫酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌能刺激肠粘膜增加分泌 性IgA等的分泌量，恢复和增强粘膜免疫功能，提高粘膜的抗病能力；能抗炎和调节异常过 度的免疫反应，使之恢复正常，消除异常炎症反应和免疫反应对肠壁及肠粘膜的损伤。从而 达到改善炎症或预防炎症复发的目的。2、肠道生物屏障是维持正常的肠道功能的重要屏障，炎症性肠病患者肠道菌群严 重失调，生物屏障严重破坏，进而导致肠粘膜结构、功能及肠道免疫的异常变化，酪酸梭菌、 凝结芽孢杆菌能定植在肠粘膜发炎部位拮抗有害菌，从而快速修复肠道生物屏障。3、酪酸梭菌和凝结芽孢杆菌能大量产生酪酸和乳酸等短链脂肪酸，这些短链脂肪 酸是肠粘膜上皮细胞的营养物质和能量来源，是修复炎症性肠病患者肠道粘膜溃疡的重要 物质。本发明所述酪酸梭菌选自但不限于酪酸梭菌(Clostridium butyricum)、CGMCC、 保存编号0313. 1。本发明所述凝结芽孢杆菌选自但不限于凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、 CGMCC、保存编号1207。本发明以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌为药物活性成份制成的制剂，可以是以酪酸梭 菌、凝结芽孢杆菌单独为药物活性成份分别制成相关剂型；也可以是酪酸梭菌与凝结芽孢 杆菌组合作为药物活性成份分别制成相关剂型。本发明所述的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌指活生物个体。本发明是以有效剂量的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作为药 物活性成份，按照一定的制剂工艺，加入常规的赋性剂、调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿 润齐 、黏合剂、溶剂、增稠剂、增溶剂等药物辅料，制成任何一种适合于临床上使用的剂型， 如片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液体制剂等口服剂型。本发明所指有效剂量是指以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌根据上面所述单独或组合作 为药物活性成份，即以酪酸梭菌；凝结芽孢杆菌；酪酸梭菌和凝结芽孢杆菌等组合分别为 药物活性成份制成的活菌制剂包含的总活菌数不能低于lX106CFU/g，一般在lX107CFU/g 以上，最高可达到1 X 1012CFU/g或1 X 1012CFU/g以上。本发明优选的制剂工艺为，先在液体培养基中接种菌种，进行培养或多级扩增培 养，然后将液态培养物离心，收集湿菌泥，并将所述菌泥干燥、粉碎，得到干燥菌粉。将所得 干燥菌粉与药用载体混合，制成最终剂型。由于本发明首次公开了以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌为药物活性成份在制备治疗溃疡性结肠炎和克罗恩病的药物中的应用，特别是在制备治疗溃疡性结肠炎的药物中的应 用，因此，以酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌单独或组合作为药物活性成份与辅料组合制成药剂， 只要是该药剂用于治疗溃疡性结肠炎或克罗恩病，均属于本发明的保护范围。本发明的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌在制成任何一种剂型时，均具有治疗溃疡性结 肠炎或克罗恩病的作用。任何药剂，如果其组份中含有酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌中的一种或 两种成份制备成药，在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示 具有治疗溃疡性结肠炎或克罗恩病的作用，则落入本发明的保护范围之内。本发明的酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌是益生菌。因此，也可以将酪酸梭菌、凝结芽孢 杆菌制成保健食品或保健药品。将酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌制成的保健食品或保健药品，如 果在其包装或说明书等标识上或者在其他任何宣传品上只要注明或提示具有治疗溃疡性 结肠炎或克罗恩病的作用，则落入本发明的保护范围之内。
