专利名称：一种防治对虾白斑病的口服生物制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种口服生物制剂，特别是一种防治对虾白斑病的口服生物制剂。
背景技术：
对虫下白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV，对虫下白斑病)引起世 界范围内养殖对虾的急性、致死性传染病，造成对虾养殖业的巨大经济损失，在我国这种情 况尤为严重，已成为威胁我国对虾养殖业的主要疾病之一。1995年，国际兽疫局(0IE)、联 合国粮农组织(FA0)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为需要报告的水 生动物病毒性疫病之一。白斑综合征至今尚无有效的防治措施，是国际上试图通过攻关重 点解决的技术难题之一。 传统的早期预防主要针对病原体、虾体和环境三因素，从改善养殖环境、投喂免疫 增强剂提高对虾抵抗力、切断可能的传播途径等方面着手预防WSSV感染。近年来发现，无 脊椎动物同样具有获得性免疫系统(Kurtz&Franz，2003)，为基于对虾记忆性免疫的WSSV 防治的探索研究工作奠定了基础。利用已鉴定的病毒囊膜蛋白设计生物制剂是WSSV防治 的思路之一。Witteveldt et al. (2004)在大肠杆菌中分别构建了 WSSV囊膜蛋白VP19和 VP28重组菌，通过纯化注射和混合口服方式免疫健康对虫下，然后在免疫后不同时间通过浸 泡的方式进行感染，观测感染后对虾的死亡情况，发现VP19、 VP28都具有一定的免疫效果 和抗WSSV持久力，VP28的免疫效果更佳。以家蚕作为生物反应器生产WSSV囊膜蛋白VP19 和VP28，经口免疫动物模型克氏原螯!l!下(Procambarus clarkii)，攻毒后相对存活率分别可 达89. 5%和94. 7% (Xu et al. ，2006)。 Du et al. (2006)利用昆虫杆状病毒作为载体在 BmN昆虫细胞中表达VP28蛋白，对螯虾进行注射免疫保护效果可达92% 。囊膜蛋白VP19、 VP28在毕赤酵母中表达后将工程菌直接口服免疫螯虾，其相对死亡率也得到一定程度的降 低，同时以工程菌经口免疫在生产实际中具有一定的可行性(Jha et al. ，2007)。由此， WSSV囊膜蛋白的保护效果比较理想，尤其以VP28设计的重组生物制剂效果最佳。
然而在规模化养殖水环境下，重组蛋白保护效果却不尽人意，尤其通过口服途径， 抗原在消化道降解、吸收率低等原因造成保护剂量的不足。 近年来，枯草芽孢杆菌逐渐用于药用蛋白、抗原蛋白的生产，其优势体现为1)高 分泌能力，使得重组表达的药用蛋白不需要经过下游的纯化和分离，也使得分泌的抗原蛋 白能有效递呈至宿主的免疫系统引起免疫应答；2)将抗原蛋白展示于芽孢外表面，可作为 口服疫苗的应用；3)芽孢耐热、耐酸及耐盐的特性，能耐受胃肠道环境且更利于保存；4)快 速、简捷的发酵和生产技术；5)本身为益生菌，若作为疫苗载体可起到佐剂的作用。
VP28重组枯草芽孢杆菌的制备方法在Ling Lin Fu， Wei Fen Li, Hua Hua Du， Wei Dai， Zi Rong Xu. Oral vaccination with envelope protein VP28 against white spot syndromevirus in Procambarus clarkii using Bacillus subtilis as delivery vehicles. LettA卯l Microbiol. 2008,46(5) :581-586 (傅玲琳，对虫下白斑综合征病毒囊膜 蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究.浙江大学博士论文，2008)被公开。 壳聚糖也有相关文章告知其有防治对虾白斑病的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种使用安全且能有效防治对虾白斑综合征的 口服生物制剂。 为了解决上述技术问题，本发明提供一种防治对虾白斑病的口服生物制剂，该制 剂的组分和重量含量为1 10%表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和5 50%壳聚糖，其余 为作为载体的玉米淀粉。 作为本发明的防治对虾白斑病的口服生物制剂的改进表达VP28的重组枯草芽 孢杆菌的菌含量为109个/克。在本发明中，表达VP28的重组枯草芽孢杆菌可按照Ling Lin Fu,Wei Fen Li,Hua HuaDu， Wei Dai， Zi Rong Xu. Oral vaccination with envelope protein VP28 against whitespot syndrome virus in Procambarus clarkii using Bacillus subtilis as deliveryvehicles. Lett A卯l Microbiol. 2008， 46 (5) :581-586 (傅玲琳，对虫下白斑综合征 病毒囊膜蛋白VP28枯草工程菌的构建与VP28卵黄抗体的制备及其抗病性研究.浙江大学 博士论文，2008)进行制备；也可向本发明的申请人一浙江大学索取。壳聚糖和玉米淀粉 均能通过市购的方式获得；其中壳聚糖可选用饲料级壳聚糖，玉米淀粉能过80-200目筛。
本发明的防治对虾白斑病的口服生物制剂的保藏条件为室温，有效期为2年。
本发明的防治对虾白斑病的口服生物制剂实际使用时，按照占对虾饵料总重的 0. 1% 1%的比例加入对虫下佴料中，均匀混合后即可喂食对虫下。
本发明的口服生物制剂具有以下优点
1)使用方便，可作为饲料添加剂在对虾饲料中使用；
2)安全性好、无副作用； 3)防治效果好，显著提高对虾免疫力和成活率；充分发挥了表达VP28的重组枯草 芽孢杆菌和壳聚糖的协同防治作用；
4)生产工艺简单、成本低、易贮存。
具体实施例方式
下面的实施例有助于本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制 本发明。 以下％均为重量％。 实施例1、一种防治对虾白斑病的口服生物制剂，其由5X的表达VP28的重组枯草 芽孢杆菌、25%的壳聚糖和70%的玉米淀粉(过80-200目筛)组成。表达VP28的重组枯 草芽孢杆菌的菌含量为109个/克。 制备方法为将上述3种成分简单加以搅拌混合即可。 实验1、南美白对虾养殖于25± rC控温的水泥池中，随机分成4大组，每组3个重 复，每个重复20只，暂养一周。日投喂量均为对虾体重的2 % 。 在常规的对虾饲料中添加占对虾饲料总重0.5%的防治对虾白斑病的口服生物制剂(实施例1所得)喂食南美白对虾，连续喂料30天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为试 验组。 在常规的对虾饲料中添加占对虾饲料总重0. 15%的表达VP28的重组枯草芽孢杆 菌(其有效用量同试验组中的表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和壳聚糖的用量之和)喂食 南美白对虾，连续喂料30天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为对比组1 ;
在常规的对虫下饲料中添加占对虫下饲料总重O. 15%的壳聚糖(其有效用量同试验 组中的表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和壳聚糖的用量之和)喂食南美白对虫下，连续喂料30 天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为对比组2 ; 用常规的对虾饲料喂食南美白对虾33天，作为空白对照组。 33天后，将试验组、对比组1、对比组2和空白对照组分别用对虾白斑综合征病毒 (WSSV) (100倍50%致死量的WSSV)浸泡攻毒，攻毒后连续观察10天，记录死虫下数，并用PCR 检测病毒。结果如下 试验组对虫下成活率高达96. 7% ，对比组1对虫下成活率达75. 0% ，对比组2对虫下成 活率达25. 0%，而空白对照组的对虾成活率仅为16. 7%。对存活的虾采用PCR检测病毒， 结果为试验组和对比组l PCR检测病毒均为阴性，而对比组2和空白对照组PCR检测病毒 均为阳性。 实施例2、一种防治对虾白斑病的口服生物制剂，其由10%的表达VP28的重组枯 草芽孢杆菌、50%的壳聚糖和40%的玉米淀粉(过80-200目筛)组成。表达VP28的重组 枯草芽孢杆菌的菌含量为109个/克。