具体实施例方式药物制备例说明以酪酸梭菌为药物活性成分制成胶囊剂为例，说明制备方法。酪 酸梭菌、凝结芽孢杆菌按上面所述单独或组合作为药物活性成份，制备方法同下，制备方法 不只局限以下的方法，公知的方法均可以。所配成的制剂含两种菌可分别发酵或混合发酵， 然后制成单一组份菌粉或混合组份菌粉，最后按常规方法制备成所需的剂型。药物制备实施例1、酪酸梭菌活菌菌粉制备取酪酸梭菌活菌菌种管一支，溶于已灭菌装有IOml生理盐水和玻璃珠的IOOml三 角瓶中，活化10分钟，用Iml无菌吸管吸取Iml菌悬液接种装有50ml扩增培养基的250ml 三角瓶中，置摇摆床内37°C恒温振荡(190rpm)培养M小时，转接装有450ml扩增培养基 2500ml档板三角瓶中，37°C恒温振荡培养M小时，镜检无杂菌后再转接于装有4. 5L扩增 培养基的种子罐中，厌氧培养(充气量3 1) M小时，镜检无杂菌后转接有45L发酵培养 基的发酵罐中，37°C厌氧培养M小时，镜检芽孢率达80%以上，停止培养。用连续离心机， 12000rpm离心。收集湿菌泥，称重，按1 1 (w/v)添加适量脱脂奶粉等保护剂后，干燥，粉 碎，常温保存备用。药物制备实施例2、酪酸梭菌活菌胶囊制备成份％ (重量)酪酸梭菌活菌菌粉20. 00份微晶纤维素40. 00份葡萄糖40. 00份将上述组份中1 3组中充分拌勻，然后利用常规灌装胶囊技术按单位剂量制成胶囊。基础实验例1、酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌对免疫性大鼠炎症性肠病的治疗作用1实验材料与方法1. 1实验动物雄性SD大鼠，180_220g，购自维通利华实验动物中心，清洁级，合格 证号为SCXP(京)0002)-0003。1. 2 实验药物美沙拉嗪(200mg/ml)；酪酸梭菌(CGMCC No. 0313. 1 株，IO8CFU/ ml)，凝结芽孢杆菌(CGMCC No. 1207株，108CFU/ml)由青岛东海药业有限公司提供。
1. 3实验试剂弗氏完全佐剂(sigma)，MTT (sigma)，伴刀豆素球蛋白(ConA) (Sigma)；脂多糖(LPS) (Sigma) ；MTT (Sigma)，购自北京舒伯伟化工仪器有限责任公 司；1640培养液(Gibco)；牛结肠粘膜蛋白冻干粉(自制)；IL-8ELISA试剂盒(BD)； TNF α ELISA试剂盒(Ebioscience)；大鼠IgG参考血清；兔抗大鼠IgG抗血清，外购。2实验方法2. 1牛结肠粘膜蛋白冻干粉的制备取新生小牛结肠，刮取牛结肠粘膜，反复冻溶法 获取牛结肠粘膜蛋白，纯化浓缩，真空冻干后于4°C保存备用。2. 2大鼠免疫性炎症性肠病模型的建立取牛结肠粘膜蛋白与完全弗氏佐剂 (1 1)制成完全抗原，选用体重在200士20g的SD大鼠，造模大鼠首次每只足跖内注射抗 原細8，于第10、17、24、31天分别于足跖、背部、腹股沟、腹腔内注射抗原6!^，最后1次注射 不加佐剂，至血清抗结肠抗体达到一定效价。第35天模型组大鼠用异戊巴比妥钠腹腔注射 麻醉，并分别进行下列处理(处理前禁食Mh)，先用2%的甲醛溶液1. 5mL灌肠，留置lh，用 生理盐水洗净后排去。再用抗原液(^ig/mL，不加佐剂)2mL灌肠，留置2h，然后洗净排去。 3d后，随机抽取2只模型组大鼠处死，取其结肠标本(肛门向上10厘米)，病理检查确认有 充血、水肿、炎细胞浸润、溃疡形成等一系列炎症性肠病的病理变化。2. 3动物分组及治疗设正常对照组(8只)。造模成功后，将造模大鼠随机分组，1) 模型对照组(10只)，给予生理盐水灌胃；2)阳性药(美沙拉嗪，200mg/ml)治疗组(10只)； 3)酪酸梭菌(108CFU/ml)治疗组(10只)；4)凝结芽孢杆菌(108CFU/ml)治疗组(10只)。 每次lml/100g 体重，1次/天，灌胃，连续给生理盐水或治疗药21天。期间每周称一次体 重，并持续观察动物一般情况及粪便性状。2. 4指标测定给生理盐水或药物至第21天后，断头处死动物，测定模型对照组和 3个治疗组结肠湿重指数、粘膜溃疡指数、粘膜损伤指数、肠系膜淋巴细胞转化率、IL-8、 TNF-α禾口 IgG等指标。2. 4. 1结肠湿重指数结肠湿重指数=结肠湿重(g)/100g.