实验2、 在常规的对虫下饲料中添加占对虫下饲料总重0. 1 %的防治对虫下白斑病的口服生物制 剂(实施例2所得)喂食南美白对虾，连续喂料30天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为试 验组。 在常规的对虾饲料中添加占对虾饲料总重0. 06%的表达VP28的重组枯草芽孢杆 菌(其有效用量同试验组中的表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和壳聚糖的用量之和)喂食 南美白对虾，连续喂料30天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为对比组1 ;
在常规的对虫下饲料中添加占对虫下饲料总重0.06%的壳聚糖(其有效用量同试验 组中的表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和壳聚糖的用量之和)喂食南美白对虫下，连续喂料30 天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为对比组2 ; 用常规的对虾饲料喂食南美白对虾33天，作为空白对照组。
其余内容同实验l。结果如下 试验组对虫下成活率高达95. 0% ，对比组1对虫下成活率为70. 0% ，对比组2对虫下成 活率为18. 3%，而空白对照组的对虾成活率仅为15. 0%。对存活的虾采用PCR检测病毒， 结果为试验组和对比组l的PCR检测病毒均为阴性，而对比组2和空白对照组PCR检测病 毒均为阳性。 实施例3、一种防治对虾白斑病的口服生物制剂，其由1X的表达VP28的重组枯草 芽孢杆菌、5%的壳聚糖和94%的玉米淀粉(过80-200目筛)组成。表达VP28的重组枯草 芽孢杆菌的菌含量为109个/克。
实验3、
5
在常规的对虫下饲料中添加占对虫下饲料总重1 %的防治对虫下白斑病的口服生物制剂 (实施例3所得)喂食南美白对虾，连续喂料30天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为试验组。 在常规的对虾饲料中添加占对虾饲料总重0. 06%的表达VP28的重组枯草芽孢杆 菌(其有效用量同试验组中的表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和壳聚糖的用量之和)喂食 南美白对虾，连续喂料30天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为对比组1 ;
在常规的对虫下饲料中添加占对虫下饲料总重0.06%的壳聚糖(其有效用量同试验 组中的表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和壳聚糖的用量之和)喂食南美白对虫下，连续喂料30 天，再用常规对虾饲料喂食3天；作为对比组2 ; 用常规的对虾饲料喂食南美白对虾33天，作为空白对照组。
其余内容同实验l。结果如下 试验组对虫下成活率高达93. 3% ，对比组1对虫下成活率为71.7%，对比组2对虫下成 活率为16. 7%，而对照组的对虾成活率仅为13. 3%。对存活的虾采用PCR检测病毒，结果 为试验组和对比组l PCR检测病毒均为阴性，而对比组2和空白对照组PCR检测病毒均为 阳性。 以上结果说明，本发明的口服生物制剂是一种防对虾白斑病效果好、使用安全且 方便的生物制剂。 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种防治对虾白斑病的口服生物制剂，其特征是该制剂的组分和重量含量为1～10％表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和5～50％壳聚糖，其余为作为载体的玉米淀粉。
2. 根据权利要求1所述的防治对虾白斑病的口服生物制剂，其特征是所述表达VP28 的重组枯草芽孢杆菌的菌含量为109个/克。
全文摘要
本发明公开了一种防治对虾白斑病的口服生物制剂，该制剂的组分和重量含量为1～10％表达VP28的重组枯草芽孢杆菌和5～50％壳聚糖，其余为作为载体的玉米淀粉。该制剂使用安全，且能有效防治对虾白斑综合症。
文档编号A61P31/20GK101773672SQ201010130589
公开日2010年7月14日 申请日期2010年3月23日 优先权日2010年3月23日
发明者傅玲琳, 周绪霞, 李卫芬, 林志伟, 沈文英 申请人:浙江大学;绍兴文理学院