体重。2. 4. 2粘膜溃疡指数将新鲜结肠肠管纵行切开，清除肠内容物，将结肠中上段及结 肠下段两部分分别编号，固定在硬纸板上，新鲜标本拍照后，在10%的甲醛液中固定，用卡 尺测量结肠粘膜上细条索状或线形出血性病变，以全部病变总长度加以测量。溃疡指数的 计算病灶长度小于Imm为1分，l-2mm为两分，2_3mm为3分，3_4mm为4分，如病灶长度大 于4mm，将其分为若干段，每段按上法计分，当病灶宽度大于2mm时，其得分加倍。一只动物 全结肠各病灶得分的总和为其溃疡指数。2. 4. 3粘膜损伤指数将结肠段修成块，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片厚度5 μ m， HE染色，光镜检查，显微组织彩色照相，根据病变严重程度打分(轻度1分粘膜表面有少 量分泌物，粘膜下层轻微充血、水肿，少量炎性细胞浸润；中度2分粘膜表面有较多分泌 物，少量粘膜上皮脱落，粘膜下层明显充血、水肿，固有层大量炎性细胞浸润；重度3分粘 膜表面分泌物多，粘膜上皮脱落多，粘膜全层炎症，杯状细胞减少，出现溃疡病灶)，分别计 算每组每只动物直肠及结肠下端和结肠中上端的病变积分，得出平均数。2. 4. 4肠系膜淋巴细胞转化率无菌环境下取大鼠肠系膜淋巴细胞，过200目细胞 筛，无菌PBS洗涤两次，IOOOrpm, 5min。用完全1640培养液调整细胞浓度为5X IO5个/ml， 每孔100 μ 1，接种于96孔圆底细胞板中，同时加ConA (终浓度为3μ g/ml)或LPS (终浓度为5 μ g/ml)，100 μ 1/孔。另设定空白对照孔(未加诱导剂)，37°C、5% (X)2孵育72h，培养 结束前4h，加MTT (5mg/ml) 20 μ 1，培养结束后，测定540nm处测定OD值，计算淋巴细胞刺激 指数。淋巴细胞刺激指数(Si)=刺激组OD值/未刺激组OD值药物。2. 4. 5IL-8、TNF-α 和 IgG 断头处死大鼠，取血，4°C静置过夜，3000rpm，20min 离 心，取上清，分装，放于-20°C待测。使用ELISA试剂盒，按照说明书，测定大鼠血清中大鼠 IL-8及TNF-a的含量。使用单向免疫扩散法测定血清中IgG的含量。2. 5统计学处理各组间的数据差异的统计学显著性检验，用t-student't检验，差 异显著性界限为P <0. 05。3实验结果3. 1粪便性状、结肠湿重指数模型对照组大鼠在造型期间排白色粘液性软便。治疗组大鼠在治疗前也排白色粘 液性软便，治疗21天后均排正常便。美沙拉嗪治疗组、酪酸梭菌治疗组、凝结芽孢杆菌治疗组治疗21天后结肠湿重指 数与模型对照组的比较呈显著性降低(P < 0. 05)，3个治疗组大鼠治疗后结肠湿重指数比 较无显著性差异，见表1。表1免疫性炎症性肠病大鼠结肠湿重指数变化情况G士 S)
权利要求
1.凝结芽孢杆菌在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
2.凝结芽孢杆菌在制备治疗克罗恩病药物中的应用。
3.按权利要求1或2所述应用，其特征在于凝结芽孢杆菌包含凝结芽孢杆菌TBC169保 藏编号 CGMCC No. 1207。
4.按权利要求1或2所述应用，其特征在于将有效剂量的权利要求1或2所述的凝结 芽孢杆菌和药学上可接受的不同载体制成片剂、胶囊剂、散剂、口服液体制剂。
5.按权利要求4所述，其特征在于所述有效剂量是指制剂包含的总活菌数不能低于 lXl(fCFU/g。
6.按权利要求4所述，其特征在于所述有效剂量是指制剂包含的总活菌数优选 lXl(fCFU/g 及以上。
7.按权利要求4所述，其特征在于所述有效剂量是指制剂包含的总活菌数优选 lX1012CFU/g 及以上。
全文摘要
本发明公开了凝结芽孢杆菌的药物新用途，具体涉及凝结芽孢杆菌制备治疗炎症性肠病药物中的应用，炎症性肠病是指溃疡性结肠炎和克罗恩病，凝结芽孢杆菌选自但不限于凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、CGMCC、保存编号1207。凝结芽孢杆菌作为药物活性成份用于治疗克罗恩病疗效显著，属生物药领域。
文档编号A61P1/00GK102091099SQ20101000470
公开日2011年6月15日 申请日期2007年1月29日 优先权日2007年1月29日
发明者崔云龙 申请人:北京普尔康医药高科技有限公司, 青岛东海药业有限公司